i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành tốt đề tài này là nhờ sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô và bạn
bè .Qua đây em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô, Thạc sĩ Ngô Thị Hoài Dương,
người đã tận tình truyền đạt những kiến thức trong quá trình học tập và trực tiếp
hướng dẫn, chỉ bảo những kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt đề tài.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn trân trọng nhất tới các thầy cô trong khoa chế biến
đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kiến thức trong những năm học vừa qua. Em
xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy, cô phụ trách phòng thí nghiệm Hóa-Vi sinh thực
phẩm, cùng thầy cô bộ môn công nghệ chế biến, viện công nghệ sinh học và môi
trường trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực
tập.
Chân thành cảm ơn các bạn sinh viên lớp 50CB, cùng toàn thể các bạn sinh
viên thực tập tại phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ động viên em.

Nha Trang tháng 07 năm 2012
Sinh viên

Nguyễn Văn Mạnh

ii


PHƯƠNG

PHÁP

NGHIÊN

CỨU 25
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25
2.1.1. Phế liệu vỏ, đầu tôm 25
2.1.2. Hóa chất nghiên cứu 25
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.2.1. Phương pháp thu nhận mẫu 25
2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm: 25
2.2.3. Phương pháp phân tích và xác định các chỉ tiêu 29
2.2.4. Thiết bị 29
C
HƯƠNG
3:

KẾT

QUẢ

NGHIÊN

CỨU

VÀ


KIẾN 53
TÀI

LIỆU

THAM

KHẢO 54
PHỤ

LỤC 56 iv

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ tổng hợp các hướng tận dụng phế liệu tôm 8
Hình 1.2. .Cấu tạo của Chitin. 10
Hình 1.3. Sự sắp xếp của chuỗi polymer của α-chitin, β-chitin và γ-chitin 10
Hình 1.4. Chitosan và glucosamine tạo thành từ sự thủy phân chitin 11
Hình 1.5. Sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất chitin, chitosan từ phế liệu thủy sản 13
Hình 1.6. . Quy trình sản xuất của Pháp 17
Hình 1.7. Quy tình sản xuất của Stevens, Viện công nghệ Châu Á (AIT), Thái
Lan (2002) 18
Hình 1.8. Quy trình của Đỗ Minh Phụng, trường Đại học Thủy sản Nha Trang 19
Hình 1.9. Quy trình sản xuất chitin và chitosan của Trang Sĩ Trung, Đại học
Nha Trang (2006) 20

chân trắng 31
Bảng 3.3. Kết quả tối ưu quá trình khử protein trên vỏ 32
Bảng 3.4. Kết quả phân tích dự đoán mô hình 33
Bảng 3.5. Kết quả phân tích ANOVA 33
Bảng 3.6. Kết quả phân tích các chỉ số thống kê ứng với mô hình lựa chọn 35
Bảng 3.7. Kết quả chọn chế độ tối ưu trên phần mềm DX 37
Bảng 3.8. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố 37
Bảng 3.9. Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố khi xử lý NaOH với đầu + vỏ tôm
thẻ chân trắng 38
Bảng 3.10. Kết quả tối ưu quá trình khử protein trên đầu-vỏ 40
Bảng 3.11. Kết quả phân tích dự đoán mô hình 41
Bảng 3.12. Kết quả phân tích ANOVA 41
Bảng 3.13. Kết quả phân tích các chỉ số thống kê ứng với mô hình lựa chọn 42
Bảng 3.14. Kết quả chọn chế độ tối ưu trên phần mềm DX 44
Bảng 3.15. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố 44
vi

Bảng 3.16. Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố khi xử lý NaOH với đầu tôm thẻ
chân trắng 45
Bảng 3.17. Kết quả tối ưu quá trình khử protein trên đầu 46
Bảng 3.18. Kết quả phân tích dự đoán mô hình 47
Bảng 3.19. Kết quả phân tích ANOVA 48
Bảng 3.20. Kết quả phân tích các chỉ số thống kê ứng với mô hình lựa chọn 49
Bảng 3.21. Kết quả chọn chế độ tối ưu 51
Bảng 3.22. Tổng hợp chế độ tối ưu cho hiệu quả khử cao nhất 51
Bảng 3.23. Bảng tối ưu khi cố đinh hiệu quả khử protein ở 97.42% 52
Bảng 3.23 cho thấy với cùng hiệu suất thu được như nhau nhưng với các đối
tượng khác nhau cho chế độ khử khác nhau. 52
Bảng 3.24. Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của ph ương pháp Microbiuret 58
Bảng 3.25. Kết quả đo OD330nm 59

