ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
… oOo…… LÊ THÙY DUYÊN
XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL TIME RT-PCR
PHÁT HIỆN VÀ PHÂN TYPE TÁC NHÂN GÂY HỘI
CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN TRÊN
HEO (PRRSV) CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN
Mã số chuyên ngành: 60 42 70 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS.HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG TP.HỒ CHÍ MINH - NĂM 2011
LỜI CẢM ƠN
Luận văn này đạt được những kết quả như ngày hôm nay là nhờ sự quan
tâm, tận tình hư ớng dẫn của rất nhiều thầy cô và bạn bè thuộc Khoa Sinh học-
Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên.
Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và chân thành cảm ơn PGS.TS Hồ
Huỳnh Thùy Dương. Cô đã tạo điều kiện về mọi mặt giúp tôi hoàn thành tốt luận
Dịch heo tai xanh lần đầu tiên xuất hiện ở Việt Nam vào tháng 3 năm
2007. Và cho đến năm 2011, năm nào cũng có dịch bệnh xảy ra, gây tâm lý
hoang mang cho người dân. Theo cục Thú y, trong năm 2010, qua hai đợt dịch
bệnh trên cả nước có 1.114.166 con heo mắc bệnh, trong đó số con heo tiêu hủy
là 438.699 con [7]. Bên cạnh đó, thịt heo vốn là sản phẩm chăn nuôi quan trọng ở
nước ta, chiếm 58% tổng GDP nông nghiệp [21]. Do đó, kiểm soát dịch bệnh heo
tai xanh trở thành một trong những nhiệm vụ quan trọng của ngành chăn nuôi
nước ta.
Một trong những nhiệm vụ quan trọng của việc kiểm soát dịch PRRS là xây
dựng các công cụ phát hiện và phân type PRRSV chính xác và nhanh chóng. Do
đó, mục tiêu của luận văn đề ra là xây dựng quy trình Real time RT- PCR có khả
năng đồng thời phát hiện và phân type virus PRRSV với các nội dung chính sau:
1). Thiết kế mồi và mẫu dò bắt cặp đặt hiệu, có khả năng đồng thời phát
hiện và phân type PRRSV.
2). Tối ưu hóa phản ứng Real time RT-PCR.
3). Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của quy trình.
Luận văn Thạc sĩ Lời mở đầu
Lê Thùy Duyên 2
4). So sánh hiệu quả của quy trình phát hiện PRRSV với bộ kit thương
mại trên mẫu heo nuôi.
Sự thành công của đề tài sẽ là tiền đề cho sự phát triển một bộ kit chẩn
đoán Real time RT-PCR có khả năng đồng thời phát hiện và phân type heo mang
mầm bệnh PRRSV, cho kết quả nhanh, chính xác, góp phần phát hiện kịp thời
đàn heo bị nhiễm bệnh, giảm thiệt hại đàn heo, giảm chi phí xét nghiệm. Ngoài ra
ứng dụng phân type PRRSV sẽ là tiền đề phục vụ cho các nghiên cứu về đặc tính
gây đáp ứng miễn dịch khác nhau của các type PRRSV, góp phần theo dõi sự lưu
hành của các type PRRSV, lựa chọn vaccine phòng ngừa thích hợp cho dịch bệnh
PRRS ở nước ta.
1.9. Phương pháp Real-time RT-PCR 16
1.10. Tình hình nghiên cứu và các phương pháp phát hiện PRRSV ở Việt
Nam 20
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 22
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 23
2.2. Vật liệu 23
2.2.1. Mẫu sử dụng trong nghiên cứu 23
2.2.2. Các cặp mồi và mẫu dò sử dụng trong đề tài 23
2.2.3. Hóa chất 25
2.3. Phương pháp nghiên cứu 29
2.3.1. Phương pháp tách chiết RNA bằng Phenol-Chloroform 29
2.3.2. Phương pháp tách chiết RNA theo Boom [10], [18],[26] 30
2.3.3. Phương pháp reverse transcriptase (RT) 31
2.3.4. Phương pháp thiết kế cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu cho PRRSV 32
2.3.4.1. Đánh giá hiệu quả hoạt động của mồi và mẫu dò phát hiện và phân
type PRRSV 34
2.3.4.2. Đánh giá hiệu quả hoạt động của mồi và mẫu dò chứng nội 35
2.3.5. Phản ứng multiplex Real time RT-PCR: 35
2.3.6. Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR 35
