LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian vừa qua, em đ ã nhận được nhiều sự giúp đỡ tận t ình từ quý
thầy cô, gia đình và bạn bè cả về vật chất và tinh thần, đã tạo điều kiện cho em ho àn
thành đợt thực tập tốt nghiệp.
Em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đặng Thúy B ình, thầy Phan Văn
Út đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo trong qua tr ình thực hiện đề tài này.
Xin được cảm ơn các quý thầy cô trong Khoa Nuôi trồng, đặc biệt l à bộ môn
Bệnh học thủy sản, tr ường Đại học Nha Trang đ ã truyền đạt cho em những kiến
thức trong suốt những năm học vừa qua.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, anh chị Viện Công nghệ sinh học
và môi trường, trường Đại học Nha Trang, tạo điều kiện cho em thực tập tại đây.
Cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đ ình, bạn bè,
tập thể lớp 46BH đ ã luôn động viên giúp đỡ trong suốt quá tr ình học tập và thực
hiện đề tài.
Em xin chân thành c ảm ơn!
Sinh viên thực hiện
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn
Giải thích thuật ngữ, chữ viết tắt v à ký hiệu
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ĐẦU 1
Phần 1. TỔNG QUAN 2
1. VÀI NÉT VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2
1.1. Họ cá mú (Seranidae) 2
1.1.1. Vị trí phân loại 2
1.1.2. Đặc điểm hình thái 2
1.1.3. Đặc điểm sinh học và phân bố 2
1.2. Đặc điểm chung về sán lá đ ơn chủ (Monogenea) 3
2. TÌNH HÌNH NGHIÊN C ỨU BỆNH SÁN LÁ Đ ƠN CHỦ KÝ SINH TRÊN

ký sinh trên cá mú ( Epinephelus spp.) tại Khánh Hòa 46
2. Đề xuất ý kiến 47
2.1. Về nghiên cứu bệnh sán lá đ ơn chủ ký sinh trên cá mú 47
2.2. Về nghiên cứu di truyền 47
Tài liệu tham khảo 48
Phụ lục
GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ,
CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
CĐCN : cường độ cảm nhiễm
TLCN : tỷ lệ cảm nhiễm
DNA : deoxyribonucleic acid
Bp : base pair - cặp bazơ
cs : cộng sự
ctv : cộng tác viên
dd : dung dịch
gel : thạch
ITS1 : đoạn chèn giữa gen 18S và 5,8S
KHV : kính hiển vi
KST : ký sinh trùng
MCO : male copulatory organ – cơ quan giao c ấu đực
n. subfam : new subfamily – họ phụ mới
V : thể tích
V
dd
: thể tích dung dịch
Vagina : cơ quan giao cấu cái
lsr : large subunit ribosomal – ribosome tiểu phần lớn
ssr : small subunit ribosomal – ribosome tiểu phần nhỏ
Mồi : là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với
một đầu của mạch khuôn v à DNA polymerase s ẽ nối dài mồi để

B – Toàn bộ cơ thể; C – Đĩa bám 27
Hình 3.7. Loài P. summanae Young, 1969 28
Hình 3.8. Loài P. epinepheli Yamaguti,1938. A, B – cơ thể; C – dạng ấu trùng 29
Hình 3.9. Loài P. epinepheli Yamaguti,1938. A – giác bám và đĩa bám;
B – trứng; C – cơ quan giao cấu cái 29
Hình 3.10. Loài P. lantauensis Beverley – Burton & Suriano, 1981.
A – cơ quan giao cấu đực và cái; B - Các biến dị của cơ quan giao cấu cái 30
Hình 3.11. Loài P. lantauensis Beverley – Burton & Suriano, 1981 31
Hình 3.12. Loài P. sp 1 31
Hình 3.13. Loài P. sp 1. Giác bám và đ ĩa bám 32
Hình 3.14. Loài P. sp 2. A,C – cơ thể. B – giác bám và đĩa bám,
D – cơ quan giao cấu cái 33
Hình 3.15. Loài Diplectanum grouperi . A, C – toàn bộ cơ thể;
B – Cơ quan giao c ấu đực 34
Hình 3.16. Loài Diplectanum grouperi . A – đẻ trứng;
B – cơ quan giao cấu đực và trứng 34
Hình 3.17. Biểu đồ cường độ cảm nhiễm các lo ài Monogenea trên cá Mú Đen ( E.