nay ở nước ta hai đối tượng này vẫn được xử lý chung trong cùng một qui trình. Điều
này có thể dẫn đến việc sử dụng lượng hoá chất không hợp lý và ảnh hưởng xấu đến
chất lượng của chitin thu được.
Thực tế cho thấy trong dây chuyền sản xuất tôm, đầu và vỏ tôm hoàn toàn có
thể tách riêng một cách dễ dàng vì vậy việc áp dụng chế độ xử lý theo đặc điểm riêng
của từng đối tượng là cần thiết và khả thi nhằm kiểm soát lượng hoá chất sử dụng và
hạn chế tác động không có lợi đến tính chất của chitin thành phẩm.
Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Chủ nhiệm Khoa Công Nghệ
Thực Phẩm, Trường Đại học Nha Trang, đề tài: “Đánh giá ảnh hưởng của tính chất
nguyên liệu đầu vào đến hiệu quả khử protein bằng NaOH trong qui trình sản
xuất chitin” đã được thực hiện.

2

2. Mục tiêu đề tài
Nghiên cứu tối ưu hóa công đoạn khử protein trong quy trình sản xuất chitin
cho riêng đầu; vỏ; và đầu + vỏ tôm thẻ chân trắng . Từ đó, đề xuất chế độ khử protein
hợp lý cho từng đối tượng,
3. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình khử protein trên vỏ, đầu, và
đầu + vỏ tôm
- Tối ưu hóa công đoạn khử protein cho vỏ tôm bằng NaOH.
- Tối ưu hóa công đoạn khử protein cho đầu tôm bằng NaOH.
- Tối ưu hóa công đoạn khử protein cho đầu - vỏ tôm bằng NaOH.
- Đề xuất chế độ khử protein hợp lý riêng cho đầu, vỏ, và đầu-vỏ.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng bên cạnh một số kết quả đạt được đề tài
vẫn còn có rất nhiều thiếu sót. Kính mong sự đóng góp ý kiến của quý thầy cô
và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn.

Nha Trang, tháng 07 năm 2012

Văn Nam và cộng sự, 2005: Shahidi và Synowiecki, 1991). Nguồn phế liệu tôm này
nếu biết tận dụng triệt để sẽ mang lại nguồn lợi khổng lồ. Nó không chỉ đem lại giá trị
kinh tế cao mà còn có ý nghĩa bảo vệ môi trường. Thành phần phế liệu đầu và vỏ
một số loài tôm ở Bảng 1.1
4

Bảng 1.1. Thành phần khối lượng của một số loài tôm:[3]
Loài tôm Đầu tôm (%) Vỏ tôm (%)
He 29,80 10,00
Thẻ 28,00 9.00
Sú 31,40 8,90
Rằn 33,90 10,40
Gân 33,14 11,27
Chì 31,85 11,07
Bột 31,55 12,15
Sắt 42,38 11,62
Càng 51,95 8,56
Hùm 63,40 5,50
Mũ ni 52,02 12,57

1.1.2. Cấu tạo và thành phần hóa học của phế liệu tôm [1]
1.1.2.1. Cấu tạo vỏ tôm
Lớp ngoài cùng của vỏ tôm có cấu trúc chitin-protein bao phủ, lớp vỏ này
thường bị hóa cứng khắp bề mặt cơ thể do sự lắng đọng của muối canxi và các hợp
chất hữu cơ khác nằm dưới dạng phức tạp do sự tương tác giữa protein và các chất
không hòa tan.
Lớp biểu bì, lớp màu, lớp canxi hóa cứng do sự lắng đọng của canxi. Lớp màu,
lớp canxi hóa, lớp không bị canxi hóa chứa chitin nhưng lớp biểu bì thì không. Ta gọi
các lớp có chứa chitin là lớp endocuticle.
* Vỏ chia làm 4 lớp chính:

Mg, Mn và Fe.
Đối với tôm sú ta có bảng thành phần ở bảng 1.2

6

Bảng 1.2. Thành phần hóa học của đầu và vỏ tôm sú [3]
Bộ phận Protein thực Chất béo Chitin Tro
Đầu 53.5 8.9 11.1 22.6
Vỏ 22.8 0.4 27.2 11.7

