B Công Thng
Trng i Hc Công Nghip Thc Phm

BÀI TIU LUN

 
!"# "$
GVHD: Nguyn Th Qunh Mai
Danh sách thành viên :
Nguyn Tun Ngc 2013100090
Lê Hồ Thảo Nguyên 2008100132
Huynh Ngoc Tuyền 2008100168
Lê Thò Thúy Hằng 2008100110

$
%     &
% '
(% )*)+ ,-./,0,10 2
(%(%,-./,0 2
(%&%,-./,0,10 2
(%2% 3 0 4 5)0    6
&% )*)+ ./ 6
&%(%  -  7
&%&%' +89   :
&%2%  )3    ;
2% </=> 0 4 5)0+./   
4 5 ,-./,0,10  ?
2%(%  +0+    ;
2%&%$  .    5 1@.,05)0      
   
%,106A(& ?

phương thức mới để kháng bệnh, và trong đó có “NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT
KHÁNG SINH VANCOMYCIN T) XA KHUẨN STREPTOMYCES
ORIENTALIS” cu a ca"c ca"n bộ thuộc Viện Công nghệ Sinh hoc thc hiện, c
nho"m tâm đắc nhất va nho"m a& quyết inh tim hiểu cu&ng nh hoc ho i phng pha"p
* đề tai nay.
+ Muc tiêu :
Xây dng quy trình công ngh lên men s+n xut kháng sinh vancomycin t$
ch,ng x khun Streptomyces orientalis 4912 phù hp v!i nguyên liu và i-u kin
môi trng khí h.u Vit Nam%
+ Nội dung nghiên c#u :
- Nghiên cứu đặc điểm hình phái, đặc điểm phân loại và bảo quản chủng
Streptomyces orientalis trong i-u kin phòng thí nghim.
- Nghiên cứu lựa chọn môi trường thích hợp bằng các nguyên liệu trong nước
và điều kiện lên men chủng Streptomyces orientalis trong phòng thí nghim.
- Nghiên cứu tuyển chọn, bảo quản và nâng cao hoạt tính kháng sinh ch,ng
gi/ng.
- Nghiên cứu tối ưu môi trường và điều kiện lên men có b0 sung c cht.
- Nghiên cứu thử nghiệm lên men sản xuất ở trong nổi lên men nh1.
- Nghiên cứu tách chiết, tinh chế vancomycin t$ dch lên men ch,ng
Streptomyces orientalis 4912.
- Nghiên cứu i-u ch2 vancomycin-Na.
3
%J'
(%K*K+,8,-./,0,10
(%(,-./,0
- Streptomyces là l!n nht chi c,a Actinobacteria và
chi nh.p c,a gia ình streptomycetaceae. Hn 500 loài
Streptomyces vi khun đã c mô t+. C3ng nh v!i các
Actinobacteria khác, Streptomyces là Gram dng, và có
b gen v!i cao GC . c tìm thy ch, y2u trong t và

