

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN TUẤN ĐẠT
ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA CAO CHIẾT TÔ MỘC
(CAESALPINIA SAPPAN L.) ĐỐI VỚI VI KHUẨN ESCHERICHIA
COLI GÂY BỆNH TRÊN GÀ LƯƠNG PHƯỢNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, 2015




LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và
kết quả được nêu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ
một công trình nào khác.

Người cam đoan Nguyễn Tuấn Đạt 
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii

LỜI CẢM ƠN

Khi hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn:
Gia đình và quý thầy cô đã dành nhiều thời gian động viên và giúp đỡ tôi
hoàn thành ước mơ được học hỏi của tôi.
Thầy TS. Nguyễn Bá Tiếp đã dành nhiều thời gian, tận tình hướng dẫn tôi
trong suốt thời gian thực tập nghiên cứu để hoàn thành luận văn này.
Cô PGS. TS. Lâm Thị Thu Hương đã truyền đạt nhưng kiến thức, kinh
nghiệm quí báu tạo cơ sở giúp tôi tiến hành phát tri
ển nghiên cứu và hoàn thiện luận
văn này.
Quý thầy cô giáo Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, Khoa Thú Y, Phòng
Đào tạo Sau đại học, ban giám hiệu học viện đã tận tình giảng dạy và tạo điều kiện

Danh mục ảnh vii
Danh mục sơ đồ, hình viii
LỜI MỞ ĐẦU 1
1 Đặt vấn đề 1
2 Mục tiêu và yêu vầu 1
2.1 Mục tiêu 1
2.2 Yêu cầu 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2
1.1 Giới thiệu cây Tô mộc 2
1.1.1 Mô tả cây 2
1.1.2 Phân bố, thu hái và chế biế
n 3
1.1.3 Mô tả dược liệu 3
1.1.4 Thành phần hóa học 3
1.1.5 Tác dụng dược lý 5
1.1.6 Công dụng 6
1.1.7 Một số nghiên cứu về hoạt tính của chất chiết Tô mộc 7
1.2 Các phương pháp chiết xuất dược liệu 8
1.3 Một số phương pháp đánh giá kháng sinh của thảo dược 9
1.3.1 Phương pháp thử vi sinh vật 9
1.3.2 Phương pháp thử trên động vật 12
1.4 Sơ lược v
ề vi khuẩn E. coli 13
1.4.1 Đại cương 13
1.4.2 Đặc điểm sinh học 13
1.4.3 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố 15
1.4.4 Truyền nhiễm học 17

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv


2 Đề nghị 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

E. coli : Escherichia coli
IB : Infectious Bronchitis
MHA : Mueller – Hinton Agar
EMB : Eosin Methylen Blue
MCK : MacConkey
KIA : Kligler Iron Agar
BGA : Brilliant green agar
BHI : Bran Heart Infusion Broth
NB : Nutrient Broth
NA : Nutrient Aga
ATCC : American Type Culture Collection
MIC : Minimum Inhibitory Concentration
MeOH : Methanol
EtOH : Ethanol




3.8 Tỷ lệ gà chết do E. coli sau 7 ngày gây bệnh 45




Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii

DANH MỤC ẢNH

STT TÊN ẢNH TRANG
1.1 Quả của cây Tô mộc 2
1.2 Dược liệu Tô Mộc 3
1.3 Cấu trúc của Brasilin 4
1.4 Trực khuẩn E.coli bắt màu Gram (-) với độ phóng đại 1000 lần 14
3.1 Mẫu cao tô mộc 31
3.2 Mẫu chai bảo quản sản phẩm 32
3.3 Đường kính vòng vô khuẩn của cao chiết Tô mộc trên vi khuẩn E. coli
chuẩn (ATCC 25922) 35
3.4 Màng bao tim dày đục ở gà bệnh lô đối chứng dương 40
3.5 Xoang bao tim tích dịch vàng và viêm màng bao tim (lô gây bệnh thực
nghi
ệm sau khi sử dụng chế phẩm) 44 
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii

DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH

Sơ đồ 2.1 Qui trình phân lập vi khuẩn E. coli 23

Y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
với sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Bá Tiếp
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “
ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA
CAO CHIẾT TÔ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.) ĐỐI VỚI VI KHUẨN
ESCHERICHIA COLI GÂY BỆNH TRÊN GÀ LƯƠNG PHƯỢNG
".
2. Mục tiêu và yêu vầu
2.1. Mục tiêu
Đánh giá hiệu lực kháng khuẩn của cao chiết xuất từ dược liệu Tô mộc trên
vi khuẩ
n E. coli trong phòng thí nghiệm và trên giống gà Lương Phương được gây
bệnh với vi khuẩn E. coli.
2.2. Yêu cầu
Hoàn thành chế phẩm chứa 10% cao chiết từ gổ lỏi của dược liệu tô mộc.
Bố trí thí nghiệm thử kháng sinh đồ trong phòng thí nghiệm.
Bố trí thí nghiệm phòng và trị bệnh doE. coli trên gà.


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu cây Tô mộc
Cây Caesalpinia sappan (Cs) được gọi là Tô mộc có nhiều ở một số tỉnh
miền núi nước ta, gỗ thân cây có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, tiêu viêm, và
sử dụng để điều trị một số bệnh như bệnh thấp khớp, viêm v.v… và cũng ñược dùng
làm chất chỉ thị màu.
Cây Tô mộc còn có tên là cây Gỗ vang, cây Vang nhuộm, cây Tô phượng

đỏ nâu, có vết dao đẻo và vết cành, thường có khe nứt dọc.Mặt cắt ngang hơi bóng,
vòng tuổi thấy rõ rệt (màu da cam), có thể thấy màu nâu tối, có các lỗ nhỏ (mạch
gỗ). Dễ tách thành từng mảnh theo thớ gỗ, tủy có lỗ rõ. Các thanh
được chẽ nhỏ có
màu hồng đỏ, có thể có những chỗ có màu nhạt hay đậm hơn.Chất gỗ cứng, nặng,
không mùi, vị hơi se (Dược Điển Việt Nam IV, 2009).

Ảnh1.2: Dược liệu Tô Mộc
1.1.4. Thành phần hóa học
Theo một số tài liệu các hợp chất trong cây Tô mộc có thể là: brazilin,
brazilein, hematein, hematoxylin, brazilide A, protosapponin A, protosapponin A,
tinh dầu chứa D(-) phelladren, ocimen, tanic acid, gallic acid và saponin. Trong đó

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4

hàm lượng chính là các hợp chất màu tự nhiên: hematein, hematoxylin, brazilin,
brazilein. Các hợp chất màu này chỉ thu được từ tự nhiên, như từ cây gỗ Tô mộc
hay Huyết mộc chứ hầu như không thể tổng hợp được trong công nghiệp. Chúng
được chiết từ cây gỗ vang bằng các dung môi phân cực như CH
3
OH, C
2
H
5
OH,
C
4
H
9
OH và H

1 6.9
11.5
16.7
C
16
H
12
O
4

(M= 268)

7-hydroxy-3-(4-hydroxybenzylidene)-
4chromanone
24,47

2 9.2
15.7
C
16
H
14
O
5

(M=286)
Brazilin hoặc:3,7-Dihydroxy-3-(4-
hydroxy benzyl)-4-chromanone-(R)
14,87
3 10.2 M=321 Chưa định danh 10,92

