Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH TỪ NẤM TRICHODERMA
1. Giới thiệu
1.1 Lịch sử ra đời của sản phẩm:
Trong tự nhiên, đất chứa nhiều vi sinh vật sống chung với nhau. Trong thời gian gần đây,
người ta thường bàn nhiều đến Trichoderma và các công dụng của nó trong lĩnh vực phân
bón vi sinh. Tuy nhiên Trichoderma không phải mới được phát hiện và ứng dụng gần đây
mà khoảng 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện đầu tiên bởi Persoon vào năm
1794, vào thời điểm đầu tiên này ông đã mô tả được 3 loài: Trichoderma caesium Pers.
T.nigrescens Pers, T.viride var. viride Pers. Cho đến năm 1801 Persoon và Gray đã mô tả
chi tiết thêm 4 loài nấm Trichoderma đó là: T. aureum Pers (1796), T. laeve Pers (1796),
T. dubium Pers (1801), T. fuliginoides Pers (1801). Trong suốt 2 thế kỹ tiếp theo đến năm
1999 các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện thêm khoảng 90 loài. Từ năm 2000 trở
lại đây đã phát hiện thêm khoảng 50 loài mới. Cho đến hiện nay (2013) đã có trên 150
loài nấm Trichoderma được mô tả.
Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã nghiên cứu và
khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của Trichoderma. Và những ứng dụng về phân
giải cellulose của chúng. Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là
khả năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm
bệnh giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp.
Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế
giới.[2],[3]
1.2 Giới thiệu chung về sản phẩm phân bón vi sinh từ nấm Tricoderma và cơ chất mà
chúng sử dụng:
Trichoderma vừa có khả năng phân hủy cellulose vừa có khả năng đối kháng lại các loài
nấm gây bệnh ở thực vật nên việc dùng Trichoderma trong phân bón là lựa chọn tốt vừa
bảo vệ được cây trồng, tăng thêm thu nhập, giảm chi phí đầu tư và bảo vệ môi trường.
Cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp nhiều nhất trên thế giới hiện nay, có khoảng từ 60
đến 90 tỷ tấn. Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 1
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương

Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 2
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
• Có phổ đối kháng rộng trên các loài nấm gây bệnh trên cây trồng
• Sử dụng nhiều cơ chế để kháng lại các vi sinh vật gây bệnh
• Tồn tại lâu dài trong đất nhờ khả năng tự sản sinh ra bào tử [3]
2. Nội dung:
2.1 Tìm hiểu về chủng nấm Trichoderma:
2.1.1 Giới thiệu về chủng nấm Trichoderma:
Trichoderma có những loài như T. harzianum, T. viride, T. koningii, T. hamatum …. Nấm
Trichoderma hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống
khác. Chúng là loại nấm được nuôi cấy thông dụng nhất. Chúng hiện diện với mật độ cao
và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ.
Những giống này có thể được bổ sung vào trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương
pháp. Ngay khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc
vào từng giống. Vì vậy, khi được dùng trong xử lý hạt giống, những giống thích hợp nhất
sẽ phát triển trên bề mặt rễ ngay cả khi rễ phát triển dài hơn 1m phía dưới mặt đất và
chúng có thể tồn tại, còn hiệu lực cho đến 18 tháng sau khi sử dụng, ví dụ như các loài T.
viren , T. flavofuscum, T. harzianum, T. viride, T. koningii, T.hamatum,… Tuy nhiên,
không có nhiều giống có khả năng này.[4]
Ngoài sự hình thành khuẩn lạc trên rễ, nấm Trichoderma còn tấn công, ký sinh và lấy
chất dinh dưỡng từ các loài nấm khác. Bởi vì nơi Trichoderma phát triển tốt nhất là nơi
có nhiều rễ khỏe mạnh, vì Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế cho việc tấn công các loài
nấm gây bệnh cũng như cơ chế cho việc nâng cao sự sinh trưởng và phát triển của cây.
