i
MỤC LỤC
Trang
Mục lục i
Danh mục các chữ viết tắt iii
Danh mục các bảng iv
Danh mục các hình v
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ SỮA CHUA 2
1.2. VI SINH VẬT DÙNG TRONG SỮA CHUA 5
1.3. CƠ CHẾ LÊN MEN SỮA CHUA CỦA VI KHUẨN LACTIC 6
1.4. TỔNG QUAN VỀ NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE VÀ
TÁC DỤNG CỦA NẤM MEN KHI BỔ SUNG VÀO SỮA CHUA 12
1.5. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT SỮA CHUA 25
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 32
2.1.1. Sữa nguyên liệu 32
2.1.2. Vi khuẩn lên men lactic điển hình 33
2.1.3. Tác nhân lên men rượu – nấm men Saccharomyces cerevisiae 34
2.1.4. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu 34
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35
2.2.1. Xây dựng thang điểm cảm quan cho sản phẩm sữa chua 35
2.2.2. Nhân giống nấm men 37
2.2.3. Quy trình dự kiến 39
2.2.4. Bố trí thí nghiệm 41
2.2.4.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nước:sữa trong môi trường
nhân giống nấm men 41
2.2.4.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nước:sữa trong sản xuất sữa
chua 42
iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
HSQT: Hệ số quan trọng
OD: Optical Density (mật độ quang)
M
1
: Mẫu đối chứng (mẫu sữa chua không bổ sung nấm men)
M
2
: Mẫu có bổ sung nấm men (mẫu sữa chua có bổ sung nấm men)
v
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1: Sơ đồ các quá trình lên men lactic, lên men rượu 7
Hình1.2: Đường cong sinh trưởng của quần thể vi sinh vật trong môi trường 17
Hình 1.3: Ảnh tế bào nấm men 62
Hình 3.1: Sự biến đổi mật độ quang của dịch pha loãng sinh khối nấm men
S.cerevisiae theo tỷ lệ nước:sữa trong nhân giống nấm men 46
Hình 3.2: Biểu đồ ảnh hưởng của tỷ lệ nước:sữa trong sản xuất sữa chua đến chất
lượng cảm quan của sữa chua 47
Hình 3.3: Biểu đồ ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung nấm men đến chất lượng cảm quan
của sữa chua 48
Hình 3.4: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian lên men chính (I) đến chất lượng cảm
quan của sữa chua 49
Hình 3.5: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian lên men phụ (II) đến chất lượng cảm
quan của sữa chua 50
Hình 3.6: Biểu đồ so sánh lượng đạm (protein hòa tan) giữa mẫu đối chứng và mẫu
có bổ sung nấm men 51
Hình 3.7: Giữ giống trên môi trường thạch 62
Hình 3.8: Nhân giống nấm men trên môi trường sữa 62
Hình 3.9: Nuôi cấy hộp lồng đếm khuẩn lạc 62
Hình 3.10: Ảnh sản phẩm 63


- 2 -
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ SỮA CHUA
Sữa chua là một sản phẩm lên men dân gian mà con người phát hiện được
trong quá trình sử dụng và bảo quản sữa. Người ta còn ghi nhận người đầu tiên mở
được xưởng sản xuất sữa chua (tuy quy mô còn nhỏ) là một thương gia người Tây
Ban Nha. Sau đại chiến Thế giới lần II, người này qua Hoa Kì mở xưởng lớn hơn và
tổ chức quảng cáo rộng rãi. Dần dần sữa chua trở thành món ăn phổ biến ở các nước
châu Mĩ, sau lan sang châu Âu, và hiện nay phổ biến trên toàn Thế giới.
Sữa chua yoghurt là sản phẩm sữa chua được biết đến nhiều nhất và cũng là
cũng là sản phẩm phổ biến trên khắp Thế giới.
Sữa chua yoghurt bắt nguồn từ Bungari với tên gọi là yaourt, ở nhiều nước
khác có tên gọi riêng cho yoghurt. Ở nước ta hiện nay sử dụng phổ biến loại
yoghurt.
Trạng thái, mùi vị của sữa chua yoghurt có khác nhau ở vùng này so với
vùng khác. Đặc biệt là độ đặc hoặc loãng phụ thuộc vào thị hiếu của mỗi nước.
Ở một số quốc gia hay ở một số địa phương có thói quen dùng sữa chua có
đường. Trong quá trình sản xuất loại sữa chua này người ta cho thêm đường
saccharose vào sữa tươi trước khi lên men (như ở Việt Nam). Thông thường ở hầu
hết các nước người ta sản xuất sữa chua không đường.
Để bảo quản dài hạn kết hợp với chế biến sữa thành những sản phẩm dùng
trong thực phẩm, người ta đã chế biến sữa thành các sản phẩm như sữa lên men, bơ,
phomat… Ở quy trình sản xuất các sản phẩm này, vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn
lên men lactic đóng vai trò quan trọng.
Sữa lên men – hay người tiêu dùng quen gọi là sữa chua, là sản phẩm thu
được thông qua hoạt động của một số sinh vật lên men sữa, trong đó chủ yếu là khu
hệ vi khuẩn lactic và nấm men (men sữa). Dưới tác động của nhóm vi sinh vật này,
đường lactose của sữa sẽ được chuyển thành acid lactic và một lượng rất nhỏ rượu