coioides) nuôi và tự nhiên 37
Hình 3.18. Biểu đồ tỷ lệ cảm nhiễm các lo ài Monogenea
trên cá Mú Đen ( E. coioides) nuôi và tự nhiên 38
Hình 3.19. Biểu đồ mức độ cảm nhiễm của một số lo ài Monogenea
trên các loài ký ch ủ đặc hữu 39
Hình 3.20. Cây phát sinh loài 43
Hình 3.21. Cơ quan giao cấu đực của một số lo ài thuộc giống
Pseudorhabdosynochus và Diplectanum. 44
1
MỞ ĐẦU
Hiện nay, ngành nuôi trồng thủy sản ở nước ta đang dần chuyển đổi cơ cấu sang
một số đối tượng khác có tiềm năng v à giá trị kinh tế cao hơn. Sau thời kỳ hoàng kim của
con tôm sú là sự lên ngôi của cá biển, trong đó đáng quan tâm là cá mú (Epinephelus

1.1. Họ cá mú (Seranidae)
Cá mú là một trong những lo ài cá biển có giá trị kinh tế cao, sống ở v ùng
biển nhiệt đới và cận nhiêt đới. Hiện nay có nhiều loài đang trở thành những đối
tượng nuôi quan trọng nh ư cá Mú Mè (Epinephelus bleekeri), cá Mú Cọp (E.
fuscoguttatus), cá Mú Chấm Đỏ (E. akaara), cá Mú Chuột (Cromileptes altivelis )…
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo Fao, 2003 nh ững loài cá mú trong nghiên c ứu có vị trí phân loại nh ư sau:
Ngành Vertebrata
Lớp Osteichthys
Bộ Perciformes
Họ Serranidae
Giống Epinephelus
Loài Epinephelus spp.
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Cá mú rất đa dạng về màu sắc, vân chấm, kích thước và hình dạng thân. Chúng
có thể thay đổi các đặc điểm này theo từng giai đoạn, trạng thái sinh lý hay môi tr ường.
Tuy nhiên, cá mú có những điểm chung như: thân hình thoi cân đối, miệng rộng, hàm
dưới nhô ra hướng lên trên, có nhiều răng nhỏ, sắc nhọn. Cá mú thường chỉ có một vây
lưng với từ 7-11 tia vây cứng và 10-21 tia vây mềm. Vây hậu môn có 3 gai cứng, con
đực hơi dài hơn so với con cái. Nắp mang có 3 gai cứng [10][14][30].
1.1.3. Đặc điểm sinh học và phân bố
Họ cá mú (Serranidae ) có 75 giống và trên 400 loài sống chủ yếu ở vùng
biển cận nhiệt đới, nhiệt đới Thái B ình Dương, Đại Tây Dương và Ấn Độ Dương.
Tại Việt Nam tìm thấy 48 loài thuộc 11 giống, trong đó có kho ảng 14 loài thuộc
3
giống Epinephelus với nhiều loài đang là đối tượng nuôi phổ biến . Điều này cho
thấy thành phần giống loài cá mú tại Việt Nam khá phong phú [10].
Cá mú là loài thích s ống đáy, nơi có rạn san hô và đá ngầm. Đa số các loài phân
bố ở độ sâu nhỏ hơn 100m. Chúng là loài rộng muối, có thể sống đ ược ở độ mặn từ 15-
45‰, tốt nhất ở 20-30‰, sinh sản và phát triển ở 15-35

do tế bào thượng bì phân tiết tạo thành đó là các tầng cơ để bảo vệ cơ thể và giúp cơ
thể vận động được. Phía trước cơ thể có miệng, cơ quan đầu có tác dụng hút thức ăn
và vận động. Cơ quan tiêu hóa, sau mi ệng là hầu, thực quản, ruột h ình ống thẳng
hoặc phân làm hai nhánh [8].