Nhiều phương pháp mới trong kiểm soát sinh học và nâng cao sự sinh trưởng của cây
hiện nay đã được chứng minh rõ ràng. Quá trình này được điều khiển bởi nhiều gen và
sản phẩm từ gen khác nhau. Sau đây là một số cơ chế chủ yếu: Ký sinh nấm, kháng sinh,
cạnh tranh chất dinh dưỡng và không gian; sự chịu đựng các điều kiện bất lợi bằng việc
gia tăng sự phát triển của cây và rễ; làm hòa tan và cô lập chất dinh dưỡng vô cơ, cảm
ứng sự kháng bệnh, bất hoạt enzyme gây bệnh. [4]
Hầu hết các giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào đó là cơ chế sinh

(giai đoạn 1). Enzyme định hướng vị trí liên kết dễ phân giải trên bề mặt cơ chất (giai
đoạn 2). Hình thành phức hệ enzyme - cơ chất ( giai đoạn 3 ). Thủy phân liên kết β-
glycosidic nhờ β- glucosidase là một phần nhỏ trong số các protein ngoại bào do T.reesei
tiết ra. β- glucosidase nội bào hoặc gắn kết với màng tế bào cũng được nhiều tác giả
nghiên cứu. Song mối quan hệ chính xác về gen và sinh hóa giữa các enzyme này chưa
được làm sáng tỏ ( giai đoạn 4 ). Giải hấp của cellulase từ các chất nền hoặc lặp lại bước
4 hoặc 2/3 các bước nếu chỉ có lĩnh vực xúc tác tách ra từ dây chuyền (giai đoạn 5). [5]
Thủy phân cellobiose tạo thành glucose bởi β-glucosidase. Ngoài ra, sản phẩm ức chế và
sự biến đối cơ chất cùng với quá trình thủy phân thì ảnh hưởng tới các bước trên (giai
đoạn 6). [5]
2.2.3 Những cải tiến của chủng Trichoderma:
2.2.3.1 Nâng cao khả năng sản xuất cellobiohydrolases ( CBH ) ở chủng T.reesei
2.2.3.1.1 Khuếch đại biểu hiện cbhl bằng cách tăng số bản sao gen cbhl:
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 5
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Plasmid pALK496 đã được xây dựng và chuyển vào nấm T. reesei ALK02221 để tăng số
lượng bản sao của gen cbhl.
Hình 2.2 Plasmid pALK496 sử dụng cho biến đổi chủng ALK02221 nhằm sản xuất
lượng lớn CBHI [Kelly và Hynes, 1985].
Các chủng biến đối được khảo sát khả năng tống hợp cellulase bằng phương pháp filter
paper-hydrolyzing activity (FPU). So với chủng chủ ALK02221, lượng CBHI tăng 1.5
lần ở chủng ALK03760, 1.4 lần ở chủng ALK03862 và 1.3 lần ở chủng ALK03761 (bảng
2.1). Ngoài ra, những thay đối trong số lượng của CBHII và EGI đã được tìm hiếu, số
lượng CBHII giảm 25% ở chủng ALK03760 và chủng ALK03862, nhưng ở chủng
ALK03761 lượng CBHII đã tăng 15% so với chủng chủ ALK02221. Đáng ngạc nhiên, số
lượng EGI giảm 30% và 40% trong ALK03760 và chủng ALK03862 so với chủng chủ
ALK02221, mặc dù các gen egll được giữ nguyên vẹn trong bộ gen. Mức độ tiết ra các
protein tăng lên so với chủng chủ.[5]
Bảng 2 1: Sản xuất cellulase bởi chủng chủ ẢLK02221 và bởi chủng đã biến đồi
ALK03760, ALK03862, ALK03761.

T.reesei VTT-D-79125 là chủng đột biến sản xuất lượng lớn cellulase gồm EGI/II,
CBHI/II. ALK02698 là chủng sản xuất lượng lớn EGI không chứa gen cbhl- được thay
thế bởi casset biểu hiện egl1. Vì vậy, hai chủng này được sử dụng như thể nhận plasmid
nhằm tạo chủng biến đổi có khả năng sản xuất lượng lớn EGII. Endoglucanase sản xuất
bởi chủng biến đổi EGII liên quan đến số lượng bản sao của casset biểu hiện egl2. Chủng
T.reesei sản xuất lượng lớn EGI/II và không tổng hợp CBHI/II được xây dựng bằng cách
thay cbh2 bằng gen egl2.[5]
Các chủng được biến đổi nhờ vào pALK537 và pALK540. pALK537 gồm promoter cbhl
kich thước 2.2 kb và đoạn Avall của vùng kết thúc cbhl có kích thước 0.7 kb. pALK540
chứa promoter cbhl, nhân tố kết thúc và egl2 như trong pALK537.[5]
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 9
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Hình 2.5: Sơ đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid pALK537. egl2 được nối với
promoter cbhl. Đoạn Notl 9.2 kb thì được tách ra từ plasmid để thực hiện biến đổi.
