i
LỜI CẢM ƠN Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Bộ môn
Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nha Trang. Để hoàn thành đồ án tốt
nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Phạm Thu
Thủy, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, TP.
Nha Trang - Khánh Hòa. Cô đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá
trình thực hiện để hoàn thành đồ án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học
Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi được sử dụng trang thiết bị, hóa chất và các
dụng cụ thí nghiệm.
ThS. Trương Thị Thu Thủy, cán bộ tổ nghiên cứu và thầy Ứng Trọng
Thuấn, Bộ môn Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi về kỹ thuật.
Các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nha
Trang.
Các bạn trong lớp 48CNSH, Trường Đại học Nha Trang.
Cuối cùng xin kính chúc mọi người sức khoẻ, hạnh phúc và thành công.
Nha Trang, tháng 6 năm 2010
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Tiến Lâm
ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
TÀI LIỆU THAM KHẢO 40
iv
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH Danh mục bảng:
Bảng 1.1: Các siêu họ gen mã hóa peptide độc tố ốc Conus 12
Bảng 1.2: Các peptide độc tố được thử nghiệm lâm sàng và cận lâm sàng 13
cứu được tiến hành nhằm đánh giá một cách chính xác về đóng góp quan trọng
của các độc tố chiết xuất từ loài ốc cối đối với ngành dược và sinh học tế bào.
Tuy nhiên cho đến nay, các nhà khoa học chỉ mới chiết xuất và phân tích
được khoảng 100 độc tố từ nguồn tiềm năng chứa tới 70.000 độc tố của ốc cối.
Do vậy, các nghiên cứu sâu hơn về ốc cối và độc tố ốc cối vẫn đang và sẽ được
tiếp tục tiến hành trong đó có các nghiên cứu phát sinh chủng loại ốc cối.
Hơn thế nữa, các loài ốc cối có quan hệ di truyền gần nhau thường chứa
các peptide độc tố giống nhau hơn là các loài có mối quan hệ xa nhau. Do vậy,
các nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc cối không chỉ làm cơ sở cho việc
phát hiện các loài ốc cối mới, mà còn góp phần quan trọng vào quá trình nghiên
cứu các conotoxin mới, nhằm phát huy hết tiềm năng vốn có của chúng.
Bên cạnh giá trị đối với y học, các loài ốc cối còn có giá trị kinh tế cao. Do
có màu sắc và hoa văn đẹp, vỏ của các loài ốc cối thường được khai thác để làm
đồ trang sức, mỹ nghệ và các vật phẩm lưu niệm. Tình trạng khai thác một cách
bừa bãi các loài ốc cối đòi hỏi các nhà khoa học phải có các nghiên cứu bảo tồn
một cách hợp lý và đúng đắn nguồn tài nguyên này.
2
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự đa dạng
loài của ốc cối. Tuy nhiên, ở Việt Nam, các nghiên cứu về ốc cối mới chỉ dừng
lại ở mức độ thống kê các loài đặc hữu và mô tả các đặc điểm hình thái giải
phẫu. Hiện chưa có một nghiên cứu nào về ốc cối ở mức độ phân tử. Vì vậy,
nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc cối Việt Nam bằng các phương pháp
sinh học phân tử là điều rất cần thiết.
Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nhân đoạn gen mã hóa
16S rRNA và trình tự ITS2 của các loài ốc cối Conus bằng kỹ thuật PCR”,
làm cơ sở cho việc xây dựng cây phát sinh chủng loại và tìm kiếm các loài ốc cối
mới ở Việt Nam.
Đề tài này nhằm các mục tiêu chính sau đây:
Tách chiết DNA tổng số của các loài ốc cối Việt Nam thu thập tại hai
khu vực: Đảo Lý Sơn, Quảng Ngãi và Cù Lao Chàm, Quảng Nam.
4
1.1. Khái quát về ốc cối
1.1.1. Phân loại
Họ ốc cối Conidae thuộc liên họ Conoidea, bộ Sorbeoconcha, là một trong
những họ có số lượng loài lớn trong ngành động vật thân mềm. Cho đến nay,
trên thế giới người ta đã xác định được khoảng 700 loài, trong đó chủ yếu thuộc
chi Conus.