Phía sau cơ thể sán lá đơn chủ có đĩa bám (haptor), cấu tạo gồm các móc lớn ở
giữa (anthor) và các móc rìa (marginal) ở xung quanh, bám sâu và phá ho ại tổ chức
cơ thể của ký chủ mở đ ường cho vi khuẩn, nấm và các vi sinh vật xâm nhập vào gây
viêm loét tổ chức, hút máu v à niêm dịch kích thích cơ thể ký chủ phân tiết ra các
sản vật, phá hoại c ơ năng hoạt động sinh lí bình thường của vật chủ. Đĩa bám sau có
cấu tạo phức tạp và là căn cứ chủ yếu để phân loạ i các giống loài của sán lá đơn
chủ. Thông thường đĩa bám sau có 3 dạng : đĩa bám do chất kitin hình thành nhiều móc
lớn và móc nhỏ (Diplectanidae, Dactylogyridae; Gyrodactylidae); đĩa bám phân th ành
nhiều ngăn, sắp xếp đối xứng, mỗi ngăn có tác dụng hút t hức ăn (Capsalidae…) v à đĩa
bám sau do chất kitin tạo thành đồng thời giữ lại các móc câu thời k ì hậu ấu trùng
(Diclyleothriodae; Mazocraeidae; Discocotylidae; Diplozonidae…) [7].
Ngoài ra, một số loài có tuyến ở phía sau tiết ra ni êm mạc dịch. Hệ thần kinh
và hệ bài tiết đơn giản. Cơ quan sinh dục của sán lá đ ơn chủ đực và cái trên cùng
một cơ thể. Cơ quan sinh dục đực có từ 1 đến nhiều tinh ho àn, thường nằm ở sau
buồng trứng và giữa hai nhánh ruột, ống dẫn tinh liền với cơ quan giao cấu thông
đến xoang sinh dục ở phía tr ước cơ thể. Cấu tạo của cơ quan giao cấu cũng là tiêu
chuẩn quan trọng để phân loại đến lo ài. Lỗ sinh dục ở giữa hoặc một b ên phía sau
đoạn ruột bắt đầu phân nhánh. C ơ quan sinh dục cái có buồng trứng, ống dẫn trứng,
tử cung đến xoang sinh dục, tuyến no ãn hoàng cũng phát triển [7][8].
Chu kỳ phát triển của hầu hết giống lo ài sán lá đơn chủ là đẻ trứng, số ít đẻ
con (Gyrodactylus). Trứng trong cơ thể sau khi thụ tinh theo lỗ sinh dục ra ngo ài,
nhờ cấu tạo có cuống n ên nổi lên mặt nước, bám lên mang cá hay các v ật bám trong
nước. Sau một thời gian trứng nở ra ấu ra tr ùng, cơ thể ấu trùng dài có 4 điểm mắt,
4-5 nhóm lông tơ. Nhờ lông tơ, ấu trùng có thể vận động trong n ước, tìm gặp và
5
bám vào mang, xoang mi ệng, da ký chủ. Ở nhiệt độ 14 -15

Hình 1.1. Vòng đời của sán lá đơn chủ (theo Yani Lestari N. và cs, 2008)
6
Việt Nam từ đầu những năm 1970 [26] . Đến sau những năm 80, công nghiệp nuôi
cá biển ở khu vực này đã gặp phải những vấn đề về bệnh dịch nghiêm trọng, đặc
biệt ảnh hưởng tới cá mú (Epinephelus spp. ) và cá chẽm (Lates calcarifer ). Quy mô
lớn về hợp tác quốc tế sản xuất con giống cũng nh ư sự mở rộng các trại cá l à
nguyên nhân chính gây ra m ột số bệnh KST. Gây hại cá nước mặn chủ yếu l à sán lá
đơn chủ, đặc biệt là các giống loài thuộc họ Capsalidae và Diplectanidae [36].
Ngoài ra, có nhi ều giống loài Monogenea thư ờng xuyên ký sinh trên cá mú nuôi ở
Đông Nam Á thuộc họ Diplectanidae ( Pseudorhabdosynochus epinepheli, P.
coioideis, P. lantauensis , Diplectanum spp.) ; Capsalidae (Allobenedenia spp.,
Benedenia spp., Neobenedenia spp.) ; Dactylogyridae (Dactylogyrus spp.,
Haliotrema spp.) [31][34].
Cuối thập kỷ 80, đầu thập kỷ 90, nghề nuôi cá mú trong lồng nổi ở Đông
Nam Á bị ảnh hưởng bởi một bệnh g ọi là bệnh “cá mú ngủ”. Cá bị bệnh không có
dấu hiệu gì đặc biệt trừ thân cá chuyển m àu tối hơn và chết, chủ yếu vào ban đêm.
Kiểm tra những con cá m àu tối này phát hiện thấy bị cảm nhiễm rất nặng bởi sán lá
đơn chủ thuộc Capsalidae [ 35] và do đó đã mở đường cho tác nhân c ơ hội như virus
và vi khuẩn [36].