của VSV, tế bào ung thư ở ngay nồng độ thấp.
- Tại Hàn Quốc năm 2007 phân lập được loại xạ khun Streptomyces sp. C684
sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng
methicillin và các c7u khun kháng vancomycin.
- Ti Nh.t n'm 2003, Yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn
Streptomyces sp. TP – A0356 b9ng phng pháp sHc kí ct. CKS này có kh+ n'ng
ki-m hãm sự phát tri6n c,a nm Aspergillus và Candida albicans. Chất này còn có
khả năng chống lại các tế bào ung thư có giá tr Mic là 0,01 – 0,3 mg/ml.
- 6 tránh dch bnh trong nông nghip, ngi ta còn có th6 s5 d4ng mt s/
bin pháp kI thu.t, nh thay 0i c cu cây trJng, mùa v4. Tuy nhiên biện pháp này
gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng tạo điều kiện phát sinh một số bệnh mà trước
đây ít gặp. Việc tuyển chọn các dòng cây kháng bệnh này cũng chỉ được vài năm,
sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại.
&%*K+,8./
Vancomycin là chất kháng sinh thuộc nhóm
glycopeptid có tác dụng tích cực trong điều trò bệnh, từng
được coi là phương thuốc cuối cùng vì có khả năng điều
trò được các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các chủng vi
sinh vật kháng methicillin (cht kháng sinh nhiễm K-
lactam) gây nên. Vancomycin đã c a vào cha bnh
t$ hn 40 n'm qua, nhng ngày nay vL n c coi là kháng
sinh quan trng do hiu qu+ cha bnh cao khi dùng mt
mình ho(c ph/i hp v!i các kháng sinh khác, ch/ng li
các vi khun đã nhn v!i nhi-u loi kháng sinh thông dụng.
B*i v.y, vic nghiên c#u sinh t0ng hp vancomycin vLn c
quan tâm, phát tri6n, 6 t$ đó hình thành nên thế hệ kháng sinh mới có hiệu quả
M?G/NCO?P/FQGO
5
;<=
;<=R

chu trách nhim lHp ráp các heptapeptide. (Hình 2). Các t0 ch#c c,a CEPA, CepB, và
CEP C ch(t chT tng t nh tổng hp peptide khác nh nhng chất cho surfactin
(SrfA1, SrfA2, và SrfA3) và gramicidin (GrsA và GrsB). MSi enzym t0ng hp peptide
kích hot mã hoa" cho các axit amin khác nhau 6 6 kích hot t$ng lInh vc. CEPA mã
hóa cho mô-un 1, 2, và 3. CepB mã hóa cho các mơ-un 4, 5, và 6. và CepC mã hóa
cho mơ-un 7. Sau khi phân t5 heptapeptide tuy2n tính c t0ng hp, Vancomycin đã
ph+i tr+i qua thay  0i hn na, ch% ng hn nh oxy hóa liên k2t ngang và glycosyl hóa.
6 chuy6n 0i heptapeptide tuy2n tính, tám enzyme, open reading frames (ORF) 7, 8,
9, 10, 11, 14, 18, 20, và 21 c s5 d4ng. Enzyme ORF 7, 8, 9, và 20 là nhng enzym
6
P450 . Và ORF 9 và 14 c xác nh là enzym th,y phân gi+ nh. V!i s gíup U c,a
các enzym này, các nhóm K-hydroxyl c gi!i thiu trên tyrosine d lng 2 và 6, và
kh!p n/i x+y ra trong vòng 5 và 7, vòng 4 và 6, và vòng 4 và 2. Ngồi ra,
haloperoxidase c s5 d4ng 6 gHn các nguyên t5 clo vào vòng 2 và 6 thông qua mt
quá trình oxy hóa.
7
;<=
&%&'+PK
Vancomycin là mt nhánh ba vòng peptide nonribosomal glycosyl hóa c
s+n xut b*i quá trình lên men c,a các loài actinobacteria Amycolatopsis orientalis
(trước đây là ch: nh Nocardia orientalis ).
Vancomycin exhibits atropisomerism – nó có nhiều hóa học khác bit
rotamers do hn ch2 luân phiên c,a mt s/ liên kết. Các hình thái hin din trong
thu/c là các m(t nhit ng 0n nh hn conformer và do đó có hot ng mnh
hn.
&%2K3
Vancomycin hoat ộng b9ng cách #c ch2 t0ng h p thích hp thành tế bào vi
khun Gram dng. Do c ch2 khác nhau mà theo đó các vi khun Gram âm s+n
xut thành tế bào của nó và các yêu tố khác nhau liên quan đến việc đi vào màng
ngoài của các sinh vật gram âm, vancomycin không phải là hoạt động chống lại

