BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY
THẠCH CHÂU (Pyrenaria sp.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY
THẠCH CHÂU

những người đã luôn sát cánh động viên và giúp đỡ tôi vượt qua những lúc khó
khăn nhất trong học tập và quá trình hoàn thành khóa luận.
Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Thị Dung

MỤC LỤC
DANH MỤC VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. THỰC VẬT 2
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Pyrenaria 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Pyrenaria 2
1.1.3. Phân loại thực vật chi Pyrenaria 3
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC 4
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 6
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 6

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu

Tên đầy đủ
AST
:
Ánh sáng thường
B
:
Butanol
C
:
Cồn (ethanol)
Dd

:
Toàn phần
TT
:
Thuốc thử
UV
:
Ultraviolet (Phổ tử ngoại)

1. DANH MỤC BẢNG

STT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 3.1: Kết quả định tính hóa học các nhóm chất trong Thạch
châu
24
2
Bảng 3.2: Kết quả SKLM cắn phân đoạn n-hexan
28


DANH MỤC HÌNH

STT
Tên hình
Trang
1
Hình 1.1: Một số flavonoid có trong các loại trà Camellia
5
2
Hình 3.1: Ảnh cơ quan sinh dưỡng cây Thạch châu nghiên cứu
18
3
Hình 3.2: Ảnh cơ quan sinh sản cây Thạch châu nghiên cứu
18
4
Hình 3.3: Vi phẫu gân lá Thạch châu
20
5
Hình 3.4: Vi phẫu phiến lá Thạch châu
20
6
Hình 3.5: Vi phẫu thân Thạch châu
21
7
Hình 3.6: Một số đặc điểm bột lá Thạch châu
22
8
Hình 3.7: Một số đặc điểm bột thân Thạch châu
23

[15]. Từ xa xưa, các lương y đã biết khai thác dược liệu từ thiên nhiên để làm thuốc
góp phần làm giàu thêm cho nền y học cổ truyền dân tộc. Trong vài thập kỷ gần
đây, với xu hướng “Trở về với thiên nhiên”, ngày càng có nhiều nước trên thế giới
đẩy mạnh nghiên cứu, bào chế và sản xuất các chế phẩm có nguồn gốc thiên nhiên,
từ dược liệu để phòng và điều trị bệnh. Tuy nhiên phần lớn nguồn tài nguyên này ở
Việt Nam được sử dụng theo kinh nghiệm y học cổ truyền mà chưa được nghiên
cứu đầy đủ.
Thạch châu là một loài cây mới được phát hiện ở một số tỉnh nước ta (Lâm
Đồng, Quảng Trị, Lào Cai) [12], [30]. Người dân những vùng này từ lâu đã thu hái
và sử dụng Thạch châu để pha nước uống giải nhiệt thay cho chè. Ngoài ra, loài này
còn được sử dụng trong các bài thuốc để thanh nhiệt, lợi tiểu, tăng sức đề
kháng…[6]. Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam và trên thế giới có rất ít tài liệu nghiên
cứu về cây Thạch châu, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đặc điểm hình thái và
phân loại theo các phương pháp mới như Protein hay AND [9], [12], [15], [24],
[22], [31]. Do vậy, với mục đích bổ sung tư liệu cho việc nghiên cứu và sử dụng cây
Thạch châu từ nguồn dược liệu trong nước một cách khoa học hơn, nhằm nâng cao
hiệu quả sử dụng cây cỏ làm thuốc trong dân gian cũng như phục vụ cho công tác
tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu sau này, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm
thực vật, thành phần hóa học của cây Thạch châu (Pyrenaria sp.)” được thực
hiện với hai mục tiêu sau:
1. Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi học (vi phẫu, soi bột của thân,
lá) và giám định chính xác tên khoa học của cây Thạch châu.
2. Xác định sơ bộ các nhóm chất trong cây Thạch châu (phần trên mặt đất)
bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng.
2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. THỰC VẬT
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Pyrenaria
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [1], [8], [9], [29], vị trí của chi