Ogawa và cộng sự, 1994 đã đưa ra bảng tổng kết về sự cảm nhiễm B.
epinepheli trên một số loài cá biển Nhật Bản, trong đó có các lo ài cá mú như
Epinephelus akaara, E. moara, E. suillus, E. septemfasciatus [32]. Tại Malaysia, 2
loài sán lá đơn ch ủ A. epinepheli và Benedenia sp là nguyên nhân gây ch ết cá mú
nuôi được báo cáo bởi Leong, 1994 [34], năm 1995, ông và c ộng sự đưa ra thêm
một kết luận là hầu hết cá mú đều cảm nhiễm bởi P. epinepheli [38] .
Cá bị nhiễm nặng sán lá đ ơn chủ có thể bị mù mắt, xuất huyết, tổn th ương tơ
mang ảnh hưởng tới hô hấp hoặc gây lở loét tr ên da mở đường cho các tác nhân c ơ
hội khác xâm nhập gây bệnh. Bệnh này có thể gây chết hàng loạt cá con cỡ 10 -
15cm, cũng có thể gây chết cá lớn nếu c ường độ cảm nhiễm cao [ 36]. Theo Y.
Danayadol, 1994 cá mú nuôi lồng ở giai đoạn nhỏ th ường bị thiệt hại do sán lá đ ơn

và bám vào thành l ồng nuôi. Khi có điều kiện thuận lợi chúng lại tấn công vật chủ.
8
Vì vậy, việc phòng nhóm tác nhân gây b ệnh này có ý nghĩa quan trọng. Các ph ương
pháp phòng bệnh chủ yếu đối với nhóm tác nhân gây bệnh sán lá đ ơn chủ là kiểm
tra con giống trước khi mua về. Cá giống n ên được tắm bằng nước ngọt trong thời
gian 10-20 phút trước khi thả. Trong quá tr ình nuôi thường xuyên vệ sinh lồng lưới,
cũng như vớt bỏ thức ăn thừa h àng ngày, hoặc thay lồng nuôi khi cần thiết.
Biện pháp trị bệnh: k ết quả thực nghiệm cho thấy tắm cá bằng n ước ngọt là
một trong những biện pháp có hiệu quả cao trong điều trị bệnh sán lá đ ơn chủ. Tuy
nhiên, việc tắm cá bằng n ước ngọt trong 10 -25 phút chỉ có tác dụng làm cho sán lá
đơn chủ rời khỏi vật chủ. V ì vậy, nước chứa sán lá đ ơn chủ sau khi tắm cần đ ược xử
lý bằng 20-30ml chlorin/m
3
hoặc 300ml formalin/m
3
.
Việc điều trị bệnh sán lá đ ơn chủ bằng nước ngọt nên được lặp lại 2-3 lần
vào các ngày ti ếp theo nhằm đạt hiệu quả trị bệnh cao. Đây l à biện pháp trị bệnh cá
biển nuôi lồng rất phổ biến hiện nay, tuy nhi ên sau nhiều lần xử lý bằng n ước ngọt
một số loài sán lá đơn chủ có thể thích ứng với n ước ngọt. Vì vậy, việc tắm cá bằng
nước ngọt trong thời gian 10 -15 phút, sau đó s ử dụng thêm một trong các loại hoá
chất sau nhằm tăng hiệu quả trị bệnh nh ư tắm formalin với nồ ng độ 150-250ml/m
3
nước hoặc oxy già với nồng độ 150 ml/m
3
nước trong 10-15 phút tuỳ theo điều kiện
sức khoẻ cá.
Việc điều trị bệnh cá bằng ph ương pháp tắm thường làm cá bị trầy xước tạo
điều kiện cho các tác nhân gây bệnh thứ cấp nh ư vi khuẩn và nấm tấn công. Vì vậy,
việc kết hợp sử dụng một v ài loại thuốc kháng sinh đ ược phép sử dụng trong nuôi

(Oliver, 1897). Tuy nhiên, theo nghiên cứu mới nhất (Domingues & Boeger, 2008) 2 họ
phụ Diplectaninae Monticelli, 1903 và Lamellodiscinae được cộng nhận và 2 họ phụ
Nasobranchitrematinae n. subfam và Pseudomurraytrematoidinae n. subfam được đề nghị.
