BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI



TRẦN VĂN GIÁP
NGHIÊN CỨU XÁC ðỊNH CON LAI SOMA KHOAI TÂY,
ðÁNH GIÁ ðẶC ðIỂM SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ
KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VIRUS CỦA CHÚNG LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2011

i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, những số liệu và kết quả nghiên cứu
trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sư dụng ñể bảo vệ
một học vị nào.
Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận
văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn
ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, tháng 08 năm 2011
Tác giả Trần Văn Giáp
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
• AFLP-Amplified Fragment length polymorphism
• BC (Back cross)
• EBN-Endosperm balance number
• FDA-flouresencein diacetate
• ICTV–International Committee on Taxonomy of Viruses
• PEG-polyethylen glycol
• PLRV. Potato leafroll luteovirus PLRV
• PVA .Potato A potyvirus
• PVM. Potato M carlavirus
• PVM. Potato M carlavirus
• PVS. Potato S carlavirus
• PVV. Potato V potyvirus
• PVX .Potato X potexvirus
• PVY.Potato Y potyvirus
• SGAA-Steroidal Glycoalkaloid Aglycone
• SSR-Simple Sequence Repeat
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v

2.4 Các nghiên cứu về tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào
trần 25
2.4.1. Nghiên cứu về tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào
trần trên thế giới 25
2.4.2. Một số kết quả nghiên cứu dung hợp tế bào trần trên cây khoai tây ở
Việt Nam 31
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
3.1. ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 33
3.2 Nội dung nghiên cứu 35
3.3 Phương pháp nghiên cứu 36
3.4 Xử lý số liệu 44
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45
4.1 Kết quả ñánh giá ñộ bội của các dòng cây tái sinh 45
4.2 Kết quả xác ñịnh con lai soma bằng phương pháp isozym 47
4.3 ðánh giá các ñặc tính kháng virus PVX, PVY của con lai soma bằng
phương pháp chỉ thị phân tử 50
4.4 Kết quả ñánh giá khả năng sinh trưởng phát triển in vitro của con lai soma
tái sinh ñược 55
4.5 ðánh giá khả năng hình thành củ in vitro của con lai soma 60
4.6 ðánh giá khả năng sinh trưởng phát triển, hình thành năng suất của con lai
soma trong ñiều kiện in vivo 64
4.7 Một số chỉ tiêu hóa sinh ñánh giá chất lượng củ dòng 76, 79 và bố mẹ 76
4.8 ðánh giá khả năng kháng virus PVY thông qua phương pháp lây nhiễm
nhân tạo và test ELISA 77

Bảng 4.13 Kết quả test ELISA virus PVX trước khi lây nhiễm nhân tạo 79
Bảng 4.14 Vị trí các dòng khoai tây in vitro trong bản test ELISA PVX 79
Bảng 4.15 Kết quả test ELISA virus PVY trước khi lây nhiễm nhân tạo 80
Bảng 4.16 Vị trí các dòng khoai tây in vitro trong bản test ELISA PVY 81
Bảng 4.17 Kết quả test ELISA sau khi lây nhiễm virus PVY 82
Bảng 4.18 Vị trí các dòng khoai tây trong bản test ELISA PVY 83

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 4.1 Kết quả xác ñịnh ñội bội của mẫu nhị bội A15 46
Hình 4.2 Kết quả ñộ bội của các dòng con lai 46
Hình 4.3 Kết quả ñiện di isozym esterase của tổ hợp lai A16 và B186 48
Hình 4.4 Kết quả ñiện di isozym esterase của tổ hợp lai A15 và A41 49
Hình 4.5 Kết quả ñiện di isozym esterase của tổ hợp lai B186 và B208 50
Hình 4.6 Kết quả ñiện di PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu GM 339 52
Hình 4.7 Kết quả ñiện di PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu STM 003-111 53
Hình 4.8 Minh họa hình ảnh dòng 81-2 và bố mẹ trong in vitro 56
Hình 4.9 Minh họa dòng 76, 79 và bố mẹ in vitro 58
Hình 4.10 Minh họa dòng 21-1 và bố mẹ in vitro 59
Hình 4.11 Minh họa củ dòng 76, 79 và bố mẹ chúng 62
Hình 4.12 Minh họa củ dòng 21-1 và bố mẹ chúng 63
Hình 4.13 Minh họa củ dòng 81-2 và bố mẹ chúng 64
Hình 4.14 Con lai soma 81-2 và bố mẹ chúng (in vivo) 66
Hình 4.15 Dòng 76, 79 và bố mẹ chúng (in vivo) 67
Hình 4.16 Dòng 21-1 và bố mẹ (in vivo) 69
Hình 4.17 Hình ảnh củ của sau thu hoạch của các con lai 72