Một số loài thuộc chi Pyrenaria thường gặp ở Việt Nam:
1.1.3.1. P. garretiana Craib - Thạch châu Garrett
a, Đặc điểm thực vật
Cây nhỏ hoặc trung bình, cao 4-15m. Cành, nhánh có lông dày, nâu, nhánh
già có màu nâu tro. Lá có nhiều lá dày, cứng, hình xoan thon ngược, kích thước 10-
14 x 4-5cm, mặt trên có màu vàng nhạt, gân-phụ không đều, 11-13 cặp, bìa có răng
nhọn; cuống 1 cm, có lông phún nâu [12], [23].
Hoa có cuống dài khoảng 5mm; chiều dài hoa 1-2cm; cánh đài dạng cánh
hoa; cánh hoa dính nhau ở đáy; đài 5; nhị ngắn, vàng; vòi nhụy 5 [12], [23].
Quả nhân cứng xoan tròn, to 18x20mm [12], [23].
b, Phân bố
Cây thường mọc ở Sapa, độ cao 1000-1850m [12], [23].
1.1.3.2. P. jonqueriana Piere - Thạch châu Jonquier
a, Đặc điểm thực vật
Cây đại mộc 7-12m. Cành chia làm nhiều nhánh. Lá mọc so le, hình mác
thuôn, đầu nhọn, phiến lá dài, mỏng, bìa có răng, mặt dưới nâu lúc khô [12], [22].
Hoa không cọng hoặc có cuống nhỏ (3-6 mm); đài tràng không phân biệt rõ
ràng, đài 8-10, tràng 8-10, hơi vàng hay trắng, phiến to nhất dài 15mm, bìa rìa lông,
cánh hoa chóp lõm, màu ngà; 3-6 hàng tiểu nhị vàng; bầu trên, 3 ô [12], [22].
Quả tự mở, dài khoảng 35mm, tròn hoặc chia thùy mờ. Quả có vỏ dai như
da, trong chứa nhân cứng dài 35mm; hột 1-3 [12], [22], [23].
Hạt phẳng, có góc cạnh, không có cánh [23].
b, Phân bố
Cây thường mọc ở núi cao 800-1700m: Vọng Phu, Bạch Mã, Đà Lạt [12].
1 1.3.3. P. polilaneana Gagn - Thạch châu Poilane
a, Đặc điểm thực vật
4

Cây đại mộc 13m; nhánh non mảnh, không lông. Lá dài 7-10cm, không lông,
tái ở mặt dưới (nâu lúc khô), bìa có răng [12].

Gallocatechin
Epicatechin

Hình 1.1: Một số flavonoid có trong các loại trà Camellia
Hiện nay các nghiên cứu về chi Pyrenaria chủ yếu tập trung vào phân loại
theo các phương pháp mới như Protein hay AND [24], [31], hầu như chưa có
nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học.
6

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu: Phần trên mặt đất (cành, lá, hoa, quả) của cây Thạch
châu được thu hái ở Mê Linh, Lâm Hà, Lâm Đồng vào tháng 3/2015. Mẫu được làm
sạch phơi khô, đựng trong 2 lần túi PE kín và lưu trữ tại Phòng Lưu mẫu, Khoa Hóa
phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu.
Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường
đại học Dược Hà Nội theo Phiếu giám định số 02/2015. Mẫu được lưu tại Phòng
tiêu bản cây thuốc, Bộ môn Thực vật với số hiệu là HNIP/18110/15.
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
 Thiết bị dùng cho nghiên cứu
- Cân kỹ thuật Precisa, cân phân tích, bếp đun cách thủy.
- Tủ sấy Memmert, máy xác định độ ẩm Precisa HA60.
- Máy cất quay thu hồi dung môi BUCHI R-200.
- Đèn tử ngoại Vilbez lourmat (hai bước sóng UV 254nm và UV 366nm).
- Pipet vạch, Pipet Paster, Pipet chính xác, ống nghiệm, bình nón, bình gạn,
bình cầu, phễu, giấy lọc…
- Máy chấm sắc ký Camag Linomat 5, máy chụp sắc ký Camag Reprostar 3.
- Máy vi tính với phần mềm winCATS và VideoScan.
- Bản sắc ký lớp mỏng Silicagel 60F
254

Định tính một số nhóm chất đặc trưng bằng SKLM: sử dụng ethanol 99,7%
chiết xuất và phân bố dần vào các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan,
ethylacetat, n-buthanol. Khảo sát hệ dung môi pha động để định tính các nhóm chất
chính trong các phân đoạn bằng các thuốc thử đặc trưng.
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Nghiên cứu về đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học
Mô tả đặc điểm theo phương pháp ghi trong tài liệu hướng dẫn thường quy,
đối chiếu các tài liệu tham khảo để xác định tên khoa học [1], [12].
8