2.3.7. Xác định ngưỡng phát hiện và sự đặc hiệu của phản ứng 36
2.3.8. So sánh hiệu quả phát hiện và phân type với kit thương mại 37
2.3.9. Các bước chuẩn bị cho việc tạo kit chẩn đoán hoàn chỉnh 37
Luận văn Thạc sĩ Mục lục
Lê Thùy Duyên iii
2.3.9.1. So sánh hiệu quả tách chiết RNA bằng phương pháp Phenol-
Chlorofom 37
2.3.9.2. Phương pháp tạo dòng gene làm chứng dương 38
3.6.1. So sánh hiệu quả tách chiết RNA của phương pháp tủa Phenol-
Chloroform và phương pháp Boom 66
3.6.2. Tạo dòng gene làm chứng dương 68
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 73
4.1. KẾT LUẬN 74
4.2. ĐỀ NGHỊ 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO 77
PHỤ LỤC 84
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu
Lê Thùy Duyên 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu
Lê Thùy Duyên 5 Hình 1. 1: Các đỉnh dịch PRRS bùng phát ở Châu Á được báo cáo ở OIE năm
2007 (OIE, 2007)
Hàng năm bệnh PRRS gây tổn thất gần 560 triệu USD ở Mỹ. Từ tháng 1
đến tháng 7 năm 2007, có 39.455 heo chết trong tổng số 143.221 heo nhiễm bệnh
ở Trung Quốc [49]. Ở Việt Nam, PRRS được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ
vào các tỉnh phía Nam vào năm 1997. Kết quả kiểm tra huyết thanh học cho thấy
10/51 lợn giống nhập khẩu có huyết thanh dương tính với PRRS [5]. Theo báo
cáo của cục Thú y (2007) cho thấy virus PRRS đã xu ất hiện và lưu hành ở Việt
Nam từ năm 1997. Tuy nhiên, sự bùng phát thành dịch và gây thiệt hại lớn cho
ngành chăn nuôi nước ta bắt đầu lần đầu tiên vào tháng 3 năm 2007. Kể từ đó
dịch bệnh liên tục hoành hành và cho đến nay chưa có một loại vaccine nào sử
dụng ở Việt Nam có thể ngăn ngừa hiệu quả bệnh tai xanh. Năm 2010 là năm
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu
Lê Thùy Duyên 6
dịch tai xanh diễn biến phức tạp nhất. Không kể đợt dịch thứ nhất với 16 tỉnh
thành phía Bắc, thì đợt dịch thứ 2 năm 2010 diễn ra trên 36 tỉnh, thành phố miền
Trung và Nam gồm: Nghệ An, Sóc Trăng, Quảng Trị, Tiền Giang, Lào Cai, Long
như Pasteurella multocida, Porcine Circovirus Type 2 (PCV2),
Mycoplasma hyopneumonia, Streptococcus suis, Salmonella
cholerasuis, Haemophilus parasuis, swine influenza virus… Tỉ lệ heo
chết thường cao ở heo con (30-50 %) và thấp hơn ở heo trưởng thành
(4-20%) [40].
- Đối với heo cai sữa và heo trưởng thành, các triệu chứng của bệnh
bao gồm: biếng ăn, hôn mê, lờ đờ, sung huyết, lông thô ráp, sụt cân,
sốt cao…
Hình 1. 2: Dấu hiệu lâm sàng nhận biết bệnh PRRS. A: Heo có biểu hiện tai màu
tím xanh; B: Heo bệnh có biểu hiện sốt đỏ toàn thân
Tuy nhiên các dấu hiệu lâm sàng nêu trên không hoàn toàn là đặc trưng
cho bệnh PRRS, mà còn xuất hiện ở các bệnh lây nhiễm do các tác nhân khác
gây nên. Điều này dễ gây nhầm lẫn trong chẩn đoán bệnh nếu chỉ dựa vào biểu
hiện lâm sàng. Các bệnh có dấu hiệu lâm sàng tương tự với PRRS được liệt kê
trong bảng 1.2 [39].
A
B
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu
Lê Thùy Duyên 8
Bảng 1. 1: Bảng liệt kê các bệnh có dấu hiệu lâm sàng tương tự với PRRSV
Bệnh liên quan đến sinh sản
Bệnh liên quan đến hô hấp
Sốt heo cổ điển
Cúm heo
Sốt heo Châu Phi
PRRSV là một loại virus RNA mạch đơn, gồm có 8 khung đọc mở (ORF).
Trong đó ORF1a và ORF1b mã hóa cho các protein có hoạt tính polymerase và
replicase. Các ORF2 đến ORF7 mã hóa cho các protein cấu trúc của virus [43].
Sơ đồ cấu trúc bộ gene PRRSV được thể hiện trong hình 1.3.
Hình 1. 3: Cấu trúc bộ gene PRRSV
Chức năng cụ thể của từng ORF của PRRSV được thể hiện trong bảng 1.3.