Khoai tây- Solanum tuberosum.L là một trong những cây lơng thực
có giá trị. Trên thế giới khoai tây đứng hàng thứ 5 về diện tích trong các loại
cây trồng làm lơng thực, thực phẩm và đứng thứ 4 về sản lợng.
ở nớc ta khoai tây là một cây trồng vụ đông quan trọng trong công thức
luân canh, lúa xuân - lúa mùa sớm - khoai tây. Là một cây trồng lý tởng cho
vụ đông của Đồng bằng Bắc Bộ.
Tuy nhiên hầu hết các giống khoai tây ở nớc ta đều cho năng suất thấp
và phẩm chất kém dần, nguyên nhân chủ yếu là do thoái hoá giống với hai tác
nhân là virus và sự già hoá của giống. Khắc phục đợc hiện tợng này sẽ góp
phần phát triển nền sản xuất khoai tây ở nớc ta.
Các phơng pháp chọn tạo giống khoai tây truyền thống chủ yếu nhờ
vào kỹ thuật lai tạo vấp phải những khó khăn về mặt di truyền cũng nh việc
chọn tạo sau lai. Chính bản chất tứ bội (2n=4x=48) của khoai tây làm cho
chơng trình chọn tạo giống gặp khó khăn và phức tạp hơn các cây trồng nhị
bội. Cùng với sự phát triển của Công nghệ sinh học thì công nghệ tế bào thực
vật mà cụ thể là công nghệ tế bào trần đ mở ra con đờng để khắc phục các
hiện tợng này, nó đ đợc Wenzel (1979)(57) đề xuất thông qua sơ đồ (phụ
lục 14). Bằng cách giảm độ bội xuống monoploid sau đó chọn lọc cá thể
lỡng bội diploid và cuối cùng là dung hợp tế bào trần hai tế bào thể diploid
đ chọn lọc để tạo giống khoai tây mong muốn. Sau quá trình dung hợp việc
xác định thể lai và tái sinh các thể lai có ý nghĩa này thành cây hoàn chỉnh từ
đó nhân thành giống mới có khả năng kháng virus.
Trờn th gii cú khỏ nhiu cụng trỡnh nghiờn cu v to ging khoai tõy
khỏng virus bng dung hp t bo trn. N.Fish, A.Karp and M,G.K.Jones
(1988)(40) nghiờn cu dung hp t bo trn bng phng phỏp xung ủin