2.4.2. Nghiên cứu về đặc điểm vi học
Sau khi thu hái, mẫu được đem xử lý bằng các phương pháp thích hợp rồi
nghiên cứu:
 - Vi phẫu: tiến hành làm vi phẫu theo các bước sau:
 + Chọn mẫu thích hợp.
 + Cắt tiêu bản bằng dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay.
 + Xử lý lát cắt: Lựa chọn những lát cắt mỏng, tẩy bằng dung dịch javen, rửa
sạch bằng nước cất, tẩy tiếp bằng chloralhydrat 75%, rửa lại bằng nước cất,
ngâm trong acid acetic 5%, rửa bằng nước cất đến hết acid. Sau đó tiến
hành nhuộm kép với xanh methylen và đỏ son phèn.
 + Quan sát, mô tả và chụp ảnh: Lên tiêu bản bằng dung dịch hỗn hợp
glycerin - nước (1:1) rồi quan sát dưới kính hiển vi, mô tả đặc điểm giải
phẫu, chụp ảnh bằng máy ảnh qua kính hiển vi.
 - Bột dược liệu:
 + Mẫu nghiên cứu được sấy khô, nghiền thành bột.
 + Quan sát trực tiếp, nếm, ngửi để xác định màu, mùi, vị.
 + Lên tiêu bản bột dược liệu bằng dung dịch hỗn hợp glycerin - nước (1:1),
quan sát, mô tả và chụp ảnh những đặc điểm điển hình của bột qua kính
hiển vi có kết hợp máy ảnh để lưu mẫu.
2.4.3. Nghiên cứu thành phần hóa học bằng phản ứng hóa học

d, Phản ứng với diazo hóa
Chuẩn bị thuốc thử: Hòa tan 0,9g acid sulfanilic trong 9ml HCl đậm đặc
(đun nóng), pha loãng với nước đến 100ml. Lấy 10ml dung dịch ngâm trong nước
đá rồi cho thêm 10ml dung dịch NaNO
2
4,5% cũng vừa được ngâm trong nước đá.
Lắc đều rồi giữ ở nhiệt độ 0
o
C trong 15 phút. Dung dịch chỉ pha để dùng ngay.
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (NaOH,
KOH, Na
2
CO
3
), thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha, lắc đều (có thể đun nóng
trên nồi cách thủy vài phút), nếu có flavonoid sẽ xuất hiện màu đỏ.
2.4.3.2. Định tính coumarin
Dịch chiết chuẩn bị như trong phản ứng định tính flavonoid dùng để tiến
hành các phản ứng sau:
a, Phản ứng mở đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết:
- Ống 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%.
- Ống 2: để nguyên.
10

Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội rồi quan sát. Nếu có coumarin quan
sát thấy, ống 1 xuất hiện tủa vàng, ống 2 dung dịch vẫn trong. Thêm vào cả hai ống
nghiệm mỗi ống 1ml nước cất, lắc đều rồi quan sát:
- Ống 1: dd vẫn đục.
- Ống 2: trong suốt.

phút.
Nếu cột bọt ở cả hai ống bằng nhau thì sơ bộ kết luận dược liệu chứa saponin
triterpenoid.
Nếu cột bọt ở ống chứa NaOH cao hơn thì sơ bộ kết luận dược liệu chứa
saponin steroid.
c, Phản ứng Salkowski
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm. Nghiêng ống nghiệm 45 độ, cho từ từ
theo thành ống nghiệm 2-3 giọt acid sulfuric đặc, nếu có saponin sẽ xuất hiện vòng
màu đỏ tía ở mặt phân cách. Lắc nhẹ dung dịch chuyển sang màu đỏ.
2.4.3.4. Định tính glycosid tim
Cho 20 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250ml, thêm 60ml cồn 25
o
,
lắc đều, ngâm trong 24 giờ. Lọc lấy dịch chiết, loại tạp (chất nhầy, chất nhựa) bằng
chì acetat 30% để dư. Để lắng, lọc. Loại chì acetat thừa bằng dung dịch Na
2
SO
4
bão
hòa đến khi không còn tủa với Na
2
SO
4
nữa. Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn. Lắc kỹ 2
lần với hỗn hợp cloroform : ethanol (4:1), mỗi lần 20ml, để lắng, gạn lấy dịch chiết,
loại nước bằng cách lọc qua bông. Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm đã được
sấy khô, đem cô cách thủy đến khô. Cắn thu được để làm phản ứng định tính.
a, Phản ứng Liberman
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết
cắn. Nghiêng ống 45

tiếp xúc 2 lớp chất lỏng.
2.4.3.5. Định tính anthranoid (dạng tự do)
a, Phản ứng Bortraeger
Chiết xuất: Lấy 1g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn (10ml). Thêm 5ml
nước cất, đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua
giấy lọc hoặc qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 50ml. Làm
nguội dịch lọc. Thêm 5ml cloroform. Lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nước. Giữ lớp cloroform
để làm phản ứng.
Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch
amoniac 10%. Lắc nhẹ nếu có anthranoid tự do lớp nước sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp
cloroform có màu vàng chứng tỏ trong dược liệu có acid chrysophanic. Thêm tiếp
tục từng giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp dung môi hữu cơ sẽ mất màu
vàng còn lớp nước sẽ đỏ thẫm hơn lúc ban đầu.
Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch
NaOH 10%, lắc nhẹ. Nếu có anthranoid lớp nước sẽ có màu đỏ sim.
Anthranoid toàn phần (dạng glycosid và dạng tự do) được định tính hoàn
toàn tương tự nhưng trong bước chiết xuất ban đầu thay thế 5ml nước cất bằng 5ml
H
2
SO
4
1N.
13