0
C (còn lên men rượu ở điều
kiện lạnh, lượng ester tạo ra nhiều hơn)
Streptococcus lactic 42÷45
0
C
Lactobacillus caucacius 42÷45
0
C
→ Sữa chua kumiss
Themobacterium bulgaricus 42÷45
0
C
Yeast candida (nấm kefer) 42÷45
0
C
Người ta chia yoghurt thành ba loại phụ thuộc vào thời điểm tiến hành quá
trình lên men:
- Sữa chua yoghurt dạng “set type”: ngay sau khi bổ sung chủng, người ta
rót hộp ngay và lên men trong hộp.
- Sữa chua “stirred type”: bổ sung chủng và lên men trong xitec lớn. Sau
đó làm lạnh và rót hộp.

- 4 -
- Sữa chua uống “drink yohurt”: sản xuất tương tự như loại stirred. Sau khi
đông tụ, pha chế thành dịch, có thể bỏ qua hoặc không bỏ qua xử lý nhiệt trước khi
rót hộp.
Sữa chua được sản xuất theo 2 phương pháp: thủ công đơn giản và quy mô
công nghiệp.
Thành phần và giá trị dinh dưỡng của sữa chua

sacarose thành acid lactic làm thay đổi pH của môi trường ruột già từ kiềm (thích
hợp với vi khuẩn thối rữa) sang acid không thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn
thôi rữa. Do vậy sẽ hạn chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối, tránh được các độc
tố xâm nhập và máu đầu độc cơ thể. Đặc biệt đối với bệnh nhân bị nhiễm khuẩn
phải sử dụng kháng sinh liều cao, dài ngày sẽ bị rối loạn hay bị hỏng hệ vi sinh vật
đường ruột có lợi cho tiêu hóa. Đối với những người này uống sữa chua sẽ giúp
phục hồi hệ vi sinh vật có lợi cho cơ thể.
- Giá trị của sữa chua còn đặc biệt ở chỗ vi khuẩn lactic và men sữa như
Lactobacidofilus, Lactobacilus có khả năng tạo chất kháng sinh chống được
Staphylococcus và một số tác nhân gây bệnh đường ruột khác.
Tóm lại: Sữa chua là một thực phẩm rất bổ dưỡng cho tất cả mọi người, đặc
biệt là người mới lành bệnh và cho trẻ em.
1.2. VI SINH VẬT DÙNG TRONG SỮA CHUA
Vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus là loài vi khuẩn lactic được sử dụng phổ
biến trong sản xuất sữa chua. Lên men ở 42÷45
0
C L.bulgaricus là một vi khuẩn lên
men sữa đồng hình được phân lập từ sữa chua, sản xuất 17% D(-) acid lactic trong
sữa. Khối lượng nhỏ các sản phẩm phụ tạo thành các hợp chất thơm chủ yếu là các
acetaldehyt do enzyme threonin thành acetaldehyt và glycerin. Các sản phẩm phụ
tiếp theo có thể là acetone buthanol-2 và chút ít acetoin. Các acid béo quan trọng
nhất là acid acetic, propionic, butyric, isovalericcaproic. L.bulgaricus thể hiện hoạt
tính phân giải protein trong sữa dẫn đến sự tích lũy các acid amin tự do cao.

- 6 -
Streptococcus thermophilus lên men ở 42÷45
0
C. Khi sử dụng các hỗn hợp
chủng có S.thermophilus thì sự giảm hàm lượng đường sacarose thành đường
hexose như fructose thì nhanh chóng hơn môi trường chỉ có chủng S.thermophilus.