Hình 2.6: Giới hạn của plasmid pALK540. Đoạn Clal-Pvul 11.6 kb thì được tách ra từ
plasmid đế thực hiện biến đối.
Biến đối chủng T.reesei: đế gen egl2 biếu hiện cho lượng lớn EG, promoter mạnh của gen
cbhl được dùng nhằm điều khiển biểu hiện gen egl2. Tương tự như nghiên cứu trình bày
phần trên, các chủng biến đối được phân tích bằng Southern Blot nhằm xác định số lượng
bản sao của egl2.[5]
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 10
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Hình 2.7 Southern blotting của chủng ALK03530 và ALK03574.
Chủng ALK03574 chứa 1 bản sao egll trong pALK537 tại locus cbhl trong khi chủng
ALK03530 chứa 2 bản sao egll tại cùng vị trí. Hơn nữa, lượng EGI, CBHI/II cũng được
phân tích cụ thể.[5]
2.2.3.3 Nâng cao khả năng sản xuất endoglucanases ( EG) ở chủng T.reesei bằng
cách nhân bản và biểu hiện gen khác loài:
Nhân bản gen cellulase từ Melanocarpus albomyces và biểu hiện chúng ở T.reesei do
nhiều nghiên cứu tìm thấy ở M. albomyces có 3 gen hiệu quả sản xuất cellulase đó là

2
O, KH
2
PO
4
, MnSO
4
.4H
2
O, URE, ZnSO
4
.7H
2
O, CaCl
2
, COCl
2
,
MgSO
4
.7H
2
O, Ceululase: 0,75-1% , Pepton: 0,075-0,1%, pH lúc đầu: 5,0-6,0.[2]
Trong đó, nguồn ceululase trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến sự hình
thành cellulase. Nhiều nghiên cứu cho biết cellulase là nguồn cacbon C thích hợp nhất
đối với sự tổng hợp cellulase; Pepton làm kích thích việc tạo thành cellulase.[2]
Nitrat là nguồn nitơ thích hợp đối với việc tổng hợp cellulase. Tuy nhiên muối Amon có
thể làm ức chế sự tổng hợp của cellulase (nguyên nhân do làm giảm pH của môi trường
dẫn đến việc làm bất hoạt cellulase hoặc làm cố định enzym lại trong sợi nấm).
T. viride có thể tổng hợp cellulase rất tốt khi nuôi cấy trên hổn hợp cám tiểu mạch: mùn

2
: 2mg/l,0020, Pepton: 0,1% [2]
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 12
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
2.3.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên hình thái của Trichoderma và khả
năng sản xuất enzyme cellulase:
Qua việc nghiên cứu chủng T. reesei đã xác định hình thái của nấm ảnh hưởng đến khả
năng sản xuất cellulase ở T. reesei nuôi cấy trong môi trường lactose và lactobionic acid
kiểu fed-batch trong bồn bioreactor 7 lít. Khi cho cellulose vào dịch chiết nấm men từ
môi trường nuôi cấy đã cho hiệu suất sản xuất enzyme cao nhất với thế tích enzyme có
hoạt tính 69.8U/L.h, và sinh khối nấm men cực đại là 14.7g/l . Những phát hiện này kèm
theo đặc điểm hình thái của nấm: tổng sợi nấm là 98% tổng diện tích ước lượng, với
chiều dài sợi nấm 10mm, thể tích 45.1 mm
3
, đường kính 7.9mm, số lượng nhánh 9, và số
lượng đỉnh mỗi sợi nấm là 29. Một sự tương quan rõ ràng đã được tìm thấy giữa các sợi
nấm, số lượng đỉnh và khả năng sản xuất enzyme cellulase.[5]
2.2.3 Ảnh hưởng qua lại giữa pH và cơ chất trong môi trưòng nuôi cấy đến khả
năng sản xuất cellulase.
