Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN DƯƠNG VÕ MỸ HẠNH

XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC)
CỦA THUỐC NATSOL (KHÁNG SINH THỰC VẬT)
LÊN VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila



XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC)
CỦA THUỐC NATSOL (KHÁNG SINH THỰC VẬT)
LÊN VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TỪ THANH DUNG
NGUYỄN THỊ NHƯ NGỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2008
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 16
3.2 Vật liệu nghiên cứu 16
3.2.1 Hoá chất và môi ttrường 16
3.2.2 Thuốc kháng sinh 16
3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm 16
3.2.4 Vi khuẩn thí nghiệm 17
3.3 Phương pháp nghiên cứu 17
3.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu nghiên cứu 17
3.3.1.1 Chuẩn bị vi khuẩn 17
3.3.1.2 Chuẩn bị dung dịch thuốc kháng sinh 18
3.3.2 Thực hiện nghiên cứu 20
3.3.2.1 Nghiên cứu thăm dò 20
3.3.2.1 Phương pháp lập kháng sinh đồ 21
3.3.2.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường thạch
(Lila Ruangpan, 2004): 22
3.3.2.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp
pha loãng (Geert Huys, 2002): 23
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 25
4.1 Kết quả nghiên cứu thăm dò khoảng nồng độ ức chế của thuốc kháng sinh thực
vật natsol lên vi khuẩn gây bệnh trên cá tra 25
4.2 Xác định nồng độ MIC 26
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2
4.2 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của thuốc natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và A.
hydrophila 27
4.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn E.
ictaluri và A. hydrophila bằng phương pháp pha loãng 28
4.3.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn A.
hydrophila 28


Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3
DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn E. ictaluri ở vật kính 40X (gram âm –
hình que) 10
Hình 2.2: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn A. hydrophila ở vật kính 40X (gram
âm – hình que) 11
Hình 4.3: Kết quả MIC trên môi trường thạch của vi khuẩn A. hydrophila (Đĩa
đối chứng (trái), đĩa môi trường chứa thuốc nồng độ 375ppm (phải)) 34
Hình 4.4: Kết quả MIC trên môi trường thạch của vi khuẩn A. hydrophila (Đĩa
đối chứng (trái), đĩa môi trường chứa thuốc nồng độ 750ppm (phải)) 34


Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu thăm dò nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc
Natsol trên vi khuẩn E. ictaluri 26
Bảng 4.2: Nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc chloramphenicol trên E. coli 27
Bảng 4.3: Kết quả kháng sinh đồ kiểm tra độ nhạy của thuốc natsol bằng đĩa
kháng sinh tự chế 28
Bảng 4.4: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh natsol trên vi
khuẩn A. hydrophila ở chủng CAF2 29
Bảng 4.5: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol trên vi khuẩn A.
hydrophila ở chủng CAF133 29
Bảng 4.6: Đọc kết quả pha loãng ống MIC số 6 và 7 ở độ pha loãng 10
5
trên vi
khuẩn A. hydrophila 30
Bảng 4.7: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol trên vi khuẩn E. ictaluri ở
chủng vi khuẩn E.3B3 31
Bảng 4.8: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol trên vi khuẩn E. ictaluri ở
chủng vi khuẩn E.223 31
Bảng 4.9: Đọc kết quả pha loãng ống MIC số 8 và 9 ở độ pha loãng 10
4
trên vi
khuẩn E. ictaluri 32
Bảng 4.10: Kết quả MIC trên môi trường thạch trên vi khuẩn A. hydrophila với
các đĩa môi trường 5, 6, 7 ứng với các nồng độ 1500; 750; 375ppm 32
Bảng 4.11: Kết quả MIC trên môi trường thạch trên vi khuẩn E. ictaluri với các
đĩa môi trường 6, 7, 8 ứng với các nồng độ 750; 375; 187,5ppm 33
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu



6
TÓM TẮT

Thí nghiệm thăm dò nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc kháng sinh thực vật
natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và xác định được khoảng nồng độ ức chế của
natsol lên vi khuẩn E. ictaluri là 50-100ppm.
Thực hiện nghiên cứu xác định nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc kháng sinh
thực vật natsol bằng ba phương pháp:
 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp lập kháng
sinh đồ, nhưng qua thí nghiệm trên thuốc natsol không cho kết luận gì.
 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng,
xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol lên vi khuẩn E.
ictaluri là 93,75ppm và lên vi khuẩn A. hydrophila là 375ppm.
 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp thạch, xác
định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol lên vi khuẩn E.
ictaluri là 187,5ppm và lên vi khuẩn A. hydrophila là 750ppm.


bệnh, làm giảm hiệu quả phòng và trị bệnh về sau. Thêm vào đó là vấn đề ô
nhiễm môi trường nước, tích tụ dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thuỷ sản…
ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm xuất khẩu, nhất là không tốt cho sức khoẻ
người tiêu dùng. Theo Direkbusarakom (1995), một giải pháp phòng trị khác là
sử dụng cây thảo dược điều trị bệnh vi khuẩn trong thuỷ sản, tuy hiệu quả
không nhanh chóng nhưng khắc phục được những khó khăn đã gặp khi sử dụng
hóa chất và thuốc kháng sinh. Vì vậy, ở Thái Lan, Trung Quốc, Ấn Độ… kể cả
Việt Nam, một vài cây thảo dược có sẵn trong tự nhiên được dùng làm dược
phẩm cho người và gia súc, cũng được thử nghiệm làm thuốc trị bệnh trong
ngành thuỷ sản (Sivarajan, 1994). Chất chiết cây đậu (Clinacanthus nutans) ức
chế bệnh Yellowhead Baculovirus trên tôm sú (Penaeus monodon)
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

8
(Direkbusarakom & ctv, 1995). Theo Kamei (1988) cho rằng chiết suất thảo
dược từ cây ổi (Psidium guajava) phòng trị được bệnh vi rút như IHNV, IPNV,
OMV trên cá. Từ Thanh Dung (1996) đã nghiên cứu thành công ảnh hưởng của
cây thảo dược lên vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá trê lai
(Clarias macrocephalus x C.gariepinus). Hiện nay vẫn chưa có nhiều tài liệu
khoa học đề cập đến cách phòng trị bệnh cá tra bằng thảo dược. Vì vậy, để làm
phong phú thêm cho phương pháp điều trị cũng như làm đa dạng danh mục
thuốc phòng trị bệnh cho cá là lý do chính để đề tài “Xác định nồng độ ức chế
tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol (kháng sinh thực vật) lên vi khuẩn E.
ictaluri và A. hydrophila” được thực hiện.
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn A.
hydrophila và E. ictaluri.
Nội dung nghiên cứu
Kiểm tra nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng và môi
trường thạch trên vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri.

0
C, không
di động khi nhiệt độ cao hơn. Catalase dương tính, cytochrom oxidase âm tính
và lên men glucose. Không sinh H
2
S và indole âm tính. Vi khuẩn E. ictaluri
phát triển trên môi trường TSA (trypton soya agar) chậm 36-48 giờ tại 18-28
0
C.
Giống vi khuẩn Edwardsiella còn phát triển tốt trên môi trường BHI (brain
heart infusion) và môi trường TSA, vi khuẩn có dạng khuẩn lạc nhỏ màu xanh
có nhân đen trên môi trường EIA (E. ictaluri agar) (Từ Thanh Dung, 2005).

