30

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KHẢO SÁT LƢỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát lượng nhựa ở ba loại quả (quả non, quả già
xanh, quả gần chín) ở trên cùng một loài và cùng một phương pháp làm khô. Kết
quả được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Hàm lƣợng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau.
Loại quả
Khối lượng
quả (g)
Khối lượng nhựa
lấy (g)
Tỉ lệ nhựa
thô trên
quả (%)
Quả non (dưới 40 ngày tuổi) 120 0.2576 0.21
Quả già xanh (50-100 ngày tuổi) 580 1.5153 0.26
Quả gần chín (100-120 ngày tuổi) 1700 3.0292 0.18
Nhận xét: lượng papain thô thu được ở quả già xanh cao hơn so với quả non
và quả gần chín đồng thời chiếm hàm lượng khá cao. Qua kết quả này, chúng tôi
nhận thấy thời gian thích hợp để thu nhận nhựa thô là khi quả đu đủ được 50 – 100
ngày tuổi.
3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƢƠI
Nhựa tươi được làm khô ngay, ở nhiệt độ nhỏ hơn 50
o
C bằng các phương
pháp khác nhau. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2

32

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 1 – thang protein chuẩn
2 – nhựa đu đủ non đông khô sơ chế bằng etanol
Nhận xét: quá trình sơ chế bằng dung môi còn lẫn khá nhiều protein tạp, do
đó chúng tôi tiến hành qui trình tinh chế với các phân đoạn khác nhau để tinh sạch
protein. Đồng thời, chúng ta cũng dễ dàng nhận thấy rằng trong vạch điện di của
nhựa đu đủ non không có xuất hiện enzyme papain do đó chúng tôi tiến hành lấy
nhựa trên trái trưởng thành để thu nhận papain. Điều này hoàn toàn phù hợp với các
nghiên cứu trước đây về enzyme trong nhựa đu đủ: enzyme papain chỉ hình thành
trong giai đoạn trưởng thành của trái.
Tinh chế:
Tiến hành tinh chế papain từ nhựa đông khô theo phương pháp đã trình bày
trong phần thực nghiệm, từ 90 gam nhựa khô ban đầu chúng tôi thu được 1g papain.
Kết quả điện di được trình bày trong hình 3.1b: Hình 3.1 b. Điện di đồ của chế phẩm Merk và papain tinh chế từ
nhựa đu đủ đông khô.
1- Thang protein chuẩn
2- Chế phẩm Merck
3 - papain
33

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

(mg/g)
với x: là nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng (mg/ml).
n: hệ số pha loãng
m: khối lượng nguyên liệu lấy phân tích (g)
3.5 PHƢƠNG PHÁP ANSON XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE
Kết quả đo mật độ quang ∆OD ở bước sóng 720nm của các ống nghiệm có
lượng tyrosin tương ứng từ 0.2 – 1.0M được trình bày trong bảng 3.4 (phụ lục 2)
Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bƣớc sóng 720nm
Mẫu 02 03 04 05 06
Lượng tyrosin tương ứng (M)
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Độ hấp thu quang OD(AU)
0.1059 0.1812 0.3138 0.3464 0.4688
Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TT). Vẽ
đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và biến thiên độ hấp thu
quang ở bước sóng 720nm như hình 3.3 với phương trình đường chuẩn là y =
0.4454x + 0.016.
Đường chuẩn Anson
y = 0.4454x + 0.016
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45

m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g)
L: độ pha loãng mẫu enzyme.
M Tyrosin: lượng M Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn.
3.6 KHẢO SÁT LƢỢNG ENZYME THU ĐƢỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN
TINH CHẾ.
Trong quá trình tinh chế enzyme chúng tôi tiến hành khảo sát lượng protein
thu được sau mỗi phân đoạn bằng cách lấy ra 0,1g dung dịch enzyme, sau đó định
mức thành100ml bằng nước cất để xác định hàm lượng protein theo phương pháp
Lowry. Kết quả được trình bày trong bảng 3.5 với cách tính như sau:
Thế giá trị mật độ quang ∆OD ở mỗi phân đoạn vào phương trình đường
chuẩn xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry là y = 0.0007x –
0.0004 ta suy ra được nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng là x. Sau đó, áp
dụng công thức

m
nx
M
*001.0*

(mg/g)
với x: là nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng (mg/ml).
n: hệ số pha loãng
m: khối lượng nguyên liệu lấy phân tích (g)
36