Shigella sonnei (0,2cm), Shigella dysenteria shiga (1cm), và Bacillus subtilis (1cm).
Tác dụng kháng sinh này không mất đi dưới tác dụng của dịch vị và dịch t
ụy.
Theo Gabor (1951) (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2005), brasilein có tác dụng
kháng histamin. Nếu tiêm trước brasilein vào xoang phúc mạc chuột bạch có thể đề
phòng hiện tượng thay đổi ở mắt chuột bạch do tiêm dung dịch 1,5% histamin
chlohydrat.
Theo Gabor và cs (1952) (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2005), brasilin và
brasilein đều có tác dụng làm mạnh và kéo dài tác dụng của hormon thượng thận
đối với mẫu ruột cô lập của chuột bạch hoặc tử cung cô lập của thỏ và đố
i với huyết
áp của thỏ.
Năm 1952, Gabor và cs nghiên cứu cho thấy brasilin và brasilein có tác dụng
ức chế men histidin decarboxylase(trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2005).
Tù Tá Hạ và Diêm Ứng Bổng (Trung Hoa y học tạp chí, 1994 – 1996 trích
dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2005) nghiên cứu toàn diện áp dụng dược lý của Tô mộc đã đi
đến kết luận sau:
Với liều lượng thích hợp, Tô mộc có tác dụng làm tăng co bóp tim ếch cô
lậ
p. Áp lực tim ban đầu càng yếu, tác dụng càng rõ.
Nước Tô mộc làm giản mạch máu ếch (phương pháp Treudenberg). Nếu bắt
đầu dùng nước Tô mộc trước rồi mới dùng muối nitrit thì tác dụng giãn mạch của
muối nitrit sẽ không xuất hiện nữa.
Nước Tô mộc không ảnh hưởng đến hô hấp và huyết áp của chó bị gây mê.
Nếu phối hợp với histamin hoặc hormon thượng thận, Tô mộc không thấy có tác
dụng hiệp đồ
ng.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6


1.1.6. Công dụng
Tính vị theo đông y: vị ngọt, bình, không độc, vào 3 kinh tâm, can và tì. Có
tác dụng hoạt huyết, thông kinh hoạt lạc, khứ ứ, chỉ thống, tán phong hòa huyết.
Tô mộc còn được dùng làm thuốc săn da và cầm máu dùng trong các trường
hợp xuất huyết tử cung, đẻ mà mất máu sau sinh, choáng váng, hoa mắt.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7

Còn dùng chữa lỵ ra máu, chảy máu trong ruột.
Tô mộc còn được dùng như chất giải khát (Đỗ Tất Lợi, 2005).
1.1.7. Một số nghiên cứu về hoạt tính của chất chiết Tô mộc
Phòng đông y thực nghiệm Viện vi trùng Việt Nam (1961) đã nghiên cứu
thấy nước sắc Tô mộc có tác dụng kháng sinh mạnh đối với Staphylococcus 209P
(vòng vô khuẩn 1,2 cm), Salmonella typhi (0,4 cm), Shiga flexneri (0,7 cm),
Shigella sonnei (0,2cm), Shigella dysenteria shiga (1,0 cm), Bacillus subtilis (1,0
cm) (Đỗ Tất Lợi, 2005).
Nguyễ
n Minh Thắng (2009) thăm dò khả năng kháng khuẩn của mẫu gỗ lên
hai loài vi khuẩn S. aureus và P. aeruginosa, kết quả cho thấy dịch chiết mẫu vỏ hạt
chín có khả năng kháng mạnh hai loài này. Các dịch chiết mẫu gỗ ở nồng độ cao
cũng kháng cả hai loài.
Phạm Tất Thắng và Lã Văn Kính (2004) xác định 100% E. colivà 100%
Salmonella gây bệnh tiêu chảy trên heo nhạy cảm với chất chiết từ Tô mộc khi kết
hợp với berberin và palmatin (chất chiết từ một số cây dược liệu khác).
Nguyễn Quang Tính (2011) bào chế thành công sản phẩm PTLC từ cao chiết
của Tô Mộc và Mộc hương và xác định hiệu phòng trị bệnh tiêu chảy do E. colivà
Salmonella gây bênh trên heo.
Đào Hùng Cường và Giang Thị Kim Liên (2008) đã thành công trong việc
Nghiên cứu xác định thành phần hóa học của dịch chiết từ Tô mộc (gỗ Vang) ở
Quảng Nam.