Hình 2.1: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn E. ictaluri ở vật kính 40X
(gram âm – hình que)
2.1.2 Phân bố của vi khuẩn E. ictaluri
E. ictaluri có thể truyền bệnh qua môi trường nước, đất và các động vật khác.
Vi khuẩn E. ictaluri là mầm bệnh nguyên thuỷ trong ngành nuôi cá nheo Mỹ.
Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri được chuẩn đoán ở vùng nuôi cá da trơn tại
Mississippi, Arkanas, Alabana, Louisiana, Georgia và Florida. Theo Hawke &
ctv (1998), bệnh cũng thường xuyên xảy ra ở Virginia, Texas, Idaho, Kentucky,
California, Arizona và Maryland. Ở Việt Nam, vùng ĐBSCL bệnh mủ gan xuất
hiện đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển
mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Sau đó, bệnh lây lan sang các
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
10
vùng lân cận. Đặc biệt, những năm gần đây bệnh này cũng xuất hiện ở một số
tỉnh ven biển mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng
(Từ Thanh Dung & ctv, 2004). Bệnh mủ gan chủ yếu xuất hiện trên cá tra (ở tất
cả các giai đoạn phát triển), thỉnh thoảng xuất hiện trên cá basa. Tỷ lệ hao hụt

thích hợp (Subasingha, 1995).
Bệnh xuất huyết do A. hydrophila có thể lây truyền qua nước, từ cá bệnh sang
cá khỏe, cá tạp làm thức ăn nhân tạo, và kết hợp động thực vật ký sinh bên
ngoài và bên trong cơ thể (Newman, 1993). Các yếu tố gây sốc như mật độ
nuôi cao, thức ăn thừa, áp suất nước cao, nồng độ oxy hòa tan thấp, nghèo dinh
dưỡng là nguyên nhân cá dễ mắc bệnh (Shotts & ctv, 1972).
Vi khuẩn A. hydrophila tồn tại trong môi trường nuôi, đặc biệt ở trong nước có
hàm lượng hữu cơ cao (Snieszko & Axelrod, 1971). Vi khuẩn có thể tồn tại bên
ngoài cơ thể cá khỏe (Trust & Sparrow, 1974). Nhiệt độ ảnh hưởng đến độ độc
của vi khuẩn. Giống A. hydrophila sống đơn độc trong nước lây truyền với hàm
lượng vi khuẩn thấp trong cá bệnh và mồi câu tôm nước ngọt. Một vài chủng vi
khuẩn của A. hydrophila có độc tố ngoại lệ đối với cá, không có độc khi vi
khuẩn yếu đi.
A. hydrophila có thể xâm nhập qua những tổn thương do ký chủ trung gian.
Nhiều trường hợp bệnh bộc phát có liên quan đến yếu tố gây sốc, chẳng hạn
hàm lượng oxy hoà tan thấp kết hợp với khí ammonia và khí cacbonic cao, làm
tăng áp suất nước và nồng độ nitrat. Cá càng trở nên nhạy cảm với A.
hydrophila (Pai & ctv, 1995).
2.2.5 Bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila
Triệu chứng của bệnh này giống triệu chứng của các bệnh xuất huyết do vi
khuẩn khác, chỉ khác ở bốn điểm phổ biến: nhạy với độ độc thấp, hình dạng
phù và hình dạng vết loét. Biểu hiện bệnh xuất huyết ở cá chép (Cyprinus
carpio) là những đốm đỏ trên thân, ở cá trê lai thì bị phù (Rogers & Burke,
1981).
A. hydrophila gây bệnh trên nhiều loài cá: cá lóc (Ophicephalus striatus)
(Bloch), cá trê (Clarias batrachus), cá diếc (Glossogobius giurus) (Hamilton),
cá hồi đốm đen (Oncorhynchus mykiss) (Walbaum) (Lio-Po & ctv, 1992).
Bệnh phù xảy ra ở cá trê lai cỡ nhỏ. Tonguthai & ctv (1993) tìm thấy nguyên
nhân của bệnh này là A. hydrophila, Vibrio sp, và Pseudomonas sp với các triệu
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