Ngành: Mollusca (Linnaeus, 1758)
Lớp: Gastropoda (Cuvier, 1795)
Bộ: Sorbeoconcha (Ponder & Lindberg, 1997)
Liên họ: Conoidea (Fleming, 1822)
Họ: Conidae (Rafinesque, 1815)
Chi: Conus (Linnaeus, 1758)
(http://zipcodezoo.com/Key/Animalia/Conus_Genus.asp)
1.1.2. Đặc điểm chung
Ốc cối có vỏ dạng hình thoi, tháp vỏ thấp, tầng thân lớn, miệng vỏ hẹp dài,
trục vỏ thẳng, không có nếp uốn vặn, với màu sắc sặc sỡ, hoa văn đa dạng, mép
trong và mép ngoài miệng vỏ đơn giản, nắp vỏ bằng chất sừng, da vỏ có vân
màu, kích thước rất khác nhau tùy theo loài (loài lớn nhất có thể dài đến 23 cm)
(Ngô Anh Tuấn, 2009) (Hình 1.1). Chúng phân bố chủ yếu ở các vùng biển nhiệt
đới và vùng biển ấm như Philíppin, Indonesia, Australia, Mexico, Florida,
Hawaii…Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy một số loài có thể thích ứng
với sự thay đổi của điều kiện môi trường như ở vùng biển nóng mũi Cape, Nam
Phi hay vùng biển lạnh phía tây Califonia, Hoa Kỳ. Hầu hết các loài ốc Conus
nhiệt đới sống trong hoặc gần các rạn san hô, trong khi các loài cận nhiệt đới
5
được tìm thấy chủ yếu tại vùng dưới triều ở độ sâu từ 10-30m và dưới các tảng
Nha Trang 26: Cần Thơ
5: Cửa Lò 16:
Cam Ranh 27: Hà Tiên
6: Huế 17:
Phan Rang 28: Hòn Chồng
7: HộiAn 18:
Phan Rí 29: Rạch Gía
8: Sa Huỳnh 19:
Mũi Né 30: An Biên
9: Quy Nhơn 20:
Phan Thiết 31: Cái Nuốc
10:
Sông Cầu 21:
Long Hải 32: Sông Đốc
11:
Tuy Hòa 22:
Bà Rịa
9
Ốc cối là động vật ăn thịt (canivorous), chúng ăn mồi sống. Thức ăn chính
của chúng là các loài cá nhỏ (piscivorous), giun biển (vermivorous), nhuyễn thể
(molluscivorous), và ngay cả các loài ốc cối khác ( Terlau và Olivera, 2004;
Olivera và cs, 2002). Do di chuyển chậm nên khi bắt một số con mồi di chuyển
nhanh như cá, chúng sử dụng độc tố để tấn công, làm tê liệt con mồi. Độc tố ốc
cối được tiết ra từ cơ quan miệng có răng sừng dạng kim và một ống xoắn gắn
với một túi chứa dạng bầu có thể co bóp. Khi tiếp cận con mồi, vòi của chúng
thò ra và bộ phận hình mũi tên (răng sừng) đâm con mồi rồi phóng chất độc vào.
Độc tố ốc cối (conotoxin) là những đoạn peptide nhỏ dài 12 - 46 aa, giàu
liên kết disulfide. Tùy theo cấu trúc, chúng được chia làm các nhóm chính sau,
mỗi nhóm được mã hóa bởi một siêu họ gen (bảng 1.1). Các độc tố trong một
siêu họ có thể có các đích tác dụng khác nhau như ức chế hoặc kìm hãm đối với
một kênh ion hoặc receptor gắn với protein G đặc trưng (Becker và Terlau,
2008).
Bảng 1.1: Các siêu họ gen mã hóa peptide độc tố ốc Conus
STT
Siêu
họ gen
Mô hình Cystein Họ dược lý Đích tác dụng
1 A
CC-C-C
Thụ thể Nicotin
Thụ thể Adrenergic
CC-C-C-C-C
CC -CXOCb
Vận chuyển Catecholamine
10
5 S
C-C-C-C-C-C-C
C-C-C
Thụ thể Serotonin
S
Thụ thể Nicotin
6 P C-C-C-C-C-C Chưa xác định Chưa biết
7 I1/I2 C-C-CC-CC-C-C Chưa xác định Kênh K
+
8 J C-C-C-C Chưa xác định Kênh K
+
?