Trong thời gian gần đây, việc nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaaus vannamei)
thương phẩm phát triển mạnh, nguồn phế liệu tôm thẻ trở thành nguồn nguyên liệu
chính để sản xuất chitin. Tương tự như phế liệu tôm sú, thành phần protein trong phế
liệu tôm thẻ tương đối cao.
Bảng 1.3. Thành phần hóa học của đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng[3][4]
Protein (%) Khoáng (%)
Vỏ 21 ± 2.1 27.5 ± 2.3
Đầu 49.01 25.23
Đầu + vỏ 47,4 ± 1,8 24,6 ± 0,8

Kết quả ở Bảng 1.3 cho thấy đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) có
hàm lượng protein cao hơn đáng kể so phần vỏ. Vì vậy, trong quá trình sản xuất
chitin từ phế liệu tôm thẻ cần lưu ý đến đặc điểm này.
Protein trong phế liệu tôm thường là loại protein không hoà tan do đó khó tách
ra khỏi vỏ, tồn tại dưới 2 dạng [2]: Dạng tự do tồn tại trong nội tạng và trong các cơ
thịt tôm, dạng phức tạp ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với
chitin, canxi carbonate, với lipid tạo lipoprotein, với sắc tố tạo protein-carotenoid…
như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm.
Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và nhiều hợp chất hữu
cơ khác, đây là nguyên nhân gây khó khăn cho việc tách và tinh chế chúng.

1.1.3. Các hướng tận dụng của nguồn phế liệu tôm
Phế liệu tôm có thể tận dụng để thu hồi protein, astaxanthin, chitin, chitosan và
enzyme protease. Qua nhiều tài liệu khoa học, có thể tổng kết các lĩnh vực ứng dụng
khác nhau của phế liệu tôm ở sơ đồ hình 1.1.
8


vào
thức ăn
chăn
nuôi
Sản xuất
thức ăn
cho tôm,
cá, gia súc

Ứng dụng
trong công
nghiệp
dư
ợc

Deacety hóa
Chitosan
Ứng dụng
trong các
ngành
khác
Ứng dụng
trong nông
nghiệp
Ứng dụng
trong công
nghiệp sinh
học
Ứng dụng
trong công

Ngày nay chitin – chitosan có rất nhiều ứng dụng trong đời sống vì vậy việc
nghiên cứu và sản xuất ngày càng có ý nghĩa quan trọng.
1.2.2. Cấu tạo và tính chất chitin
Chitin là một polysaccharide mạch thẳng, nó có cấu trúc tuyến tính gồm các
đơn vị N-acetyl-glucosamine nối với nhau nhờ cầu β-1,4glucoside.
Công thức phân tử: (C
8
H
13
O
5
N)
n

Phân tử lượng : M = (203,19)
n

Trong đó n phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu:
Đối với tôm hùm : n = 700÷800
Đối với cua : n = 500÷600
Đối với tôm thẻ: n = 400÷500
Công thức cấu tạo:
10 Hình 1.2. .Cấu tạo của Chitin.
Tính chất của chitin phụ thuộc vào cấu trúc của chitin. Người ta chia cấu
trúc chitin thành ba dạng: α-chitin, β-chitin, γ-chitin (Hackman và Goldberg, 1965).
Cấu trúc của chitin ở các dạng trên xuất phát từ nguồn chiết rút chitin, chitin từ tôm
và cua có dạng α-chitin, còn chitin từ mực có dạng β-chitin. Ba dạng chitin nêu trên

lượng trung bình lớn hơn 1 triệu dalton. Tuy nhiên, chitin chiết rút từ vi sinh vật thì
có phân tử lượng thấp, chỉ khoảng vài chục ngàn dalton.
- Khi đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đặc thì chitin bị khử mất gốc
acetyl tạo thành chitosan.
- Khi đun nóng chitin trong dung dịch HCl đặc thì chitin sẽ bị thủy phân tạo
thành các phân tử glucosamine có hoạt tính sinh học cao. Khi đun nóng chitin trong
HCl đậm đặc tạo thành 88,5% D-glucosamine và 22,5% acid acetic.