Các ester phosphate được tạo thành có khả năng phản ứng mạnh hơn so với
monosaccarid cũng chính là giai đoạn hoạt hóa chúng.
Galactose không thể lên men trực tiếp được mà trước hết nó phải được
chuyển thành glucose theo sơ đồ sau:
Galactose + ATP → galactose-1-phosphate + ADP
Galctose-1-phosphate + uridin diphosphate glucose →
→ uridin diphosphate galatose + glucose-1-phosphate →
→ uridin diphosphate + galactose → uridin diphosphat glucose
Glucose-6-phosphat dưới tác dụng của enzyme đồng phân hóa (isomerase)
chuyển thành fructose-6-phosphat. Fructose-6-phosphat lại tiếp tục bị phosphoryl
hóa để chuyển thành fructose-1,6-phossphat:

- 9 -

Phản ứng tạo thành fructose-1,6-diphosphat là phản ứng rất quan trọng
trong quá trình phân giải tiếp theo. Và chính các phản ứng trên làm cho fructose-
1,6-phosphat trở nên kém bền vững và dễ dàng tham gia vào quá trình lên men tiếp
theo.
Giai đoạn tiếp theo là sự phá vỡ mạch cacbon của đường hexose nhờ tác
dụng của aldolase có trong vi khuẩn, nấm men tạo thành aldehyt-3-
phosphoglycerinic và tiếp đó thành phosphodioxy aceton.

Aldehyt-3-phosphoglycerinic tiếp tục liên kết với 1 phân tử acid phosphoric
và bị oxy hóa đến 1,3-diphosphoglycerinic dưới tác dụng của dehydrogenase (-SH).
Sau đó acid 1,3-diphosphoglycerinic lại chuyển gốc phosphate sang phân tử ADP
dưới tác dụng của phosphoglyceratkinase tạo thành acid 3-phosphoglycerinic. Tiếp
đó chất này lại chuyển thành acid 2-phosphoglycerinic (nhờ xúc tác của
diphosphoglyceratmutase).


2
, acetoin.
Phương trình tổng quát hóa sự lên men lactic đồng hình:
C
6
H
12
O
6
→CH
3
COCOOH+2H 2CH

ydrogenaselacticodeh
→
3
CHOHCOOOH
Glucose acid pyruvic acidlactic
+22.5kcal
Sơ đồ chuyển hóa trong lên men lactic đồng hình: - 12 -
Thực chất của quá trình này là đường được chuyển hóa theo con đường
glucozit của Embden-Mayerhoff-Panas tạo acid pyruvic, trong tế bào vi khuẩn lên
men đồng hình không có đủ enzyme cacboxylase, do vậy acid pyruvic không bị
phân giải sâu xa hơn, mà thu nhận hydro để thành acid lactic.
Một phần nhỏ acid pyruvic bị decaboxyl để tạo ra lượng nhỏ sản phẩm phụ
acetadehyde, ethanol, acid acetic, aceton, di-acetyl chính là tổ hợp tạo ra mùi vị đặc
trưng cho sữa chua, giúp sữa chua có mùi vị khác hẳn các sản phẩm khác.

Bao quanh tế bào nấm men là một lớp màng mỏng dày đặc, mềm mại có thể
đàn hồi để định hình cũng như bảo vệ tế bào chống lại các tác động bên ngoài và
chất độc. Vỏ tế bào nấm men mang điện. Nó còn có tác dụng giữ áp suất thẩm thấu
nội bào, điều chỉnh các chất dinh dưỡng là các hợp chất có phân tử lượng thấp và
các muối khoáng đi qua các lỗ nhỏ vào trong tế bào.
Thành phần hóa học của vỏ tế bào bao gồm có các phức chất protein-
polysacarid, phosphate và lipid. Vỏ tế bào dầy khoảng 25nm và chiếm khoảng 25%
khối lượng tế bào. Trong thành phần polysacarid của màng tế bào Saccharomyces
cerecvisiae thấy có chứa glucan và mannan với tỷ lệ tương đương nhau mà thôi. Vỏ
tế bào nấm men còn có kitin (chitin).
Màng tế bào chất:
Xung quanh tế bào chất được bao quanh một lớp màng rất mỏng, chiều dày
không quá 1nm (1nanomet = 10
-9
m) dính chặc với tế bào chất, cấu tạo chủ yếu là
protein, chiếm 50% khối lượng chất khô, còn lại là lipid 40% và một ít polysacarid.
Màng tế bào chất có 4 chức năng cơ bản: tác dụng như rào chắn thẩm thấu,
điều chỉnh chất dinh dưỡng từ môi trường vào trong tế bào và ngược lại cho các sản
phẩm trao đổi chất ra ngoài tế bào; thực hiện sinh tổng hợp một số hợp phần của tế
bào (các cấu tử của vỏ tế bào); nơi khu trú một số enzyme và cơ quan tử của tế bào
(như riboxom). Vận chuyển chất qua màng liên quan đến tính thấm của màng. Đặc
tính này trước hết phụ thuộc vào các enzyme phospholipase và lipase.
Tế bào chất
Tế bào chất còn gọi là nguyên sinh chất. Tế bào chất là hệ keo được cấu tạo
từ protein (đặc tính keo dính là đặc tính của protein), hydratcacbon, lipid, chất
khoáng, nước và các hợp chất khác nữa. Trong tế bào chất chứa đầy đủ các cơ quan
tử của tế bào, như ty thể, nhân, các khoang không bào, các hạt chất dự trữ dạng tinh