Họ Diplectanidae, họ phụ Diplectaninae có các gi ống
Pseudorhabdosynochus Yamaguti, 1958; Diplectanum Diesing, 1858; Lobotrema
Tripathi, 1959, Lepidotrema Johnston & Tiegs, 1922 , Spinomatrix Boeger, Fehlauer
& Marques, 2006. Theo cách truy ền thống, sự phân loại họ Diplectanidae đ ã có căn
cứ, xét ở phạm vi rộng, đó l à dựa vào hình thái các ph ần cứng của đĩa bám (haptor)
[18]. Có 2 giống của họ này (thuộc họ phụ Diplectaninae Monticelli, 1903) là hạt
nhân quan trọng bởi vì có nhiều tranh luận về vị trí phân loại v à vị trí phát sinh của
vài loài trong chúng, t ập trung vào một số nghiên cứu (ví dụ Oliver, 1968; Kritsky
& Beverley-Burton, 1986) [45]. Giống thứ nhất, Diplectanum Diesing, 1858 có đ ặc
10
điểm là đĩa bám bắt đầu ở chỗ thắt lại của c ơ thể, với hai cặp móc bám (hamuli), 3
thanh nối (transverse bars), giác bám l ưng (dorsal squamodiscs) và b ụng (ventral
squamodiscs) đư ợc tạo thành từ các hàng gai cứng [48]. Thứ hai, giống
Pseudorhabdosynochus Yamaguti, 1958 đư ợc mô tả bởi sự có mặt của một c ơ quan
giao cấu đực, có liên kết cứng, được chia ngăn, hình bầu (bulb-sharp). Chúng đã
được báo cáo ký sinh tr ên nhiều loài cá, chủ yếu là cá mú (Serranidae) ở khắp các
vùng nước ấm của các đại d ương trên thế giới [33].
Các loài P. sulamericanus (Santos, 2000), P. beverleyburtonae (Oliver,
1984) thu thập trên cá mú ở Rio de Janeiro, Bra zil - nơi có tiềm năng phát triển nuôi
mặn - đã được mô tả và mô tả lại chi tiết bởi Santos và cs, 2000. Đồng thời, trong
báo cáo này ông c ũng đã thiết lập danh sách 17 loài Pseudorhabdosynochus spp.
cảm nhiễm trên các loài cá mú ( Epinephelus spp.) với vị trí địa lý và đặc điểm chính
của giác bám [23].
Justine, 2005 đã bổ sung vào danh sách các loài thu ộc giống
Pseudorhabdosynochus (do Santos, 2000 đ ã nêu) hai loài, đó là P. coioidesis Bu,
Leong, Wong, Woo & Foo, 1999 (từ cá Mú Đen E. coioides và E. areolatus ở
Malaysia, Hong Kong và Indonesia) và P. chinensis Zhang, Yang & Liu, 2001 (t ừ

biết được rằng những sai khác về đặc điểm h ình thái của một số loài là biến dị trong
loài (do khác biệt về ký chủ, vùng địa lý) hay là hai loài hoàn toàn khác nhau? Ví dụ,
Bu & cs, 1999 thông báo sự khác nhau về hình dạng của thanh nối lưng (dorsal bar) và
cơ quan giao cấu cái (vargina) của P. lantauensis (từ cá E. coioides ở Malaysia và
Indonesia, cá E. aerolatus ở Hong Kong) với P. lantauensis trong mô tả gốc của
Beverley – Burton & Suriano, 1981 ( ở cá E. bruneus và E. fario tại Hong Kong) [47].
Di truyền học sẽ trả lời đ ược điều đó bởi bộ gen trong c ùng một loài thì khác
nhau rất ít cho dù hình dạng có thay đổi. Có thể sử dụng các chỉ thị di truyền để
nghiên cứu đặc điểm di truyền ở mức độ kiểu gen.
12
* Chỉ thị di truyền (genetic marker) :
Một số chỉ thị đ ược sử dụng phổ biến l à: biểu diễn trình tự DNA (DNA
sequence), ribosomal DNA, protein (allozymes), DNA ti th ể (mt DNA marker), đa
hình chiều dài các đoạn DNA được cắt bởi các enzyme giới hạn ( Restriction
frangment length polymorphir m - RFLP marker), đa h ình các đoạn DNA được
khuếch đại ngẫu nhi ên (Random amplified polymorphism DNAs - RAPD marker),
đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại ( Amplified frangment length
Polomorphism - AFLP marker), khu ếch đại các đoạn lặp đ ơn giản (SSR – Simple
Sequence Repeats) hay còn g ọi là tiểu vệ tinh (microsatellites marker), đa h ình
nucleotide đơn (SNP marker). Mỗi loại chỉ thị có nguyên tắc và phạm vi ứng dụng
khác nhau [39].