Hình 1.4. Chitosan và glucosamine tạo thành từ sự thủy phân chitin
1.2.3. Ứng dụng của chitin - chitosan [5]
1.2.3.1. Trong công nghiệp thực phẩm
Trong công nghệ thực phẩm, chitin đặc biệt là chitosan là những hợp chất
polyme tự nhiên an toàn với những tính chất đặc trưng như khả năng kháng nấm,
kháng khuẩn, chống ôxy hóa, tạo màng , tạo gel, làm trong nên chitosan được ứng
dụng nhiều trong lĩnh vực cộng nghệ chế biến và bảo quản thực phẩm.
- Tạo màng, chống biến nâu, chống mất nước, hạn chế hao hụt trọng lượng,
kháng nấm bảo quả trái cây như dâu , vải, nhãn, na, xoài, thăng long
12

- kháng khuẩn, kháng nấm, chống ôxy hóa trong bảo quản và chế biến thịt, cá,
đậu, đậu phụ, bánh mỳ
- chitosan làm chất trợ lắng trong công nghệ sản xuất nước quả và rượu.
1.2.3.2. Ứng dụng trong nông nghiệp
Dùng bảo quản hạt giống, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt, tác nhân
chống nấm, chống vi khuẩn gây bệnh cho môi trường xung quanh.
Ngoài ra, chitosan còn dùng làm chất kích thích sinh trưởng cây trồng, thuốc chống
bệnh đạo ôn, khô vằn cho lúa.
1.2.3.3. Ứng dụng trong sinh học
Làm giá thể hoạt hóa cho công nghệ cố định enzyme và các tế bào vi sinh vật,
làm chất mang sử dụng trong sắc ký chọn lọc, màng lọc sinh học, tổng hợp polymer

àu

chitin

Deacetyl hóa

Chitosan

1.2.3.6. Trong công nghệ in ấn
Dùng làm mực in cao cấp trong công nghệ in, tăng cường độ bám dính của mự in…
1.2.3.7. Trong công nghệ môi trường
Chitin – chitosan được ứng dụng khá phổ biến trong xử lý môi trường nhờ khả
năng hấp phụ, tạo phức với các ion kim loại (pb, Hg, Cd, Fe, Cu, ), các chất màu,
khả năng keo tụ, tạo bông rất tốt với các chất hữu cơ. Do đó chitin, chitosan được sữ
dụng như một nhóm tác nhân chính để xử lý nước thải (hiranp, 1996; matteus, 1997;
synowwiecki và Ali-Khateeb, 2003). nhuộm vải, xử lý nước trong công nghiệp nuôi
tôm, cá…
1.2.4. Công nghệ sản xuất chitin
Quy trình hóa học sản xuất chitin thông thường gồm công đoạn tách khoáng,
tách protein, và tẩy màu. Công đoạn tẩy màu ở các nước nhiệt đới như Việt Nam
thường thực hiện kết hợp với quá trình phơi khô sản phẩm chitin dưới ánh nắng mặt
trời. Chitosan được sản xuất từ chitin qua quá trình tách nhóm acetyl (deacetylation).
Tất cả các công đoạn trên đều được xử lý bằng hóa chất, tùy theo loại nguyên liệu,
công nghệ, và yêu cầu về chất lượng sản phẩm chitin và chitosan mà các điều kiện xử
lý sẽ khác nhau. Sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất chitin, chitosan từ phế liệu thủy
sản được trình bày ở Hình 1.5


PO
4

Nồng độ acid: Nồng độ acid quá thấp sẽ không khử được hết khoáng dẫn đến
sản phẩm còn nhiều tạp chất. Nồng độ quá cao sẽ gây đứt mạch chitin, giảm chất
lượng sản phẩm.
Tỉ lệ acid/nguyên liệu: Nếu quá nhỏ thì sẽ không khử hết khoáng, nếu quá lớn
sẽ ảnh hưởng xấu đối với mạch, tốn chi phí.
Nhiệt độ, thời gian xử lí: hai yếu tố này cũng rất quan trọng, ảnh hưởng đến
chất lượng sản phẩm. Nếu thời gian xử lí dài và nhiệt độ cao thì sản phẩm bị nát sẽ rất
khó xử lí sau này, đồng thời sẽ ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm sau này. Nếu
nhiệt độ thấp và thời gian xử lí ngắn thì khoáng sẽ không bị loại triệt để
- Rửa trung tính: Công đoạn này có tác dụng rữa trôi hết lượng CaCl
2
tạo
thành, loại bỏ HCl dư bởi vì lượng HCl nếu còn sẽ trung hòa làm tốn lượng NaOH
cho công đoạn khử protein hay deacetyl. Trong quá trình rửa cũng có phần nào sắc tố
bị rửa trôi.
- Khử protein:[5]
Quá trình khử protein từ phế liệu thủy sản có thể được thực hiện với nhiều loại
hóa chất như NaOH, Na
2
CO
3
, Na
2
HCO
3
, KOH, K
2