Nghiên cứu được thực hiện trên chủng T.reesei:
Mỗi cơ chất và mỗi vi sinh vật nhất định thích hợp ở 1 pH khác nhau và ảnh hưởng tới
sản lượng của sản phẩm. Theo báo cáo của Andreotti et al thì T.reesei sinh trưởng tốt nhất
trong môi trường nuôi cấy ở pH =5 và hơi chậm ở pH 4.5 và 4. Tuy nhiên, Chahal et ai.
cho thấy rằng T.reesei sản xuất cellulase tối ưu ở pH=6.0.[5]
Với cơ chất là α -cellulose (chứa 99,9% cellulose) thì hoạt tính của T.reesei tối ưu tại pH
5.0. Sản lượng cellulase thấp ở pH 3.0 và 7.0. Tuy nhiên, trong các tài liệu công bố trước
thì pH 3.0, pH 4,0; và pH 5,0 cho sản lượng cellulase cao của nấm T. reesei. Trong một
thử nghiệm khác , khi pH 5,0 ± 0.05, lượng cellulase đạt 4 IU / ml trong vòng 91h. [4]
Với cơ chất là CTMP (chứa 60% cellulose, và phần còn lại là hemicelluloses và lignin)
thì hoạt tính của T.reesei tối ưu ở pH 6.0.

trình nuôi cấy phải khuấy và cung cấp ôxy bằng cách sục khí liên tục. [6]
Ưu điểm [1],[6]:
- Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyền.
- Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho một đơn vị sản phẩm thấp.
- Dễ tổ chức được xí nghiệp có sản lượng lớn.
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 15
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
- Các thiết bị lên men chìm dễ cơ khí hoá, tự động hoá.
Nhược điểm: [1], [6]
- Đòi hỏi trang bị kĩ thuật cao, dễ bị nhiễm trùng toàn bộ. Vì vậy, những thiết bị
lên men chìm cần phải chế tạo đặc biệt cẩn thận, chịu áp lực cao, đòi hỏi kín và
làm việc với điều kiện vô trùng tuyệt đối (trong nuôi cấy bề mặt có thể loại bỏ
phần đã nhiễm trùng, các phần khác vẫn còn dùng được).
- Trong lên men chìm cần phải khuấy và sục khí liên tục vì vi sinh vật chỉ sử dụng
được ôxy hoà tan trong môi trường. Khí được nén qua một hệ thống lọc sạch tạp
trùng, hệ thống này tương đối phức tạp và dễ gây nhiễm cho môi trường nuôi cấy.
Xử lí sinh khối:
Nấm Trichoderma khi đưa phế phẩm nông nghiệp thường ở dạng bột. Đây là dạng
dễ bảo quản, thời gian bảo quản được lâu hơn vì vậy sau quá trình lên men ta cần
xử lý lọc, ly tâm để làm giảm tỉ lệ nước trong sinh khối đến mức tối đa, sau đó sấy
khô ở nhiệt độ 35˚C.[1]
2.3.2 Sử dụng sinh khối tạo phân vi sinh từ nguồn phế phẩm nông nghiệp bao gồm
rơm, rạ:
Quy trình sản xuất [4]:
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 16
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
a, Cơ chất [8]:
Dùng cho sản xuất 1 tấn phân hữu cơ vi sinh
- Phế phẩm nông nghiệp: trấu rơm, thân cây đậu, bí, lạc 2,5-3 m
- Than bùn (nếu có) hoặc bùn ao phơi khô 200 kg

Ta có thể khuấy chế phẩm sinh học trong nước rỉ đường chảy loãng ( 0,5-1 lít đường
chảy/ 100 lít nước + 1-2kg ure) để khoảng 24h phối hợp sục khí để tăng khối vi sinh rồi
sau đó dùng nước này phun đều lên đống ủ.
Nếu không có nước gỉ mật hoặc mật mía thì có thể dùng các phụ phẩm vỏ quả chín, quả
chuối chín nẫu ngâm vào nước thay thế, ngâm trước khi ủ phân 2-3 ngày.
Rắc thêm vào đó vài nắm cám gạo hoặc bột sắn làm dinh dưỡng ban đầu cho vi sinh vật
hoạt động(2-3kg). [9]
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 18
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
Thêm vôi vào đông ủ giúp chất hữu cơ phân hủy nhanh hơn, làm giảm ngộ độc hữu cơ ở
đất, giữ chất mùn (từ sự phân hủy chất hữu cơ) không bị rửa trôi và giảm được mùi hôi
và các khí gây ô nhiễm môi trường thoát ra khi dở đống ủ. [9]
Ngoài ra sử dụng các nguồn cơ chất mới như phân thỏ, nước thải thủy sản, …
b, Tiến hành
- Bước 1: Chọn nơi ủ.