Hot tính kháng sinh c,a ch,ng S. orientalis 4912
Ch,ng S. orientalis 4912 s5 d4ng t/t nguJn ng sacchaose v!i hàm lng
thích hp là 3%, cho hot tính kháng sinh cao. Trong s/ các nguJn nit th5 nghim
thì bt .u tng cho hot tính kháng sinh cao nht, v!i hàm lng 0,2% là thích
9
;<R=
;<R=
hp. Nghiên c#u +nh h*ng c,a nhit  và pH cho thy, nhit  thích hp cho
sinh tr*ng, phát triển và sinh t0ng hp kháng sinh c,a ch,ng S. orientalis 4912 là
280C và pH t$ 6 2n 8. Lng gi/ng c cy vào môi tr ng lên men thích hp 6
- 8% so v!i môi trường lên men.
Nghiên cứu động thái quá trình men ch,ng S. orientalis 9412 cho thy, sinh
kh/i và hot tính kháng sinh t'ng d7n và t cc i sau 120 gi lên men. Nh v.y,
ng thái quá trình lên men ch,ng này có (c trng gi/ng nh * các ch,ng x
khun sinh kháng sinh khác.
2%2B5K0%,106A(&
Tr!c h2t, các nhà khoa hc Vin Công ngh sinh hc áp d4ng phng pháp
gây ch,ng t bi2n b9ng tia UV. K2t qu+ nghiên c#u kh+ n'ng s/ng sót c,a t2 bào
tr7n và bào t5 ch,ng S. orientalis 4912 sau khi x5 lý UV *  s/ng sót t$ 1-10%,
ki6m tra hot tính kháng sinh theo phng pháp c4c thch cho thy, kh+ n'ng sinh
t0ng hp kháng sinh c,a ch,ng này t'ng lên t$ 8-30,3% /i v!i x5 lý bào tử và
66,33% /i v!i x5 lý tế bào tr7n.
Kh+ n'ng s/ng sót c,a
t2 bào tr7n và bào t5 ch,ng
S. orientalis 4912 sau khi x5
lý UV và MNNG
Hot tính kháng sinh c,a các khu n lc ch,ng
S. orientalis 4912 xác nh b9ng phng pháp c4c
thch (A) và 4c lS (B)
Sau đó các nhà khoa hc ti2p t4c áp d4ng phng pháp th# hai, đó là gây

C3ng ti thi i6m này ch,ng bHt 7u sinh vancomycin, t!i 120 gi nJng  t cc
i là 2983 mcg/ml.
Bi2n ng quá trình
lên men sinh t0ng
hp vancomycin
b*i bi2n ch,ng S.
orientalis 4912-81-
61 trên thi2t b
Bioflo 5000
2%7K+P+./31,.,
11

</=4+./
K2t qu+ ki6m tra vancomycin tách chi2t t$ bi2n ch,ng S. orientalis 4912-81-61
b9ng sH c ký l!p mỏng trên h dung mơi Butanol - axit acetic - H2O (4 : 3 : 7) cho
gía tr Rf c,a các mLu là 0,75; b9ng phng pháp ph0 kh/i Agilent 6310 Ion Trap
trên máy HPLC-MS, trng lng phân t5 là 1449,27 và b9ng sHc ký l1ng cao cấáp
trên máy HPLC-SPA-10 Shimadzu, thi gian lu là * 4,4 phút gi/ng nh
vancomycin chun (Merck). SHc ký J HPLC cho thy không có các pic tp ch#ng
t1 vancomycin ch2 phm khá tinh sch,  tinh khi2t t 95,4%.
Ki6m tra vancomycin b9ng
sHc ký l!p m1ng
1. Vancomycin t$ môi trng
nuôi cy 2. Vancomycin được
tách chi2t và làm tinh khi2t;
và 3. Vancomycin chun
(Merck)
Ph1 UV c,a
vancomycin chun (trên)
và vancomycin ch,ng S.

Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực
vật từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ khuẩn có
khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và F.oxysporum gây bệnh thối
rễ ở thực vật.
6%&1,-./,00-,.R>P%
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên thành sợi khí sinh
thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có nhiều dạng khác
nhau tuỳ loài : thẳng, lượn sóng xoắn, có móc, vòng….
Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng 2 phương pháp : phân đoạn
và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường
kính khoảng 1,5 µm. Màng tế bào có thể nhẵn, gai khối u, nếp nhăn…. Tuỳ thuộc
vào lõi xạ khuẩn với môi trường nuôi cấy.
13
Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza thì bào tử thể hiện
đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sinh khí cũng rất khác nhau tuỳ
theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi
trường khác nhau.
Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn gram
(+), hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 300C, pH
tối ưu 6,5 – 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn
(xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh).
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức chế vi
khuẩn, nấm sợi và các tế bào ung thư, virus và động vật nguyên sinh.
6%2,-./,0.++K-,3
0430
Vic s+n xut thng mi protein cha bnh ho(c chn đoán vi sinh v.t lý t0
hp c quan tâm đáng k6.
Mt s/ h th/ng s+n xut protein c,a vi khun đang được phát triển.
Mt s/ chi c,a các vi khun Gram dng ang c th5 nghim nh là v.t ch,
lu tr 6 s+n xut protein d do kh+ n'ng ti2t ra các protein có hiu qu+ trong môi

%,)1Q
Vancomycin là mt kháng sinh nhóm glycopeptid c s5 d4ng 6 cha các
bnh nhim trùng do các vi khun Gram dng gây ra, (c bit là các vi khun
kháng li kháng sinh methicillin và penicillin. K2t qu+ nghiên c#u được xây dng
c quy trình thích hp 6 s+n xut vancomycin t$ bi2n ch,ng nh.n c cao hn
ch,ng g/c 344%. Cht kháng sinh thu nh.n c t$ dch lên men tng ng v!i
vancomycin chun (Merck).
Đã nghiên c#u (c i6m sinh hc ch,ng 4912: Ch,ng này có ( c i6m gi/ng
loi S.orientales nh ch,ng chun ISP 504 được mô t+, s5 d4ng h7u h2t các nguJn
ng, sinh tr*ng phát tri6n t/t, nhit  sinh tr*ng t/i u * 28-300C, pH thích
hp cho s phát tri6n c,a ch,ng này t$ 6 2n 9, chu mu/i 2n 6% và không có kh+
n'ng to xenlulaza.
Ch,ng S. orientalis 4912 có ho t ph0 kháng khun rng gi/ng lồi Streptomyces
orientalis Pittenger & Brigham, #c ch2 c c+ vi khun Gram dng và vi khun
Gram âm.
Đã la chn môi trng thích hp MT 48 làm môi trng c s* 6 nghiên c#u
t/i u thành ph7n môi trng và i-u kin lên men. Ch,ng 4912 có (c i6m sinh
hc gi/ng lồi Streptomyces orientalis và hot tính kháng sinh cao. K2t qu+ nghiên
c#u các y2u t/ +nh h*ng 2n kh+ n'ng sinh t0ng hp kháng sinh cho thy nguJn
dinh dUng thích hp là saccaroza 3%, bt .u tng 0,2%, pH 7,0 - 7,5 nhit  lên
men 300C và t[ l cy gi/ng 10%. Lng sinh kh/i và kháng sinh cao nht c,a quá
trình lên men * 120 gi nuôi cy.
Đã nghiên c#u s bi2n ng t nhiên v- hot tính kháng sinh c,a ch,ng S.
orientalis 4912 và nh.n thy, ch,ng này không có bi2n ng l!n v- hot tính kháng
sinh; không có bi2n ch,ng âm tính và được la chn c 1 ch,ng có hot tính
kháng sinh cao nht.
Đã la chn c ch,ng x khun S. orientalis 4912-81-345 có kh+ n'ng sinh
t0ng hp vancomycin cao và các ch,ng c t bi2n có kh+ n'ng sinh t0ng hp
kháng sinh cao hn ch,ng g/c.
15