Ribosomal DNA là 1 gen bao gồm 3 đoạn gen: 18S, 5.8S, 28S và 2 đo ạn
chèn giữa gen đó là ITS1 (chèn gi ữa 18S và 5.8S), ITS2 (chèn gi ữa 5.8S và 28S)
[40]. 28S là đoạn gen lớn nhất của ribosomal DNA, có khả năng đặc tr ưng cho loài
nghiên cứu và được sử dụng trong các nghi ên cứu về di truyền. Trong thực tế người
ta thường sử dụng 1 đoạn gen và/hoặc 1 đoạn chèn giữa gen để làm chỉ thị trong
nghiên cứu, ví dụ X. Y. Wu, 2004, 2005; I.D.Whittington, 2004; …[45][45][47].
Năm 2004, Whittington và cs dùng đoạn gen 28S để nghiên cứu mối quan hệ
phát sinh loài của 17 loài thuộc họ Capsalidae (Monocotylidae và Udonellidae được
sử dụng làm nhóm ngoại). Kết quả cho thấy Capsalinae, Encotyllabinae,

tự nhiên
31
57,37±11,23
10,05±1,3
Cá Mú Đen
(Epinephelus coioides )
nuôi
38
603,13±289,2
32,45±4,5
tự nhiên
11
236±45,12
25,5±1,6
Cá Mú Mè
(E. bleckeri)
nuôi
7
247,5±67,24
22,8±4,17
Cá Mú Chấm Tổ Ong
(E. merra)
tự nhiên
27
50,1±9,6
15,6±2,49
Cá Mú Sọc Ngang
(E. fasciatus)
tự nhiên
19

o
Tách chiết DNA
Chạy PCR
Chạy điện di
Giải trình tự gen
Lập cây tiến hóa
Tổng hợp, so sánh các lo ài KST
Kết luận và đề xuất ý kiến
Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghi ên cứu
15
2.2.2. Xử lý và phân tích mẫu
- Đựng cá trong thùng xốp, vận chuyển về ph òng thí nghiệm và sục khí liên
tục cho tới khi tiến h ành kiểm tra, giải phẫu cá. Thao tác cân, đo cá nhanh đ ể cá
không bị khô nhớt. Ghi lại t ình trạng cá, địa điểm thu, số liệu cân, đo, v à ngày tháng
một cách chính xác.
- Tiến hành kiểm tra sán lá đơn chủ: đây là những KST ngoại ký sinh, chúng
thường có mặt trên mang, da, vây, m ắt, hốc mũi của cá nên cơ quan được kiểm tra
là mang, da, vây cá.
* Kiểm tra da, vây cá: quan sát bằng mắt th ường để phát hiện những KST có
kích thước lớn. Cạo nhớt da, chú ý cạo ở gốc vây, mắt và hốc mũi, dàn đều lên lam,
nhỏ nước biển sạch rồi đậy lamel quan sát trên kính soi n ổi (KSN) (hiệu Olympus
SZX9, số serial SZX9 – 3122) trước rồi sau đó quan sát ở kính hiển vi (KHV) (hiệu
Olympus BX41, số serial 2K07583) độ phóng đại tăng dần (từ 4X đ ến 40X). Nếu mẫu
cá to thì cạo nhớt vào hộp lồng đựng nước muối biển, đem quan sát dưới KSN. Khi
phát hiện sán lá đơn chủ thì thu mẫu làm tiêu bản để xác định cường độ cảm nhiễm.
* Kiểm tra mang: d ùng kéo cắt rời xương nắp mang cá, quan sát v à ghi lại
những dấu hiệu bất th ường ở mang. Sau đó, cắt rời từng cung mang bỏ v ào hộp lồng
đựng nước biển sạch, quan sát d ưới KSN. Lấy kẹp và kim giải phẫu vạch từng t ơ
mang để quan sát. Nếu phát hiện thấy KST, tách ri êng tơ mang có trùng đưa lên lam
kính và tách trùn g để quan sát dưới KHV. Định lượng trùng trên toàn bộ mang.