(Olivera và cs, 2006)
Tín hiệu thần kinh từ tủy sống đưa lên não cần có sự vận chuyển các ion
canxi qua lại màng tế bào trước synap qua các kênh canxi. Kênh canxi có nhiều
loại: L, T, P, R, Q, … Đặc biệt kênh canxi loại N có nhiều ở các mô cơ thần kinh
đóng vai trò quan trọng trong sự nhạy cảm với các cơn đau. Kênh canxi này bao
gồm 5 tiểu đơn vị, trong đó, tiểu đơn vị α
2
-δ có ái lực mạnh với các độc tố, ví dụ
ω-conotoxin MVIIA. Độc tố ω-conotoxin MVIIA đi vào cơ thể sẽ liên kết với
tiểu đơn vị α
Amrad Thử nghiệm pha I
Contulakin-G
(CGX-1160)
Điều trị các cơn đau
Cognetix
Thử nghiệm pha I
-MrIA
(derivative)
(Xen-2174)
Điều trị các cơn đau
Xenome
Thử nghiệm pha I
-Vc1.1
(ACV-1)
Điều trị các cơn đau
Metabolic
Thử nghiệm pha I
Conantokin-G
(CGX-1007)
Điều trị các cơn
đau, động kinh
Cognetix
Thử nghiệm pha I
Việc xây dựng cây phát sinh chủng loại có thể dựa trên phân tích trình tự
một gen hoặc một họ gen. Tuy nhiên, dữ liệu phân tích cũng có thể mở rộng hơn,
chẳng hạn kết hợp nhiều gen hoặc nhiều vùng DNA khác nhau. Với những loài
có quan hệ gần, các gen hay vùng DNA có độ linh động cao (như intron, các
vùng liên gen - đoạn chèn) thường hay được sử dụng. Song với các loài có quan
hệ xa thì các gen hay vùng DNA có độ bảo thủ cao như gen mã hóa các rRNA
hay một protein ty thể hoặc nhân thường được sử dụng. Để tăng độ tin cậy, các
nghiên cứu hiện nay thường sử dụng kết hợp cả hai (vùng DNA có độ bảo thủ
với vùng DNA có độ biến thiên cao). Hơn thế nữa, các chỉ thị ty thể cũng thường
được sử dụng kết hợp với các chỉ thị nhân.
1.2.1. Chỉ thị ty thể
Đối với các động vật thân mềm, DNA ty thể đã được chứng minh là công
cụ hữu hiệu trong phân tích mối quan hệ loài. Các chỉ thị (marker) của DNA ty
thể thường được sử dụng là các gen mã hóa rRNA, cytochrome b, cytochrome
oxydase, tRNA, và một số vùng không mã hóa như vùng liên gen trnF-cox3,
13
atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP (Grande và cs, 2008; Michael và
Robert, 2005).
Việc sử dụng toàn bộ trình tự DNA ty thể cũng nâng cao độ phân giải và ý
nghĩa thống kê so với việc sử dụng từng đoạn gen riêng lẻ. Năm 2006, trình tự
DNA ty thể hoàn chỉnh của động vật thân mềm có độc đầu tiên được công bố -
của loài ốc độc Lophiotoma cerithiformis, có chiều dài 15.380 nucleotide, mã
hóa 13 protein ty thể, 2 rRNA và 22 tRNA. Các mRNA, rRNA và 13 tRNA được
phiên mã từ cùng một sợi trong khi các tRNA còn lại được phiên mã từ sợi còn
lại (Bandyopadhyay và cs, 2006). Sự sắp xếp các gen ty thể của L. cerithiformis
có sự giống nhau đáng kể so với hệ gen ty thể của hai loài ốc Haliotis rubra,
Katharina tunicate, và loài bạch tuộc Octopus vulgaris. Trình tự DNA ty thể của
L. cerithiformis là cơ sở để các nhà nghiên cứu giải mã trình tự DNA ty thể và
nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc độc khác.
1.2.2. Chỉ thị nhân
khoảng 50 loài đã được thống kê).
Năm 2005, Duda và Rolan đã sử dụng gen mã hóa cytochrome oxidase I
để phân tích phát sinh chủng loại của 90 loài ốc cối Conus, trong đó có 30 loài
đặc hữu của Cape Verde. Kết quả cho thấy, các loài này được phân làm 2 nhánh
(Duda và Rolan, 2005).
15
Cũng trong năm này, Cunha và cs đã sử dụng các gen ty thể (gen mã hóa
12S rRNA, 16S rRNA, tRNA-Val, cytochrome b) kết hợp với một gen nhân (gen
mã hóa một lipoprotein giống megalin) để xây dựng cây phát sinh chủng loại của
49 loài ốc cối thuộc Cape Verde, trong đó có 3 loài chưa được định danh. Kết
quả một lần nữa khẳng định nghiên cứu trước đó của Duda và Rolan, các loài ốc
cối này cũng được chia làm hai nhánh chính: nhánh thứ nhất bao gồm các loài ốc
cối có vỏ lớn và nhánh thứ hai bao gồm các loài có kích thước nhỏ hơn. Cả hai
nhánh đều chứa các loài đặc hữu và di cư, điều này chứng tỏ tổ tiên của chúng đã
di cư tới Cape Verde một cách độc lập (Cunha và cs, 2005).