Địa điểm ủ nên thuận tiện cho việc ủ và vận chuyển sử dụng. Nền chỗ ủ bằng đất nện
hoặc lát gạch hoặc láng xi măng, nền nên bằng phẳng hoặc hơi dốc. Nếu nền bằng phẳng
nên tạo rãnh xung quanh và hố gom nhỏ để tránh nước ủ phân chảy ra ngoài khi tưới quá
ẩm. Có thể ủ trong nhà kho, chuồng nuôi không còn sử dụng để tận dụng mái che. Nếu ủ
trong kho phải có thoát nước. Để ủ 1 tấn phân ủ cần diện tích nền khoảng 3 m
2
.
- Bước 2: Chuẩn bị nguyên liệu: như trên
- Bước 3: Chuẩn bị dụng cụ.
Bình tưới ô doa (loại bình dùng để tưới rau), cào, cuốc, xẻng, rành. Vật liệu để che đậy,
làm mái: Có thể dùng các loại vật liệu sẵn có như bạt, bao tải, nilon che đậy và các loại
lá để làm mái tránh mưa, ánh nắng và giữ nhiệt cho đống ủ
- Bước 4: Tiến hành ủ.
Các chế phẩm nông nghiệp: rơm rạ, bèo tây, và cỏ phải được băm nhỏ, chặt khúc với độ
dài không quá 10-15cm, phơi khô. Các thành phần nguyên liệu trên được phối trộn ơ

nước rịn qua kẽ tay là đạt ẩm khoảng 50 %, nếu nước chảy ra là quá ẩm, xòe tay ra thấy
vỡ là quá khô.
+ Sau ủ 15-20 ngày nên đảo đống phân ủ. Đối với các loại nguyên liệu khó phân hủy như
thân cây ngô, rơm rạ cứ sau 20 ngày đảo 1 lần.
c. Cách dùng:
Thời gian ủ dài hay ngắn tuỳ theo loại nguyên liệu và mùa vụ, kéo dài từ 1-4 tháng. Khi
kiểm tra thấy đống phân màu nâu đen, tơi xốp, có mùi chua nồng của dấm, thọc tay vào
đống phân thấy ấm vừa tay là phân đã hoai mục (chín hoặc ngẫu), hoàn toàn có thể đem
sử dụng. Phân dùng không hết nên đánh đống lại, che đậy cẩn thận hoặc đóng bao để
dùng về sau. Phân ủ xong sử dụng tốt nhất trong vòng 1 năm và hiệu quả sử dụng đạt cao
nhất trong một tháng khi phân ngẫu.
Phân ủ chủ yếu dùng để bón lót cho các loại cây trồng, có thể sử dụng bón thúc đối với
các loại rau và hoa. Cách bón tương tự như bón phân hữu cơ truyền thống khác. [8], [9].
Đề tài sản xuất phân bón vi sinh từ nấm Ttrichoderma Trang 20
Bài tập nhóm vi sinh 2 GVHD: Phạm Thị Hương
3. HƯỚNG PHÁT TRIỂN
Hiện nay, có nhiều trung tâm nghiên cứu tại việt nam đã sản xuất thành công chế phẩm
sinh học Trichoderma phục vụ cho mục đích thương mại hóa. Sản phẩm mua bán trên thị
trường đa dạng và phong phú, nhưng giá của sản phẩm vẫn còn khá cao.
Một sản phẩm [10]
Để giúp Tricoderma đến tay người nông dân ,cần phải làm chủ được quy trình công nghệ
sản xuất chế phẩm sinh học này, cải tiến cả về giống lẫn quy trình sản xuất để giảm giá
thành, nâng cao hiệu suất.
Đa số việc tạo phân vi sinh loại này đều dựa trên nguồn nguyên liệu tại mỗi địa phương,
tức là có sự phân bố rải rác nguyên liệu, ví dụ các vùng sản xuất nông nghiệp như đồng
bằng Sông Hồng hay đồng bằng sông Cửu Long thì lượng rơm rạ thì có lượng khá lớn, có
thể tập trung sản xuất, còn dọc ven biển các tỉnh miền trung thì có những diện tích sản
xuất trung bình và nhỏ. Từ đó có thể thấy, việc chuyển giao công nghệ cho người nông
dân tự làm chủ để thực hiện sản xuất phân với quy mô trung bình và nhỏ là thích hợp
nhất.[10]