bệnh. Dầu đinh hương dùng trong công nghiệp hương thơm và làm xà phồng,
cũng như làm thuốc giảm đau, đặc trị đau răng (Trease & Evans, 1973).
+ Cây xuyên tâm liên (Andrographus panicullata)
Cây xuyên tâm liên có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tiêu thủng, ức chế vi
khuẩn, tăng cường hiện tượng thực bào của tế bào bạch cầu, dùng trị bệnh viêm
ruột cho cá trắm cỏ (Bùi Quang Tề, 2006)
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
13
+ Cây nhọ nồi (Eclipta alba)
Cỏ nhọ nồi có tác dụng cầm máu, không gây tăng huyết áp, không làm giản
mạch ở người, điều trị viêm gan (Dixit & Achar, 1979). Eclipta alba có tác
dụng trong điều trị tổn thương gan và vết bổng (Từ Thanh Dung, 1996).
Kết quả thử tác dụng của cao tách chiết thảo dược cao nhọ nồi có tác dụng với
3 vi khuẩn V. harveyi, V. alginolyticus và A. hydrophila (Bùi Quang Tề, 2006).
+ Cây chó đẻ (Phyllathus debilis)
Cây chó đẻ có tác dụng kháng sinh, chữa đinh râu, đau mắt, mụn nhọt… ở
người. Đã thử nghiệm tác dụng kháng sinh với vi khuẩn A. hydrophila, E. tarda
gây bệnh hoại tử ở cá trê, vòng kháng khuẩn 11-20mm (Bùi Quang Tề, 2006).
+ Cây tỏi (Allium sativum)
Kết quả thử cao tách chiết thảo dược từ tỏi có tác dụng với 6 loài vi khuẩn:
Vibrio parahaemolyticus, V. harveyi, V. alginolyticus, A. hydrophila, E. tarda,
Hafnia alvei) gây bệnh cá nước ngọt, lợ mặn. Tỏi tách chiết thành cao dầu phối
chế thành thuốc chữa bệnh tôm cá, có tác dụng phòng trị bệnh xuất huyết, hoại
tử nội tạng (bệnh đốm trắng) do vi khuẩn cho cá tra nuôi. Kết quả chế phẩm
phối chế từ hoạt chất tách chiết của tỏi và sài đất có tác dụng phòng trị bệnh ăn
mòn vỏ kitin do vi khuẩn Vibrio spp cho tôm nuôi (Bùi Quang Tề, 2006).
2.3.3 Một số kết quả khoa học sử dụng cây thảo dược phòng và trị bệnh
thủy sản
Từ Thanh Dung (1996) đã kiểm tra tính nhạy của 8 loài chiết suất thảo dược
trên 6 chủng vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh trên cá trê lai (Clarias batrachus

Natsol có tác dụng ngăn chặn các bệnh khác nhau của vi khuẩn và nấm. Natsol
được mở rộng sử dụng ở Ấn Độ 3 năm trước và thành công trong bước đầu
điều trị bệnh thối chủy, thối mang, cụt phụ bộ. Ngoài ra Natsol còn dùng điều
trị bệnh vi rút trên tôm cá. Thành phần gồm flavonon sinh học và không có
chứa kim loại, hóa chất hay độc tố.
2.5 Chloramphenicol
Kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, có nguồn gốc sinh
học hay do con người tổng hợp nên. Có tác động một cách riêng biệt trên một
giai đoạn chính yếu của sự biến dưỡng của các vi khuẩn, nấm và vi rút (Lê Thị
Kim Liên, 2007). Ngoài ra, theo Bùi Thị Tho (2003) cho rằng kháng sinh là
những chất có tác động chống lại sự sống của vi khuẩn, ngăn ngừa vi khuẩn
nhân lên bằng tác động ở mức độ phân tử hoặc tác động vào một hay nhiều giai
đoạn chuyển hóa cần thiết của đời sống vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng
lý hóa.
Chloramphenicol là thuốc kháng sinh có hoạt tính kháng khuẩn cao, nhanh, và
mạnh, đặc biệt phổ kháng khuẩn đã được mở rộng với cả vi khuẩn Gram âm và
Gram dương (Edwardsiella (gram âm) và Aeromonas (gram âm), Pseudomonas
(gram âm), Streptococcus (gram dương)) (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Quốc
Thịnh, 2006).
2.6 Một số kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên thuốc
kháng sinh thảo dược
Mullika & ctv (2005) tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu
của 19 loại thảo dược (andrographic paniculata, azadirachta indica, barleria
lupulina, carthamus tinctorius, centella asiatica, clinacanthus nutans,
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
15
cymbopogon citrates, eupatorium odoratum, garcinia mangostana, hibiscus
sabdariffa, houttuynia cordata, lawsonia inermis, lycopersicon esculentum,
murdennia lorifomis, psidium guajava, senna alata, senna occidentalis, senna
siamea, tagetes erecta) lên hai loài vi khuẩn Probionibacterium acnes và