Bảng 1. 2: Chức năng của các ORF của PRRSV [15]
Khung đọc mã
ORF
Protein được mã hóa
Chức năng protein
ORF1a và ORF1b
Các enzyme sao chép RNA
polymerase
Các protein không cấu
trúc
ORF2
Glycoprotein màng nhỏ GP2a
và GP2b
Protein cấu trúc
ORF2-7
Nucleocapsid protein N
ORF3
Glycoprotein màng GP3
ORF4
Glycoprotein màng GP4
ORF5
Glycoprotein màng chính GP5
tăng nghiêm trọng viêm phổi khi bị nhiễm virus PRRSV. Ngoài ra heo mắc bệnh
PRRS thường bị bội nhiễm với các bệnh như dịch tả heo, tụ huyết trùng, phó
thương hàn, bệnh do xoắn khuẩn Leptospira spp, bệnh do Steptococcus spp,
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu
Lê Thùy Duyên 11
Mycoplasma spp, E.coli Các bệnh kế phát này mới là nguyên nhân chính gây
chết nhiều ở heo mắc bệnh PRRS [46]. Hình 1. 4 : Hình thái của đại thực bào khi bị nhiễm PRRSV. A: đại thực bào bình
thường; B: đại thực bào bị phá hủy
1.6. Một số đặc tính của PRRSV
Virus PRRSV có trong nước bọt, nước tiểu, tinh dịch, qua sữa tiết ra từ
tuyến vú. Do đó PRRSV có thể lây nhiễm qua đường hô hấp, tiêu hóa, giao hợp,
giữa các chuồng trại, thụ tinh nhân tạo, các dụng cụ thiết bị y tế cho heo (như
kim tiêm, quần áo) hoặc qua cơ chất như nước, thức ăn [39], [40].
PRRSV không bền ở bên ngoài với dãy pH từ 5,5 – 6,5. Trong các môi
trường chất tẩy và dung môi có động độ thấp, PRRSV dễ dàng bị bất hoạt nhanh
chóng. PRRSV tồn tại trong nước trên 11 ngày, tuy nhiên ở trạng thái khô nó
cũng dễ dàng bị bất hoạt. Do đó, virus này không tồn tại trong môi trường hay
các điều kiện khô ráo [20].
Vì vậy yếu tố then chốt để kiểm soát và ngăn chặn dịch tai xanh đó là
phát hiện sớm đàn heo bệnh, các trại heo nhiễm bệnh để có biện pháp ngăn chặn,
cách ly và tiêu hủy kịp thời, tránh bùng phát thành dịch bệnh.
A
B
1.8. Các phương pháp phát hiện PRRSV
1.8.1. Dựa trên biểu hiện lâm sàng :
Chủ yếu phát hiện heo bị bệnh dựa vào các biểu hiện lâm sàng như: các
vấn đề về sinh sản ở heo nái (tỉ lệ thụ thai thấp, sảy thai ở giai đoạn cuối, tỉ lệ heo
sinh non cao, thai chết lưu, heo con yếu hoặc chết (hình 1.5)….), các bệnh về hô
hấp (khó thở, ho…), các dấu hiệu lâm sàng như sốt cao, bỏ ăn, da mẩn đỏ, xảy ra
ở bất kì lứa tuổi heo [32]. Theo hướng dẫn của Cục Thú Y nước ta, để phát hiện
heo bệnh tai xanh, phải thường xuyên kiểm tra sức khỏe đàn heo nuôi và sử dụng
định nghĩa ca bệnh lâm sàng như sau: Heo sốt cao trên 40
0
C, khó thở, có những
vết bầm, thâm tím trên da, tai tím xanh, heo ở các lứa tuổi khác nhau đều có thể
mắc bệnh [57].
Trong thực tế chăn nuôi, khi người nuôi thấy các dấu hiệu như: Heo chích
kháng sinh nhiều ngày không giảm, có nhiều heo nái sẩy thai, hoặc sốt nằm đờ
đẫn, hôn mê; heo con, heo cai sữa cả đàn có biểu hiện ửng đỏ toàn thân hoặc tai
tím bầm thì có thể chẩn đoán là heo đã mắc bệnh tai xanh.
Hình 1. 5: Sảy thai, thai chết lưu ở các giai đoạn thai kì khác nhau của bệnh
PRRS
Tuy nhiên, phương pháp này nhận diện bệnh không rõ ràng vì các biểu
hiện bệnh biến động tùy thuộc chủng virus, tình trạng đàn heo, các yếu tố môi
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu
Lê Thùy Duyên 14
trường, cũng như việc dễ nhầm lẫn với các bệnh do các tác nhân virus và vi
khuẩn khác gây ra. Bên cạnh đó, thời gian để phát hiện heo nhiễm bệnh lâu, chỉ
phát hiện khi heo đã phát bệnh nên gây khó khăn cho các biện pháp cách ly và
phòng ngừa. Tuy nhiên hiện nay, đây lại là phương pháp phát hiện phổ biến nhất
ở các trại chăn nuôi cũng như các trung tâm thú y ở nước ta.