Số cá kiểm tra
* 100
Số trùng
CĐCN =
Cơ quan (hoặc bộ phận cơ quan)
a
b
Hình 2.2. Mô tả cách đo Monogenea (theo Justin, 2007) . A – cơ quan giao cấu đực
(a-chiều dài, b-chiều rộng), B – cơ quan giao cấu cái, C – móc bám lưng,
D – móc bám bụng, E – thanh nối lưng, F – thanh nối bụng.
IL – chiều dài phía trong, OL – chiều dài phía ngoài.
17
- Chụp hình và vẽ KST: trong quá trình soi t ươi hoặc quan sát tiêu bản có
thể kết hợp chụp h ình trùng bằng máy tính kết nối KHV (số serial: US00203669)
hoặc máy ảnh kỹ thuật số. Sau đó vẽ tr ùng (tốt nhất vẽ khi quan sát tr ên KHV vì có
thể nháy vi cấp để xem những nét khuất của hình ảnh).
2.2.5. Định danh
Các KST được định danh dựa v ào một số chỉ tiêu như sau: hình dạng, kích
thước cơ thể trùng, cơ quan giao c ấu đực, cái, các móc bám; kiểu đĩa bám; h ình
dạng, số lượng hàng gai, vị trí của giác bám (Theo một số bài báo liên qu an đăng
trên các tạp chí quốc tế nh ư Journal of Fish Disease, Systematic Parasitology) .
2.3. Phương pháp nghiên c ứu di truyền sán lá đ ơn chủ
2.3.1. Chuẩn bị mẫu
Sau khi thu thập, soi tươi, quan sát và phân lo ại sơ bộ KST dựa trên đặc điểm
hình thái, dùng pipet te thủy tinh hút riêng từng cá thể trùng vào tube Eppendorf 1.5
mL đã vô trùng có chứa 5 µl nước cất hoặc cồn tuyệt đối. Ghi etyket, giữ trong tủ
đông (-20 đến -70
o
C) đối với mẫu giữ trong n ước cất.
2.3.2. Phương pháp tách chi ết DNA

dd
= V/mẫu x (số mẫu + 1)
Bước 3: Ủ các tube mẫu ở 55 -56
o
từ 4-5 giờ hoặc qua đêm bằng máy ổn nhiệt
(heating block).
Bước 4: Lấy mẫu đã ủ ra, thêm vào mỗi mẫu 250 µL dung dịch (dd) đệm phân giải
(Lysis Buffer) Wizard
®
SV. Trộn đều dd trong tube bằng máy Vortex.
Bước 5: Quá trình phân gi ải diễn ra nhanh chóng sau khi th êm dd đệm phân giải.
- Tách chiết DNA từ dịch ta n (sử dụng máy ly tâm - Microcentrifuge)
Bước 6: Lắp tube hình trụ có màng lọc vào tube thu nhận sản phẩm thừa sau ly tâm.
Bước 7: Ly tâm phức tube 13000 v òng/phút trong 3 phút.
Bước 8: Nhấc ống hình trụ nhỏ ở bên trên ra, loại bỏ dung dịch trong ống thu ở
dưới. Đặt ống hình trụ nhỏ trở lại như cũ.
Bước 9: Thêm 650 µL dd r ửa (Wash Solution) Wizard
®
SV (đã pha với 95% cồn
theo hướng dẫn cuả nhà sản xuất) vào mỗi phức tube. Ly tâm 13000 v òng/phút
trong 1 phút. Loại bỏ dd ở ống thu. Lặp lại b ước này 2-3 lần.
Bước 10: Loại bỏ dd trong ống thu. Ly tâm 13000 v òng/phút trong 2 phút để làm
khô chất gắn trên màng lọc (binding matrix).
Bước 11: Chuyển ống hình trụ nhỏ sang tube Eppendorf 1,5 mL mới. Th êm 30 µL
dd Nuclease – Free Water ở nhiệt độ phòng. Ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 12: Ly tâm phức tube (minicolumn/elution assembly) vừa tạo 13000
vòng/phút trong 1 phút. Không lo ại bỏ dung dịch trong tube rửa trôi (elution tube).
Bước 13: Thêm một lần nữa 30 µL dd Nuclease – Free Water. Ủ 2 phút ở nhiệt độ
phòng. Ly tâm phức tube (minicolumn / elution tube) 13000 v òng/phút trong 2 phút.
Bước 14: Loại bỏ ống hình trụ nhỏ và lưu giữ tube chứa DNA tinh sạch trong tủ