MIC cao nhất (2640mg/ml) (Mohan & ctv, 2004).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
16
CHƯƠNG 3
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian nghiên cứu: Bắt đầu từ tháng 04/2008 đến tháng 05/2008
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm bộ môn sinh học và bệnh thuỷ
sản, khoa Thuỷ sản, trường đại học Cần Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Hoá chất và môi ttrường
 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: nutrient agar (NA, Merck), nutrient broth
(NB, Merck), muller hinton agar (MHA, Merck).
 Các loại hoá chất nhuộm Gram: dd I (ammonium oxalate, crystal violet),
dd II (iodine), dd III (cồn tuyệt đối, ethanol (Merck)), dd IV (safranin).
 NaCl.
 Dầu xem kính hiển vi.
 Glycerol.
 Nước cất.
3.2.2 Thuốc kháng sinh
 Thảo dược: natsol.
 Chloramphenicol.
3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm
 Que cấy, pel, khay nhựa, bình xịt cồn, giấy vệ sinh, bút lông, kính hiển vi,
lame, đèn cồn, hột quẹt.
 Cốc thuỷ tinh, lọ thuỷ tinh, que trãi thuỷ tinh, đĩa petri, ống đong, ống
nghiệm.
 Pipet 1-5ml, 100-1000µl, 10-100µl, 5-40µl.

C trong 24 giờ đối với A. hydrophila và 48
giờ đối với E. ictaluri. Vi khuẩn đã thuần được nuôi tăng sinh trong môi trường
NB lỏng, ủ trong tủ ấm ở 28
0
C hoặc lắc đều trên máy lắc từ 18-24 giờ (Rahman
& Kawai, 2000).
Ly tâm vi khuẩn
Cho vi khuẩn vào ống falcon 50 ml, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/ phút, ly tâm
trong 15 phút, sử dụng nước muối sinh lý (0,85% NaCl) tiệt trùng để rửa vi
khuẩn. Lặp lại thao tác 2 – 3 lần. Sau lần ly tâm cuối cùng cho môi trường NB
vào và trộn đều mẫu.
Xác định mật độ vi khuẩn
Ly tâm xong, cho môi trường NB vào đánh tan phần vi khuẩn lắng, rồi tiến
hành so màu bằng máy so màu quang phổ. Mật độ vi khuẩn được đo bằng máy
so màu quang phổ ở bước sóng 590nm, với OD=0,1±0,02 tương đương với mật
độ vi khuẩn A. hydrophila là 1x10
8
cfu/ml và OD=0,01±0,002 tương đương
vớimật độ vi khuẩn E. ictaluri là 1x10
7
cfu/ml (Lương Trần Thục Đoan, 2006).
Sau đó mỗi chủng vi khuẩn được cấy trên môi trường NA để kiểm tra thao tác
kỹ thuật chuẩn bị dung dịch vi khuẩn trước khi thực hiện nghiên cứu.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
18
3.3.1.2 Chuẩn bị dung dịch thuốc kháng sinh
Natsol: được cung cấp từ công ty BIOFLAVONOIDS của Ấn Độ. Chuẩn bị
dung dịch gốc (stock) Natsol như sau: hòa tan 5ml Natsol trong 100ml nước cất
được nồng độ 50000µl/l, sau đó pha loãng theo phương pháp pha loãng hai lần
(double dilution method) để được các nồng độ 24000; 12000; 6000; 3000;