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM để tính lượng protein trong nguyên liệu là M (mg/g).
Bảng 3.5. Lƣợng protein thu đƣợc ở các phân đoạn tinh chế khác

199.14 4
Phân đoạn tủa với ammonium sulfat 0.129
184.86 5
Phân đoạn bằng NaCl 0.125
179.14 6
Phân đoạn kết tinh 0.123
174.86 7
Phân đoạn tái kết tinh 0.113
162.00 8
37

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH
CHẾ
Trong quá trình tinh chế enzyme ngoài việc khảo sát lượng protein thu được
sau mỗi phân đoạn, chúng tôi cũng tiến hành đồng thời việc khảo sát hoạt tính
protein ở mỗi giai đoạn tinh chế với cách thực hiện như sau:
Cân 0.1g mẫu protein ở mỗi giai đoạn tinh chế định mức thành 100ml dung
dịch bằng nước cất. Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch protein đã pha loãng
và các dung dịch khác như sau
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
1 2
Dung dịch casein 1% (ml) 5 5
Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10
Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 1
Lắc đều và giữ ở 35.5
o
C

M Tyrosin: lượng M Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn.
Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế
Các phân đoạn ∆OD1 ∆OD2 P(UI/ml)
Tỉ lệ hoạt
tính sau mỗi
giai đoạn
tinh chế (%)
Phụ lục
Nhựa khô ban đầu 0.308 0.012 70.353 9
Phân đoạn pH 5.7 0.264 0.063 66.46 94.47 10
Phân đoạn pH 9.0 0.150 0.035 57.39 81.57 11
Phân đoạn tủa với ammonium
sulfat
0.372
0.185
49.30 70.08 12
Phân đoạn bằng NaCl 0.240 0.074 45.60 64.81 13
Phân đoạn kết tinh 0.115 0.055 36.36 51.68 14
Phân đoạn tái kết tinh 0.097 0.062 36.78 55.34 15
39

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 66.46
57.39
49.30
45.60
36.36
36.78

nhau sau khi đã đông khô, cho vào bình định mức 100ml. Thêm nước cất đến vạch
định mức, sau đó lắc đều đến khi chế phẩm tan hoàn toàn. Các chế phẩm này được
bảo quản ở 4
o
C để dùng dần. Hút 0,4ml dung dịch protein đã pha ở trên để tiến hành
xác định lượng protein cho mỗi lần thí nghiệm Thời gian tiến hành thí nghiệm là 5
ngày. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7 (phụ lục 16 -19):
40

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Bảng 3.7. Hàm lƣợng protein của các chế phẩm theo thời gian
Ngày
∆OD Hàm lượng protein (mg/g)
M0 M1 M2 M3 M0 M1 M2 M3
1 0.155 0.112 0.115 0.110
222.00 160.57 164.86 157.71
2 0.136 0.141 0.101 0.109
199.14 202.00 144.86 156.29
3 0.142 0.124 0.162 0.131
203.43 177.71 232.00 187.71
4 0.135 0.116 0.133 0.122
193.43 166.29 190.57 174.86
5 0.125 0.106 0.133 0.116
179.14 147.71 190.57 169.14

100
130
160

phương pháp kết tủa bằng muối đã loại bỏ hầu hết các protein tạp có trong mẫu
nghiên cứu, còn lại chủ yếu là papain nên có hàm lượng protein nhỏ nhất trong các
phương pháp. Phương pháp đông khô giữ lại hầu hết những protein trong chế phẩm
M0 vì quá trình đông khô giúp cố định mẫu nên có hàm lượng protein cao nhất. Còn
hai phương pháp còn lại dùng dung môi để tủa enzyme đã loại bỏ một số protein có
trong chế phẩm nhưng không thể loại bỏ hoàn toàn các protein khác nên có hàm
lượng protein trung bình nằm giữa chế phẩm M0 và M1.
3.9 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA CÁC CHẾ PHẨM THEO
THỜI GIAN.
Nhằm đánh giá tính ổn định của chế phẩm, chúng tôi đã tiến hành khảo sát
sự biến đổi hoạt tính của chế phẩm theo thời gian.
Cân 0.1 gam các chế phẩm thu được bằng các phương pháp khác nhau sau
khi đã đông khô, cho vào bình định mức 100ml. Thêm nước cất đến vạch định mức,
sau đó lắc đều đến khi chế phẩm tan hoàn toàn. Chế phẩm được bảo quản ở 4
o
C để
dùng dần, thời gian tiến hành thí nghiệm là 5 ngày.
Hút 1ml dung dịch trong bình định mức tiến hành xác định hoạt tính protease
theo phương pháp Anson. Thí nghiệm được lặp lại mỗi ngày và kết quả được thể
hiện trong bảng 3.8:

42

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

0
10
20
30
40
50
60
70
80
1 2 3 4 5
Thời gian (ngày)
Hoạt tính (UI/ml)
M0
M1
M2
M3

Hình 3.7. Sự biến đổi hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian
Trong đó:
M
0
: mẫu nhựa đu đủ tươi được đem đông khô
M
1
: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa với ammonium sulfate sau
khi đông khô.
M2: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng ethanol sau khi đông
khô.
M3: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng dung môi aceton sau
khi đông khô.

được tách bằng muối có hoạt tính cao hơn so với các phương pháp sử dụng dung
môi hữu cơ và khá bền khi tồn tại ở dạng hoạt động.

44

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 3.10 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA
ENZYME PAPAIN.
3.10.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH
Tiến hành thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme ở các pH khác nhau từ 7.5
đến 9.0. Xác định hoạt tính theo phương pháp Anson, mẫu được đo độ hấp thu
quang ở bước sóng 720nm. Kết quả được trình bày trong bảng 3.9 (phụ lục 20)
Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH
pH ∆OD1 ∆OD2 ∆OD P(UI/ml)
7.0 0.355 0.087 O.268 72.34
7.5 0.295 0.030 0.265 71.65
8.0 0.232 0.067 0.228 60.80
8.5 0.275 0.064 0.211 56.01
9.0 0.271 0.072 0.200 52.77

50.00
55.00
60.00
65.00
70.00
75.00
7.0 7.5 8.0 8.5 9.0
pH

O
C ∆OD1 ∆OD2 P(UI/ml)
45
0.1053 0.0646 17.728
50
0.1108 0.0652 21.276
55
0.1619 0.0559 25.844
60
0.2731 0.0659 54.957
65
0.2525 0.0718 59.178
70
0.4136 0.0702 70.560
75
0.1678 0.0415 23.758
80
0.1993 0.0532 28.059
85
0.1697 0.0559 21.075
90
0.1366 0.0486 15.524

46

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 0
10

Tiến hành phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng ở điều kiện
nhiệt độ phản ứng là 70
O
C và pH của phản ứng là 7.0 với các hàm lượng xúc tác
khác nhau. Sau mỗi 2 giờ phản ứng, cân 10ml dung dịch thủy giải từ bình phản ứng,
thêm nước sôi để ngừng phản ứng, định mức thành 100ml dung dịch đem lọc. Hút
47

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 10ml dịch lọc đem xác định đạm formol theo phương pháp Sorensen. Kết quả được
trình bày trong bảng 3.11 – 3.13:
Bảng 3.11: Biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là
0.25% so với cơ chất.
Bảng 3.12: Biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là
0.50% so với cơ chất.
Bảng 3.13: Biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là
1.00% so với cơ chất.
Sự biến thiên hàm lượng đạm formol ở các hàm lượng xúc tác khác nhau
được biểu diễn qua đồ thị hình 3.10

Thời gian phản ứng 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Hàm lượng đạm
formol trung bình của
dịch thủy phân (g/l)
1.1 1.4 1.8 2.0 2.2 2.4 2.5 2.9 3.1 3.4 3.5 3.6 3.6
Thời gian phản ứng 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Hàm lượng đạm
formol trung bình của


Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lƣợng đạm formol
theo thời gian phản ứng.
Bảng 3.14: Biến thiên hàm lƣợng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác
nhau
Nhận xét:
Hàm lượng đạm amin = hàm lượng đạm formol – hàm lượng đạm amoniac.
Qua kết quả khảo sát trên, hàm lượng đạm amoniac của dịch thủy phân dao
động từ 0.06 – 0.07g/l. Như vậy hàm lượng đạm amoniac của dịch thủy phân rất
thấp so với các chỉ tiêu cho phép của nước chấm và xem như không đáng kể. Do đó
trong các khảo sát về ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme so với cơ chất cũng như các điều
Nồng độ enzyme (%) 0.25 0.50 1.00
Hàm lượng đạm
amoniac trung bình
của dịch thủy phân
(g/l)
0.06 0.07 0.07
49

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM kiện ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân chúng tôi không xét đến hàm lượng đạm
amoniac của dịch thủy phân.