Srinivasan và cộng sự (2012), nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của
chấ
t chiết Tô mộc bằng Ethanol và dầu khoáng (Petrolium), đã xác định chất
chiết Tô mộc bằng Ethanol có vòng kháng khuẩn là 34,0±2,7 mm đối với
Pseudomonas aeruginosa và vòng kháng khuẩn là 6,0±0,3 mm trên E. coli khi
chiết bằng dầu khoáng.

1.2 Các phương pháp chiết xuất dược liệu
¾ Căn cứ vào nhiệt độ, có các phương pháp chiết:
+ Chiết nóng.
+ Chiết nguội (ở nhiệt độ thường).
¾ Căn cứa vào chế độ làm việc có các phương pháp chiết:
+ Gián đoạn.
+ Bán liên tục.
+ Liên tục.
¾ Dựa vào chiều chuyển động tương hỗ giữa hai pha, có các phương
pháp chiết:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9

+ Ngược dòng.
+ Xuôi dòng.
+ Chéo dòng.
¾ Dựa vào áp suất làm việc, có các phương pháp chiết:
+ Áp suất thường (áp suất khí quyển).
+ Áp suất giảm (áp suất chân không).
+ Áp suất cao (làm việc có áp lực).
¾ Dựa vào trạng thái làm việc của hai pha, có các phương pháp chiết:
+ Ngâm.
+ Ngấm kiệt.

triển của vi sinh vật tạo ra một vòng ức chế hoàn toàn xung quanh nơi chứa (ống
trụ, lỗ thạch) dung dịch kháng sinh.
Môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA) để thử kháng sinh đồ được đổ vào
đĩa petri vô trùng, đường kính 9 cm, độ dày thạch khoảng 4 mm (25 ml/đĩ
a). Sau
khi đổ môi trường được bảo quản ở nhiệt độ từ 4
o
C đến 8
o
C. Trước khi làm kháng
sinh đồ, môi trường phải được lấy ra và để ở nhiệt độ phòng 15 phút và làm khô bề
mặt trong tủ ấm.
Từ dung dịch giữ gốc, vi khuẩn được cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa
NA. Sau khi cấy, ủ ở nhiệt độ 37
o
C trong 16 – 20 giờ, chọn 3 khuẩn lạc có kích
thước đồng đều trên đĩa NA cho vào ống nghiệm vô trùng có chứa 3 ml nước sinh
lý vô trùng, lắc đều bằng vortex. Sau đó đo độ đục với ống Mc Farland 0,5 trên nền
tờ giấy trắng có vạch đen và điều chỉnh với nước muối sinh lý (nếu cần). Với độ đục
này, nồng độ vi khuẩn tương đương 1 – 3x10
8
tế bào/ml.
Dàn đều huyễn dịch vi khuẩn trên đĩa môi trường bằng cách dùng que tăm
bông vô trùng nhúng vào ống huyễn dịch vừa chuẩn bị. Sau đó rút tăm bông lên và
ép nhẹ tăm bông vào thành ống nghiệm để tăm bông không quá ướt, phết đều vi
khuẩn trên đĩa môi trường MHA theo 3 hướng chéo nhau 60
o
để dàn đều vi khuẩn.
Sau khi dàn đều vi khuẩn, để đĩa khoảng 5 phút rồi dùng kẹp vô trùng đặt đĩa
giấy tẩm cao chiết và đĩa giấy tẩm kháng sinh lên bề mặt môi trường. Ấn nhẹ đĩa