 Nồng độ thuốc sẽ giảm đi phân nửa khi cho dung dịch vi khuẩn vào.
 Ghi tên thuốc và nồng độ thuốc trước khi bắt đầu thí nghiệm.
 Phải lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng ở nồng độ tiếp theo.
Điều cần chú ý là ở mỗi nồng độ pha loãng, hàm lượng thuốc giảm đi
phân nửa sau khi cho dung dịch vi khuẩn vào (Bảng 3.2 và Bảng 3.4).
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
19
Bảng 3.2: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc natsol khác nhau (cho 1 chủng
vi khuẩn)
Ống
MIC
Nồng độ thật thuốc natsol
(ppm)
Thể tích
thuốc natsol
(ml)
Thể tích
vi khuẩn
(ml)
1 12000

2 (24000ppm, ống 1) 2
2 6000

2 (12000ppm, ống 2) 2
3 3000

2 (6000ppm, ống 3) 2
4 1500


thuốc kháng sinh
chloramphenicol
(ml)
Thể tích
nước muối sinh lý
(ml)
1 1024 2 512
5 (1024ppm,
dung dịch gốc 1)
5
3 256 5 (512ppm) 5
4 128
5 (256ppm,
dung dịch gốc 2)
5
5 64 5 (128ppm) 5
6 32 5 (64ppm) 5
7 16 5 (32ppm) 5
8 8 5 (16ppm) 5
9 4 5 (8ppm) 5
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
20
Bảng 3.4: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc chloramphenicol khác nhau
(cho 1 chủng vi khuẩn)
Ống
MIC
Thể tích thật thuốc kháng sinh

vi khuẩn E. ictaluri với chủng E.223 được tiến hành từ nồng độ gốc
(50000ppm) pha loãng các nồng độ: 10000; 8000; 6000; 5000; 4000; 3000;
2000; 1000; 500; 400; 300; 200; 100; 50; 45; 40; 35; 30; 25; 20; 15 và 10ppm.
Pha nồng độ 50000ppm theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
21
Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn (như 3.3.1.1)
Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp xác định MIC bằng phương pháp
pha loãng
Cho 2 ml vi khuẩn vào mỗi ống nghiệm chứa 2 ml thuốc kháng sinh với các
nồng độ 10-10000ppm.Tất cả các ống nghiệm và đĩa cấy kiểm tra ủ với điều
kiện nhiệt độ 28-30
o
C. Sau 24 giờ đọc kết quả các ống MIC: so sánh độ đục
giữa các ống MIC. Kiểm tra khoảng ống MIC có độ đục khó phân biệt bằng
cách kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn trên đĩa petri môi trường thạch. Tuỳ
theo từng độ đục khác nhau mà ta có thể pha loãng theo nồng độ giảm dần sao
cho có thể dễ dàng đếm các khuẩn lạc trên đĩa thạch. Chọn nồng độ nào có mật
độ vi khuẩn thấp nhất (giảm 80% so với mật độ vi khuẩn gốc) là nồng độ ức
chế tối thiểu (MIC) Vì sau 24 giờ chưa đủ thời gian cho vi khuẩn E. ictaluri
phát triển trên đĩa môi trường. Do đó, ghi nhận kết quả các ống MIC sau 24 giờ
rồi ủ lại trong tủ ấm, để đủ 48 giờ đọc kết quả các ống MIC lại cùng với đĩa
môi trường vi khuẩn E. ictaluri.
3.3.2.1 Phương pháp lập kháng sinh đồ
Kiểm tra độ nhạy của natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila bằng đĩa
kháng sinh natsol, gồm các bước sau:
Chuẩn bị dung dịch gốc natsol (như 3.3.1.2)
Chuẩn bị đĩa kháng sinh thảo dược:
Chuẩn bị đĩa kháng sinh: sử dụng giấy lọc và tạo thành những khoanh giấy tròn
nhỏ (sử dụng dụng cụ bấm giấy) có đường kính tương đương với đĩa kháng