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 2

3

- Xác ñịnh ñược ñộ bội con lai thông qua phương pháp Flow
Cytometry.
- Xác ñịnh con lai bằng kỹ thuật Iso enzym.
+ ðánh giá con lai
- ðánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển, tạo củ in vitro.
- ðánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển, hình thành năng suất
ñồng ruộng.
- ðánh giá các chỉ tiêu hóa sinh.
- ðánh giá khả năng kháng virus PVY của con lai soma, các
dòng bố mẹ bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo và test ELISA.
- ðánh giá khả năng kháng virus (PVX, PVY) của con lai soma,
các dòng bố mẹ bằng phương pháp chỉ thị phân tử.
1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài
1.3.1 Ý nghĩa khoa học
Việc nghiên cứu xác ñịnh chính xác con lai soma, và ñánh giá các ñặc
ñiểm nông sinh học, tính chống chịu virus ñể chọn lọc ra các dòng triển vọng
phát triển thành các giống khoai tây có phẩm chất tốt, chống chịu virus là rất
cần thiết và cấp bách, là cơ sở ñể hoàn thiện quy trình tạo giống khoai tây
kháng bệnh virus bằng dung hợp tế bào trần.
1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn
ðề xuất thử nghiệm ñánh giá diện rộng các con lai soma trên ở các ñặc
tính kháng bệnh và năng suất, nhằm tuyển chọn các dòng thích hợp nhất phát
triển thành giống sản xuất. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây
2.1.1 Nguồn gốc
Nghiên cứu tuổi cacbon phóng xạ cho thấy khoai tây ñược trồng ít nhất
8.000 năm về trước trên bình nguyên ðông Nam Peru và Tây Bắc Bolivia
(Nguyễn Văn Hiển, 2000)(4). Nhiều cuộc thám hiểm của Liên xô (cũ) trước
ñây ñã xác nhận rằng: Trung tâm thứ 2 của khoai tây có nguồn gốc ở Mexico
và hiện nay người ta còn bắt gặp rất nhiều khoai tây dại ở ñây (Hồ Hữu An,
2005)(1).
Trong các loài hoang dại họ hàng thì phức hợp S. canasense/S.
Leptophys có mối quan hệ gần gữi nhất với các loài khoai tây trồng nhị bội.
Phức hợp S. tenotomum/S. phureja là dạng nguyên thủy nhất trong các loài
khoai tây trồng nhị bội (Nguyễn Văn Hiển, 2000)(4).
Tuy nhiên loài khoai tây trồng trọt là S. tuberosum là một loài tứ bội.
Các giống này ñược du nhập vào Châu Âu năm 1570. Và sau ñó lan rộng ra
khắp thế giới. Hiện nay ñã có tới 151 nước trồng khoai tây (Hồ Hữu An,
2005)(1).
Khoai tây ñược du nhập vào Việt Nam từ năm 1890 và chủ yếu ñược
trồng ở ñồng bằng Sông Hồng (Nguyễn Quang Thạch, 1993)(10). Khoai tây
ñược trồng trong 11 công thức luân canh với lúa và rau màu trong hệ thống
canh tác ở ñồng bằng Sông Hồng (ðỗ Kim Chung, 2003)(2). Diện tích khoai
tây tăng từ 25.748 ha vào năm 1992 tới 35.000 ha vào niên vụ 2002 – 2003
(ðỗ Kim Chung, 2003)(2). Mức tiêu thụ khoai tây hàng năm ở nước ta
khoảng 555.827 tấn. Năng suất khoai tây có tăng dần nhưng chậm, dao ñộng
từ 10 – 12 tấn/ha (Hồ Hữu An, 2005)(1).

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
7

sương mai.
• Nhóm 3: Tetraploid: 2n = 4x = 48.
Có 1 loài là : S. tuberosum L. Và 2 loài phụ là :
Subspecies tuberosum
Subspecies Andigena (juz. Et Buk) Hawkes
• Nhóm 4 : Pentaploid: 2n = 5x = 60.
Có 1 loài là : S. x curtilobum juz et Buk.
2.1.3 ðặc ñiểm thực vật học
* Rễ:
Khoai tây trồng từ củ giống chỉ phát triển rễ chùm, có rễ cọc khi trồng
bằng hạt, từ rễ cọc phát triển nhiều rễ phụ khác.
Ở các thân ngầm dưới mặt ñất (còn gọi là tia củ) cũng có khả năng ra
rễ, nhưng rễ ngắn và ít phân nhánh. Bộ rễ phân bố chủ yếu trên ñất canh tác 0
– 40 cm, nhưng cũng có rễ ăn sâu tới 1.5 – 2m. (Tạ Thu Cúc, 2007)(3).
* Thân:
Thân khoai tây mọc thẳng, ñôi khi có cấu tạo zích zắc, có 3-4 cạnh,
cao trung bình từ 40-70cm ñến 1-1,2m. Phụ thuộc vào giống, thời kỳ chăm
sóc… mà chiều cao cây có thể khác nhau. Thân thường có màu xanh hoặc
xanh nhạt hay ñậm, ñôi khi có màu phớt hồng hoặc tím…tùy thuộc vào giống.
* Lá:
Lá hình thành và hoàn thiện theo sự tăng trưởng của cây, bản lá to, lá
kép xẻ lông chim, có 3 – 7 ñôi mọc ñối xứng qua trục và một lá lẻ trên cùng
thường lớn hơn gọi là lá chét ñỉnh, màu sắc lá phụ thuộc vào giống, thời vụ,
ñiều kiện chăm sóc mà có thể màu xanh, xanh ñậm hoặc xanh nhạt, … Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………



Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 9

dễ trồng, dễ mọc, không ñắt, chất lượng cao, phong phú về giá trị sử dụng:
chế biến ñược nhiều món ăn, làm thuốc chữa bệnh (bệnh viêm loét dạ dày,
hành tá tràng, bệnh thần kinh, bỏng, quai bị ).
Khoai tây còn là cây dễ thích nghi, năng suất cao, thích ứng với chi phí
ñầu vào thấp. Mọi bộ phận trên củ khoai tây ñều có giá trị dinh dưỡng.
Theo nguồn: United States Department of Agriculture, National
Nutrient Database, 2008 cho biết thành phần dinh dưỡng trong 100 gam củ
khoai tây sau khi luộc cả vỏ và nướng

Bên cạnh giá trị lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc, khoai tây còn
là nguồn nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp (Nguyễn Quang Thạch,
1993)(10), nguyên liệu trong ngành dược phẩm, cũng như sử dụng khoai tây
làm mỹ phẩm (ðỗ Kim Chung, 2003)(2). Do ñó khoai tây ñược khẳng ñịnh là
rất quan trọng ñối với con người.
2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và trong nước.
2.2.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới
Vào thế kỷ XIX, khoai tây thực sự ñược trồng phổ biến ở các châu lục
với khoảng 151 nước. Ngày nay, khoai tây ñược trồng chủ yếu ở khu vực

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 10
Châu Á, Châu Âu cho năng suất và sản lượng lớn. Số liệu ñược thể hiện qua


Qua bảng 2.1 cho thấy, diện tích trồng khoai tây ở khu vực Châu Á lớn
nhất khoảng 8.732.961 (ha), thứ hai là khu vực Châu Âu với diện tích
7.473.628 (ha) và khoai tây ñược trồng ít nhất ở Bắc Mỹ vào khoảng 615.878
(ha). Tuy nhiên ở Bắc Mỹ lại cho năng suất khoai tây lớn nhất ñạt 41,2
(tấn/ha) tương ứng với sản lượng ñứng thứ 3 ñạt 25.345.305 (tấn), Châu Á
cho sản lượng khoai tây cao nhất ñạt 137.343.664 (tấn), năng suất khoai tây
ñứng thứ 2 khoảng 17,4 (tấn/ha), Châu Âu ñứng thứ 3 về sản lượng và năng
suất tương ứng là 15.682.943 (tấn), 16,3 (tấn/ha).
Khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ sau ñó mở rộng sang các nước
phát triển. Vậy tại sao hiện nay khoai tây ñược trồng chủ yếu ở những nước

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 11
ñang phát triển? Theo các chuyên gia nhận ñịnh: Khoai tây chính là cây lương
thực của tương lai dành cho những nước nghèo và nước ñang phát triển “ Khi
giá lúa gạo và lúa mỳ tăng lên, lúc này khoai tây ñược phát hiện là nguồn cây
trồng giàu dinh dưỡng cho những nước ñó với giá rất rẻ ” (FAO 2006). Mặt
khác “Khoai tây là cây trồng tạo ra khối lượng sinh học và năng lượng nhiều
hơn bất kỳ một loại cây trồng lương thực nào (trừ lúa gạo, ngô, lúa mỳ) trong
thời gian ngắn trên cùng một ñơn vị diện tích” (FAO 2005)
Do ñó, khoai tây chính là cây trồng giàu tiềm năng phát triển trong
tương lai, với diện tích trồng ngày càng ñược mở rộng và năng suất, chất
lượng khoai tây ngày càng tăng, nhất là ở các nước ñang phát triển cộng với
những nước nghèo.
Bảng 2.2. Sản lượng khoai tây trên thế giới giai ñoạn 1991 – 2007 (triệu
tấn) (FAOSTAT)
Năm

108,50

128,72

135,15

145,92

152,11

160,01

165,41

Thế
giới
267,99

301,26

285,97

303,35

301,08

312,85

313,08


và một số ñịa phương khác giảm rõ rệt, nguyên nhân là do thiếu nguồn giống
tốt.
Vấn ñề khó khăn nhất hiện nay ñối với ngành sản xuất khoai tây ñó là
giống. Hiện giống khoai tây ở trong nước mới chỉ ñáp ứng từ 20 - 25% nhu
cầu, số còn lại phải nhập khẩu từ Trung Quốc, Hà Lan…
Hiện nay, giống khoai tây mà người dân sử dụng hầu hết do nông dân tự