- 14 -
bột, dạng chất béo, các hạt phosphate và lipid. Như vậy, tế bào trở nên dị nguyên

chuyển từ sống kỵ khí sang hiếu khi sẽ bị yếu khả năng sử dụng glucose và maltose,
nhưng với sacarose hoạt tính sử dụng lại được tăng gấp 2.5 lần. Nấm men sử dụng
maltose chỉ khi trong môi trường không có mặt glucose và fructose. Maltose được
lên men hoàn toàn trong pha sinh trưởng ổn định của nấm men.
Các acid hữu cơ chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất của nấm
men. Chúng có thể kích thích hoặc ức chế sinh trưởng nấm men. Chúng cũng có thể
là nguồn dinh dưỡng cacbon và năng lượng duy nhất.
Tất cả các sản phẩm trung gian trong trao đổi của vòng Krebs đều là nguồn
cacbon dinh dưỡng cho nấm men. Song, tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật này
trong môi trường chỉ có acid acetic, citric, succinic, fumaric, malic hay oxalic đều
thấp hơn so với ở môi trường glucose.
Các acid béo được làm nguồn cacbon dinh dưỡng phụ thuộc vào nồng độ
acid, vào chiều dài của mạch cacbon trong phân tử acid và mức độ điện li. Những
acid có mạch C từ 2 đến 4 làm nguồn cơ chất khá tốt ở nồng độ tương đối thấp.
Muối kali của các acid với mạch cacbon từ 2 đến 5 kích thích sinh trưởng nấm men
tăng 1.4÷3.3 lần so với acid tương ứng.
Các acid béo có mạch cacbon tương đối dài (từ 6 đến 10) nấm men chỉ sử
dụng ở nồng độ trong môi trường acid thấp (0.02÷0.05%). Ở nồng độ cao sẽ ức chế
nấm men phát triển.
Các acid béo chưa bão hòa, đặc biệt là acid oleic, linoleic, palmitic,
arachidinic là tác nhân sinh trưởng quan trọng của nấm men trong điều kiện kỵ khí.
Người ta xác định rằng, men rượu vang có thể sinh sản tự do trong điều kiện kỵ khí
nếu như trong môi trường có mặt hai chất là acid béo (oleic, linoleic, linolevic) và
sterin (ergosterin, hoặc cholesterin).
Dinh dưỡng nitơ:
Nguồn nitơ cần thiết cho tổng hợp các cấu tử có chứa nitơ của tế bào là các
hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi trường.

- 16 -
Nấm men có khả năng tổng hợp được tất cả các acid amin… thành phần

),
thiamin (B
1
), pyridoxine (B
6
), acid nicotinic (B
5
hay PP).

- 17 -
Acid amin ngoài vai trò là nguồn nitơ hữu cơ và cả nguồn cacbon hữu cơ
được vi sinh vật sử dụng trực tiếp làm vật liệu xây dựng tế bào còn là các chất kích
thích sinh trưởng cho một số chủng nòi nấm men. Nhu cầu riêng biệt này là rất nhỏ.
Ä Sinh sản của nấm men
Sinh sản vô tính
Sinh sản bằng hình thức nảy chồi: bình thường đến một giai đoạn nào đó, tế
bào phân chia và tạo thành những tế bào con, lúc này những tế bào này nhỏ hơn tế
bào mẹ, sau đó lớn dần lên, hoặc tách khỏi tế bào mẹ hoặc không tách khỏi mà tạo
thành những chồi nhỏ liên kết với nhau ngay cả khi trưởng thành tạo thành chuỗi tế
bào gọi là khuânr ty giả. Đây là phương pháp sinh sản vô tính chủ yếu nhất ở tế bào
nấm men.
Sinh sản hữu tính
Shaccharomyces cerevisiae: tế bào dinh dưỡng đơn bội sinh sản theo cách
nảy chồi. Sau đó hai tế bào kết hợp với nhau xảy ra quá trình giao chất và giao nhân
tạo thành tế bào dinh dưỡng lưỡng bội. Tế bào này nảy chồi và sinh ra tế bào lưỡng
bội khác và sau đó chuyển thành bào tử túi rồi chuyển thành tế bào dinh dưỡng và
tiếp tục sinh sản bằng cách nảy chồi.
Ä Sinh trưởng nấm men: Quá trình sinh trưởng và phát triển nấm men,
được nhiều tác giả chia làm 4 pha: pha tiềm phát, pha phát triển chỉ số, pha ổn định
và pha suy thoái.