Xác định nồng độ MIC của natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila
bằng phương pháp thạch theo Lila Ruangpan (2004), nhưng có điều chỉnh do
điều kiện phòng thí nghiệm không có đủ dụng cụ để hoàn chỉnh thí nghiệm như
phương pháp. Phương pháp thí nghiệm gồm các bước sau:
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch kháng sinh thực vật natsol (như 3.3.1.2)
Bước 2: Chuẩn bị hai loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila. Vi khuẩn cũng
được phục hồi, nuôi cấy và nuôi tăng sinh, ly tâm và điều chỉnh mật độ bằng
máy so màu quang phổ (như 3.3.1.1). Sau đó pha loãng dung dịch vi khuẩn vừa
điều chỉnh theo phương pháp pha loãng 10 lần để được mật độ khoảng 10
5
-10
6

cfu/ml và cấy kiểm tra thao tác chuẩn bị dung dịch vi khuẩn.
Bước 3: Chuẩn bị môi trường có thuốc kháng sinh
Môi trường MHA được tiệt trùng ở 121
0
C trong 15 phút, được giữ ấm 40-45
0
C
trong nồi chưng cất (water – bath). Cho thuốc kháng sinh vào môi trường MHA
vào đĩa theo tỷ lệ 1:1, lắc thật nhẹ và đều (để thuốc hoà tan đều trong môi
trường đồng thời không tạo bọt). Đổ ra môi trường đĩa petri đã được tiệt trùng
kỹ. Tất cả thao tác chuẩn bị được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Bước 4: Đọc kết quả: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc
kháng sinh thảo dược natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila
Mỗi đĩa được chia làm hai phần ứng với hai chủng vi khuẩn của một loài vi
khuẩn. Nhỏ 5 µl vi khuẩn vào phần đĩa ứng với chủng vi khuẩn đó. Dùng que
cấy trải mỏng giọt vi khuẩn và lật đĩa lại, ủ ở 28-30
0

 Mỗi chủng vi khuẩn sau khi điều chỉnh mật độ phải được cấy lên môi
trường NA để kiểm tra sự thuần chủng và phải được ủ trong cùng điều
kiện với các ống MIC.
 Mỗi thí nghiệm cần có hai đối chứng:
+ Đối chứng âm (2ml NB + 2ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl))
+ Đối chứng dương (2ml vi khuẩn + 2ml nước muối sinh lý (0,85%
NaCl))
 Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28
0
C, trong 18 - 24 giờ.
Bước 4: Đọc kết quả
 Kiểm tra sự thuần chủng của chủng vi khuẩn xét nghiệm trên đĩa TSA.
Nếu phát hiện có sự tạp nhiễm thì không đọc kết quả MIC.
 Sự phát triển của vi khuẩn được xác định bằng cách so sánh độ đục của
mỗi ống MIC với ống đối chứng âm.
 Loạt ống nghiệm của chủng vi khuẩn nào phát triển không liên tục thì loại
bỏ, không lấy kết quả, thực hiện lại thí nghiệm (ví dụ: vi khuẩn phát triển
ở ống 5 & 7 nhưng không phát triển ở ống 6).

Trích đoạn Kết quả nghiên cứu thăm dò khoảng nồng độ ức chế của thuốc kháng sinh thực

---