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 13
duy trì từ vụ này sang vụ khác hoặc giống do người dân tự mua không rõ
nguồn gốc, do vậy mà giống không những bị thoái hóa mà còn có tỷ lệ nhiễm
virus cao từ 54 – 65% cộng với hao hụt trong bảo quản từ 45 – 60%. Khoai tây
trồng chủ yếu bằng con ñường nhân giống vô tính nên tỷ lệ tái nhiễm virus cao.
Hơn nữa trong ñiều kiện sản xuất ở Việt Nam, củ giống bảo quản trong thời
gian dài khoảng 9 tháng (từ tháng 2 – tháng 10), ñiều kiện nóng ẩm của mùa hè
củ giống bị già sinh lý nhanh chóng, khi trồng khả năng sinh trưởng kém, hậu
quả là năng suất và chất lượng củ thấp.
Mặt khác việc sản xuất và cung ứng giống khoai tây ở Việt Nam còn nhỏ
lẻ, chưa mang tính hệ thống. Trước tình hình ñó cần xây dựng các chương trình
nhân tạo giống khoai tây sạch bệnh, có chất lượng và phẩm chất tốt phục vụ bà
con nông dân.
2.3 Bệnh virus hại khoai tây và biện pháp khắc phục
Như chúng ta ñã biết, khoai tây là loại cây trồng rất dễ bị tấn công bởi
một số tác nhân gây bệnh: Virus (PVX, PVY, PLRV, LR, S, M, A, PSTVD), vi
khuẩn (Ralstonia solanacearum), nấm (Phytophthora infestans), nhóm ngành
giun tròn (nematodes-bệnh do tuyến trùng), và một số loại bệnh khác…
2.3.1 Tìm hiểu về virus hai khoai tây
Theo Ross (1961)(49) , khoai tây là ký chủ của khoảng 33 loài virus. Ông

(PVY)
Potato A
potyvirus
(PVA)
Potato V
potyvirus
(PVV)
Potato X
potexvir
us
(PVX)
Potato
M
carlaviru
s (PVM)

Potato S
carlaviru
s (PVS)
Mã
ICTV
39.0.0.1.
0.012
57.0.1.0.
058
57.0.1.0.
056
57.0.1.05
7
56.0.1.0.


Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 15
phát hiện ở Eire năm 1932. Trong nhóm này phát hiện có 2 dòng chính: Dòng
A1 cảm ứng phản ứng siêu nhạy ở loài S. tuberosum.cv King Edward, ngược
lại dòng A2 thì không (Valkonen et al.1992)(53). Virus này gây hại giảm
năng suất trên 50% .
• PVX – phát hiện ở Anh bởi Smith (1931). Theo Cockerham (1955);
Valkonen et al.(1996)(53) PVX ñược chia thành 4 nhóm dựa trên phản ứng
của gen trội tạo HR: PVX1, PVX2, PVX3, PVX4, ngoài ra mới phát hiện
PVXHB. Gây giảm năng suất từ 10 - 25%.
• PVV – Rozendaal phát hiện ở Nertherlands năm 1971, gây hại nhiều ở
Châu Âu và Nam Mỹ, không có sự phân chia thành các nhóm. Qua phân tích
Cp (Coat protein) chỉ ra isolate ở Châu Âu có sự cảm ứng HR ở loài S.
tuberosum cv Pentland Dell.
• PVM – Schltz và Folson phát hiện năm 1923 tại Mỹ, khá phổ biến và
gây ra vài triệu chứng lạ. Theo Konovalov (1986), Vũ Triệu Mân (1986)(7)
cho biết hai giống khoai tây ở Nga ñã bị nhiễm virus PVM làm giảm năng
suất tới 60-70%.
• PVS – ðược De Bruyn ouboter phát hiện ở Nertherlands năm 1952,
gây hại ít làm giảm năng suất từ 10-15% thường gây hại khi kết hợp với các
virus khác.
2.3.2 Tác hại của bệnh virus
Virus khoai tây ñược ñánh giá là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm,
làm giảm ñáng kể năng suất và chất lượng củ. Bởi bệnh virus có những ñặc
tính sau:
- Là bệnh không chữa ñược khi ñã bị nhiễm. Do virus khi xâm nhiễm
vào cây trồng chúng không có sự trao ñổi chất riêng và ñộc lập mà phải sử