5% NaOH Đun sôi 0.5 2 : 3
5% NaOH 65 3 1 : 10
Cua 1N NaOH 80 3h x 2 lần -
2% NaOH 90 2 1 : 20
1N NaOH 50 6 -
5% NaOH 90 2 -
1N NaOH 60 5 -
5% NaOH 65 1 1 : 15

Phương trình khử protein như sau:
16

Quá trình khử protein thường kèm theo quá trình khử lipid do lipid có thể phản
ứng với kiềm tạo thành xà phòng theo phương trình phản ứng sau:

Đối với quá trình khử protein, nhiệt độ đóng vai trò qua trọng, ở nhiệt độ
thường quá trình tách protein diễn ra chậm, thời gian thủy phân 1 đến vài ngày. Khi
nâng nhiệt nhiệt độ xử lý thì thời gian cần thiết để tách protein giảm đáng kể. Để rút
ngắn thời gian tách protein còn vài giờ thì nhiệt độ cần đạt khoảng 90 – 100
0
C. Ngoài
ra tỷ lệ phế liệu với dung dịch hóa chất đóng vai trò quyết định hiệu quả tách protein.
Tuy nhiên cũng lưu ý là sử dụng nhiệt độ cao hoặc thời gian dài sẽ dẫn đến quá trình
cắt mạch sản phẩm chitin.
Trong phế liệu tôm và cua có chứa một lượng lớn chất màu (astaxanthin) vì
vậy để chitin có màu trắng, đẹp thì cần có một công đoạn tẩy màu. Việc tẩy màu này
có thể thực hiện bằng cách phơi dưới ánh sáng mặt trời hoặc xử lý bằng các chất tẩy
màu thông dụng. Theo Roberts (1998) thì phương pháp tẩy màu đơn giản nhất là sử
dụng H
2


Hình 1.6. . Quy trình sản xuất của Pháp
Ưu điểm: Quy trình sản xuất này rút ngắn được thời gian sản xuất rất nhiều.
Sản phẩm thu được rất sạch có màu trắng đẹp do đã khử được sắc tố triệt để.
Nhược điểm: Do NaOCl là một chất oxy hóa mạnh nên ảnh hưởng đến mạch
polymer làm cho độ nhớt của sản phẩm giảm một cách rõ rệt. Mặt khác, aceton rất đắt
V
ỏ tôm

H
ấp chín ph
ơi khô

Xay nh
ỏ

Tách protein

R
ửa trung tính

Ngâm HCl

Ngâm aceton


t
o
phòng
T = 30 phút
w/v = 1/5

NaOCl 0,135%
t
o
phòng
t = 6 phút
w
/v =

1/10

NaOH 40%

t
o
= 85
o
C

t

=

4

(65
0
C), thời gian 20h. Đây là một quy trình mới, tiết kiệm được lượng xút và acid
dùng, đồng thời tránh được quá trình
cắ
t mạch chitosan do xử lý ở nồng độ acid
chi
tosan

Phơi khô hoặc sấy ở 60
0
, 10h
Tách protein

R
ửa trung tính

Ngâm HCl

HCl 2,5%
t
0
phòng
t = 12h
w/v = 1/10
R
ửa trung tính

Nghi
ền nhỏ v

t = 20h
w/v = 1/10

19

cao. Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này màu trắng, hàm lượng protein
và khoáng thấp, độ đề acetyl tương đối cao (từ 84-88%).
c. Quy trình của Đỗ Minh Phụng, Trường Đại học Thủy sản:[1] Hình 1.8. Quy trình của Đỗ Minh Phụng, trường Đại học Thủy sản Nha Trang

Nhận xét: Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy
màu. Tuy nhiên, lại có nhược điểm là thời gian sản xuất kéo dài, tiêu tốn nhân công,
nồng độ hóa chất sử dụng cao kết hợp với thời gian sử lý dài (công đoạn khử khoáng)
t
0
= 100
0
C
t = 2h
w/v = 1/2
,
5

HCl 6N
t
o

phòng
t = 48h
w/v = 1/2
,
5

NaOH 40%t
0
= 80
0
C