2
, tạo CO
2
bằng cách cho đĩa thạch vào một
bình thủy tinh lớn, đốt nến, đậy nắp thật kín).
Ngày 2:
Pha loãng 0,1 ml (100 ml) canh khuẩn non (đậm độ tương đương 1-1,5 x
10
8
vi khuẩn ml) trong 9,9 ml canh thang MH (pha loãng 100 lần để có đậm độ
tương đương 1-1,5 x 10
6
vi khuẩn/ml), chia 1,8 ml vào các ống nghiệm đường
kính 12 mm. Nếu nuôi cấy qua đêm bằng môi trường thạch, lấy vi khuẩn thuần
khiết từ môi trường thạch thích hợp hoà vào 3 ml dung dịch đệm PBS (hoặc
nước cất) để có độ đục bằng độ đục của ống Mc Farland 0,5 – tương đương 1 – 3
x10
8
vi khuẩn/ml, sau đó lại pha loãng 1/100 trong canh thang MH và chia vào
các ống nghiệm như trên.
Thêm 0,2 ml nước cất hoặc nước muối sinh lý vô trùng vào 1 ống
nghiệm (chứng âm).
Thêm 0,2 ml kháng sinh đã pha theo bảng pha các đậm độ kháng sinh ở trên
vào mỗi ống nghiệm, phân phối từ nồng độ kháng sinh thấp nhất đến nồng độ kháng
sinh cao nhất. Lắc kỹ từng ống nghiệm.
Đặt vào tủ ấm 37
o
C/18 giờ.
Ngày 3.
Lắc kỹ từng ống nghiệm trước khi đọc kết quả.

Hoạt lực kháng sinh được thể hiện bằng khả năng không mắc bệnh hoặc khỏ
i
bệnh của động vật sau khi sử dụng kháng sinh và công cường độc bằng một hay
một số vi khuẩn có độc lực.
Các loài động vật thường sử dụng là: chuột bạch, thỏ, gà, heo… 
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13

1.4 Sơ lược về vi khuẩn E. coli
1.4.1 Đại cương
Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) thuộc:
Lớp: Schgzomycetes
Bộ: Eubacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Tộc: Escherichiae
Giống: Escherichia
Loài: Escherichia coli
Escherichia coli được gọi tắt là E. coli còn có tên là Bacterium coli commue
được Escherich phát hiện năm 1883.
E. coli là trực khuẩn ruột già, vi khuẩn này có mặt thường xuyên trong
ruột của động vật, ở phần cuối của ruột non hay ruộ
t già, ít khi ở dạ dày hay
phần trước của ruột non của các loài động vật như: ngựa, bò, dê, lợn, chó, mèo,
gia cầm và người.
Ngoài tự nhiên E. coli tồn tại vài tuần đến vài tháng trong bụi phân, nước,
không khí.
Những thú non có cảm nhiễm đặc biệt với vi khuẩn E. coli(Nguyễn Vĩnh
Phước, 1977).

S;môi trường Brilliant green agar (BGA),
khuẩn lạc E. coli tạo khóm khuẩn lạc màu vàng phớt xanh.
1.4.2.3 Đặc tính sinh hoá
E. coli lên men sinh hơi: glucose, lactose, manitol, galactose…; lên men
không sinh hơi: maltose, arabinose; lên men hay không lên men: saccharose; không
lên men: dextrin, glycogen, salisin amidon, ít khi có lên men: inulin, pectin; phản
ứng IMViC: ++ (indol
+
, methylred
+
, vogesproskauer
-
, citrate
-
).
1.4.2.4 Sức đề kháng
E. coli bị diệt ở nhiệt độ 55
o
C/1 giờ, 60
o
C/15-30 phút, 95% bị diệt ở nhiệt độ
đông lạnh trong 2 giờ.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 15

Có thể sống ở điều kiện ngoại cảnh từ vài tuần đến 1 tháng, chủng độc có thể
tồn tại 4 tháng.
Bị diệt bởi các chất sát trùng thông thường: acid fenic, HgCl2, Có khả năng
chịu đựng được các yếu tố lý hoá cao hơn các vi khuẩn khác như Salmonella,
Shigella (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).

được khả năng ngưng kết và kết tủa với kháng nguyên L, kháng nguyên này thường
thấy trong E. coli gây bệnh đường.
Type L: không chịu nhiệt, bị huỷ ở 100
o
C trong 1 giờ, mất khả năng ngưng
kết, kết và tính kháng nguyên.