b, Phản ứng vi thăng hoa
Đặt khoảng 3g bột dược liệu trong một đĩa nhôm. Hơ nhẹ trên bếp điện cho
bay hết nước trong dược liệu. Đặt lên trên đĩa nhôm một phiến kính, trên phiến kính
đó có để một miếng bông đã tẩm nước lạnh. Để đĩa nhôm trực tiếp trên bếp điện.
Sau 5-10 phút lấy lam kính ra để nguội rồi soi dưới kính hiển vi thì thấy tinh thể
hinh kim màu vàng. Sau khi nhỏ dung dịch NaOH lên lam kính, dung dịch sẽ có

alkaloid sẽ xuất hiện
Ống 1
1ml dịch chiết + 2 giọt thuốc
thử Bouchardat
Quan sát thấy có xuất hiện tủa
nâu đến đỏ nâu
Ống 2
1ml dịch chiết + 2 giọt thuốc
thử Dragendorff
Quan sát thấy có xuất hiện tủa
vàng cam đến đỏ
Ống 3
1ml dịch chiết + 2 giọt thuốc
thử Mayer
Quan sát thấy có xuất hiện tủa
trắng đến vàng
2.4.3.8. Định tính đường khử, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ
Lấy khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml
nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội. Lọc. Dịch lọc được dùng để làm phản ứng
định tính sau:
Định tính đường khử: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch chiết nước. Thêm vào 5
giọt thuốc thử Fehling A và 5 giọt thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy 10 phút. Nếu
có đường khử: đáy ống nghiệm xuất hiện kết tủa đỏ gạch.
Định tính polysaccharid: Lấy hai ống nghiệm lớn. Cho vào mỗi ống:
- Ống 1: 4ml dịch chiết nước và 5 giọt thuốc thử Lugol.
- Ống 2: 4ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol.
Quan sát và so sánh hai ống nghiệm: nếu có polysaccharid, ống 1 có màu
xanh đậm hơn ống 2.
Định tính acid amin: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch chiết nước. Thêm vào 3
giọt thuốc thử Ninhydrin 3%. Đun cách thủy sôi 10 phút. Nếu có acid amin, xuất

tăng dần theo thứ tự lần lượt là n-hexan, ethyl acetat, n-butanol kết hợp thu hồi dung
môi dưới áp suất giảm.
Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi khác nhau để chọn ra hệ dung môi
cho kết quả phân tách tốt nhất đối với từng phân đoạn kết hợp quan sát ở các bước
sóng UV-VIS và thuốc thử hiện màu đặc trưng, lưu giữ bằng máy ảnh.
Các thông số đặc trưng:
- Bản mỏng: Bản mỏng Silica gel 60 F
254
(Merck) kích thước 10x20cm.
- Dung môi khai triển: khảo sát theo các tài liệu hướng dẫn có thay đổi theo
kết quả thực tế phân tích.
- Dung dịch chấm bản mỏng: dịch chiết toàn phần và các phân đoạn.
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10-15μl các dung dịch phân
tích. Sau khi triển khai bản mỏng bằng các hệ dung môi đã lựa chọn, để khô trong
không khí hoặc sấy nhẹ. Phun các thuốc thử hiện màu đặc trưng có các nhóm chất
và sấy ở nhiệt độ phù hợp. Quan sát kết hợp chụp ảnh dưới ánh sáng UV 254nm,
366nm, ánh sáng thường trước và sau khi phun thuốc thử.
16 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY THẠCH CHÂU
3.1.1. Đặc điểm hình thái
Cây gỗ 7-15m, sống lâu năm. Thân có màu nâu, tiết diện tròn. Cành chia
nhiều nhánh (Hình 3.1a). Lá đơn, mọc so le (Hình 3.1b); hình mác thuôn, đầu nhọn,
phiến lá dài, mỏng, dai; không có lá kèm; dài khoảng 5-15cm; mặt trên nhẵn, có
màu xanh nõn chuối khi non (Hình 3.1d), xanh đậm khi già (Hình 3.1a); mặt dưới
của lá non và đầu chồi có lông nhỏ, trắng, mịn (Hình 3.1c); gốc lá thuôn hoặc tròn,
ngọn lá nhọn; mép lá: phía gốc lá nguyên, phía ngọn lá: khía răng cưa; gân lá hình
lông chim, gân chính nổi rõ (Hình 3.1d).