Kích thước trung bình của tế bào giống nấm men ở pha này nói chung là
nhỏ nhất, vì chúng còn phải sinh sản (nảy chồi, phân chia tế bào) từ nguồn tế bào
chất và vỏ tế bào. Đối với các tế bào trong pha này chúng có hoạt tính sinh lý – sinh
hóa rất đặc trưng và chúng nhạy cảm với các nhân tố không thuận lợi hơn các tế bào
đã trưởng thành và ở trạng thái ổn định.
Trong quá trình chất dinh dưỡng cạn dần, các sản phẩm sinh ra làm cho các
điều kiện mất đi sự thuận lợi cho sinh trưởng và quá trình chuyển sang pha ổn định.
- Pha ổn định: Trong pha này tế bào sống là ổn định và mật độ quần thể là
tối đa. Cũng có nghĩa là số lượng tế bào sinh ra bằng số lượng tế bào chết.
- Pha suy vong: Trong pha này các tế bào sống giảm dần và tế bào chất tăng
dần, một số tế bào chất bị tự phân do các enzyme protease nội bào. Các tế bào sống
trở nên già đi, kích thước nhỏ lại, nhỏ lại và tế bào chất xuất hiện dạng hạt. Tế bào
chất bị tự phân trở nên trống rỗng và bên trong còn các hạt chất béo nhỏ.
Ä Dị hóa và đồng hoá ở tế bào nấm men
Sự dị hóa (catabolism hay Dissilation)
Dị hóa các chất hữu cơ ở tế bào nấm men trong quá trình sống hiếu khí (hô
hấp) hay lên men (kỵ khí) ngoài năng lượng thu được còn tạo ra các sản phẩm. Phần
lớn sản phẩm là vật liệu tế bào dùng cho sinh tổng hợp các hợp chất cấu trúc tế bào

- 19 -
mới, còn một số sản phẩm tế bào không sử dụng và được thải ra ngoài môi trường,
như rượu ethylic, CO
2
, glycerin v.v…
Đồng hóa (Anabolism hay Assimilation)
Đồng hóa là sử dụng các hợp chất trao đổi trung gian do quá trình dị hóa
tạo thành hoặc có sẵn trong môi trường để thực hiện các quá trình sinh tổng hợp ra
các chất cấu trúc tế bào, như các hợp chất cao phân tử polysaccarit, protein, acid
nucleic, lipid… tạo ra tế bào mới từ các tiền chất đơn giản (acid amin, các base
purin và pyrimidin, các acid hữu cơ, phosphate – đường). Sự tổng hợp gắn liền với

sản phẩm bị oxy hóa. Khi đó →

- 20 -
chất B được thêm điện tử chất nhận điện tử sản phẩm khử. Trong tế bào vi
sinh vật chất bị oxy hóa thường là hợp chất hữu cơ bị mất H
→ →
+
hay là chất được oxy
hóa. Như vậy, quá trình oxy hóa thực chất là quá trình khử hydro, trong khi đó quá
trình khử là quá trình hydro hóa. Tổ hợp hai quá trình thành một – quá trình oxy hóa
– khử.
Nếu chất nhận điện tử (H
+
) cuối cùng là oxy phân tử (O
2
) là quá trình hô
hấp hiếu khí. Khi chất nhận điện tử H
+
cuối cùng là các hợp chất khác không phải là
oxy phân tử thì quá trình được gọi là hô hấp kỵ khí (nếu chất nhận H
+
là hợp chất
hữu cơ – được gọi là quá trình lên men, còn chất nhận là vô cơ – được gọi chung là
hô hấp kỵ khí).
Ở đây cũng cần mạnh rằng, sản phẩm đường phân là pyruvat. Quá trình từ
glucose đến pyruvat vi sinh vật mới thu được rất ít năng lượng (khoảng 2%). Phần
năng lượng chủ yếu vẫn còn được tích lũy trong các NADH và nhất là trong
pyruvat. Trong quá trình glucozit (đường phân) mới chỉ cắt được một mối C–C.
Số phận pyruvat sẽ được tiếp tục và chu trình Krebs theo kiểu hô hấp hiếu
khí hay hô hấp kỵ khí theo kiểu lên men là còn tùy thuộc vào hệ enzyme của tế bào