Cunha và cs, 2008 tiếp tục nghiên cứu phát sinh chủng loại của 4 loài ốc
thuộc nhánh có vỏ lớn là C. ateralbus, C. pseudonivifer, C. trochulus, và C.
venulatus sử dụng các gen coxI (mã hóa cytochrome oxidase I) và nad4 (mã hóa
tiểu đơn vị 4 của NADH dehydrogenase) (tiến hành trên 200 mẫu ốc thu thập tại
16 địa điểm thuộc các đảo Sal, Boavista và Maio). Kết quả cho thấy, các mẫu ốc
thuộc 4 loài này được chia làm 3 nhánh rõ ràng, tương đối cách xa nhau mà việc
phân loại dựa vào màu sắc vỏ và hoa văn không thể thấy được (Cunha và cs,
2008).
Duda và cs, 2001, sử dụng chỉ thị 16S và calmodulin đã xây dựng phát
sinh chủng loại của 76 loài ốc cối Conus, trong đó 75 loài có nguồn gốc từ các
vùng biển Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương và 1 loài có nguồn gốc từ Đông Đại
Tây Dương (Duda và cs, 2001).
Duda và Kohn, 2005 đã sử dụng gen mã hóa 16S rRNA (ty thể) và protein
calmodulin (gen nhân) để nghiên cứu phát sinh chủng loại của 138 loài ốc cối
Conus thu thập tại các vùng biển Ấn Độ - Thái Bình Dương, Đông Thái Bình
Hình 1.4. Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile. Hệ gen ty thể của Conus textile là
một phân tử DNA dạng vòng, có chiều dài 15.562 nucleotide, mã hóa cho: 13 protein ty thể [3
cytochrome oxidase (các gen coxI, coxII, coxIII); cytochrome b (gen cob); tiểu đơn vị 6 và 8
của ATPase (gen atp6 và atp8); các tiểu đơn vị từ 1-6 và tiểu đơn vị 4L của NADH
dehydrogenase (các gen nad1-nad6 và nad4L)]; 2 rRNA; 22 tRNA [D, V, L (1), L (2), P, S
(1), S (2), H, F, K, A, R, N, I, M, Y, C, W, H, G, E và T] (Bandyopadhyay và cs, 2008).
Khoảng cách giữa các gen thay đổi từ 0 - 35 nucleotide trừ hai vùng liên
gen coxI - coxII và tRNA
Phe
- coxIII tương đối lớn có kích thước tương ứng là
165 và 126 nucleotide. Từ hệ gen trên để làm cơ sở cho việc nghiên cứu các loài
ốc cối khác.
18
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu phân loại ốc cối ở mức độ
phân tử, và đã có nhiều thành công trong việc xác định loài mới cũng như khám
phá, mô tả các conotoxin mới như đã giới thiệu ở trên.
Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay các nghiên cứu về ốc cối mới chỉ đang
dừng lại ở mức độ mô tả đặc điểm hình thái, giải phẫu, thống kê loài (Nguyễn
Anh Tuấn, 2009) cũng như các thông tin cảnh báo về loài ốc cối có thể gây ngộ
độc cho con người. Theo Đào Việt Hà và cs, ở Việt Nam hiện đã thống kê được
76 loài ốc cối, chủ yếu là ốc cối hoa lưới (C. textile) và ốc cối địa lý (C.
geographus). Đây cũng chính hai loài ốc cối đã được Viện hải dương học Nha
Trang xếp vào danh mục “các loài hải sản độc hại gây chết người” (Đào Việt Hà
và cs, 2006).
Tuy nhiên, chưa có một nghiên cứu nào về ốc cối Việt Nam được tiến hành
ở mức độ phân tử. Vì vậy, việc nghiên cứu về định danh loài cũng như xây dựng
200 Nhiệt độ phòng
EDTA 0.5M (pH 8.0) 50 Nhiệt độ phòng
Protenase K 20 mg/ml 20 Nhiệt độ phòng
Rnase A 4 mg/ml 5 Nhiệt độ phòng
Tổng 275
Dung dịch đệm (Wizard
®
SV Lysis Buffer) bảo quản ở nhiệt độ phòng
Dung dịch rửa (Wizard
®
SV Wash Solution) bảo quản ở nhiệt độ
phòng (chứa ethanol 95%)
Nước sạch nuclease
Cột Wizard
®
SV Minicolumn bảo quản ở nhiệt độ phòng
Ống thu mẫu 1,5 ml
21 Bộ kít tách chiết DNA của công ty Nam Khoa
Tên hóa chất Điều kiện bảo quản
Dung dịch P/C/I (phenol, chloroform,
isoamylalcohol)
-20
0
C
Natriacetate 3M, pH 5.2 4
0
C
Taq polymerase 5u/ml Fermentas, USA -20
0
C
c) Hóa chất điện di
Agarose 1% và 1.5%
Dung dịch đệm TBE 0.5X (Tris - Axit boric - EDTA)
Dung dịch nhuộm Ethidium bromide
2.1.3. Thiết bị chuyên dụng
Block nhiệt (VWR, Mỹ)
Copyright: Tài liệu đại học ©