RT-PCR là phương pháp cải tiến của phương pháp PCR truyền thống cho
phép phát hiện các RNA từ người, động vật và virus. Các RNA này sẽ được
phiên mã ngược thành các cDNA và được nhân bản bằng các cặp mồi đặc hiệu.
Sản phẩm nhân bản sẽ được phát hiện bằng điện di trên agarose.
Theo khuyến cáo của Tổ chức Sức Khỏe Động vật (World Organisation
for Animal Health) năm 2011, phương pháp RT-PCR cần được sử dụng trong
việc kiểm soát tính sạch bệnh ở tinh dịch sử dụng trong thụ tinh nhân tạo và theo
dõi các đàn heo nhi ễm khi cần tái lập tình trạng sạch bệnh [40]. Phương pháp
RT-PCR đơn giản, ít tốn kém. Kỹ thuật RT-PCR nhạy hơn phân lập virus, có thể
phát hiện 10 phần tử virus/ml tinh dịch và hoàn toàn đặc hiệu. Tuy nhiên phương
pháp này cũng có các m ặt hạn chế như có thể cho kết quả dương tính giả, tốn
thời gian do các bước sau PCR, dễ gây nhiễm chéo. Ngoài ra do đặc tính khác
biệt lớn về trình tự gene giữa hai type PRRSV cũng gây khó khăn cho việc thiết
kế cặp mồi đặc hiệu phát hiện PRRSV.
1.8.5. Real-time RT-PCR:
Real-time RT-PCR được xem là phương pháp khắc phục nhược điểm của
phương pháp RT-PCR do ưu điểm nhanh, nhạy, đặc hiệu, giảm các bước sau
PCR, từ đó giảm nguy cơ nhiễm. Hiện nay kĩ thuật Real-time RT-PCR ngày càng
được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh trên người, động vật
và thực vật. Nhiều công trình đã xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện
PRRSV sử dụng mẫu dò Taqman hoặc SYBR đã đư ợc công bố
[9],[16],[45].
Ngoài ra, nhiều nước cũng đã thương mại hóa các bộ kit chẩn đoán PRRSV bằng
kĩ thuật Real-time RT-PCR như PRRSV Real Time RT-PCR kit (Shanghai ZJ
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu
Lê Thùy Duyên 16
Bio-Tech Co., Ltd), Real-Time PCR PRRSV Specific Reagents (Tetracore, Inc),
ADIAVET® PRRS EU/NA (Adiagene, France) [53]…
1.9. Phương pháp Real-time RT-PCR
Hình 1. 6: Thuốc nhuộm liên kết DNA trong phản ứng Real-Time PCR.
Ưu điểm của việc sử dụng thuốc nhuộm liên kết DNA là thiết kế phản ứng
đơn giản (chỉ cần 2 mồi, không cần thiết kế mẫu dò), kiểm tra được nhiều gene
nhanh chóng mà không cần phải thiết kế các mẫu dò khác nhau (ví dụ, xem xét
hiệu quả biểu hiện gene từ nhiều gene trong một thí nghiệm microarray), chi phí
ban đầu thấp (mẫu dò tốn kém hơn), và có khả năng thực hiện một phân tích
melt-curve (đường cong nóng chảy) để kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng
khuếch đại. Tuy nhiên trở ngại lớn nhất của thuốc nhuộm liên kết DNA là chúng
không đặc hiệu, nghĩa là chúng liên kết với bất kỳ DNA mạch đôi nào. Kết quả
là, sự hiện diện của các sản phẩm không đặc hiệu trong phản ứng Real-Time
PCR có thể làm tăng lượng dấu hiệu huỳnh quang tổng và ảnh hưởng đến tính
chính xác của kết quả định lượng. Một bất lợi khác là không thể sử dụng thuốc
nhuộm liên kết DNA cho phản ứng multiplex bởi vì ta không thể phân biệt được
dấu hiệu huỳnh quang từ các sản phẩm khuếch đại khác nhau.
b. Hoá chất phát huỳnh quang dựa trên mồi và mẫu dò:
Luận văn Thạc sĩ Chương 1. Tổng quan tài liệu
Lê Thùy Duyên 18
Hoá chất phát huỳnh quang dựa trên mồi và mẫu dò được sử dụng phổ
biến hiện nay là mẫu dò Taqman. Đó là một trình tự oligonucleotide đặc hiệu có
gắn chất huỳnh quang. Cũng được biết đến như là phản ứng 5’exonuclease, phản
ứng Taqman sử dụng khả năng 5’-exonulease của các DNA polymerase chịu
nhiệt hiện nay. Mẫu dò Taqman đư ợc gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’
Chất hấp thụ huỳnh quang thích hợp
FAM
BHQ1, DABCYL, TAMRA
TET
BHQ1, DABCYL
HEX
BHQ1, BHQ2, DABCYL
TAMRA
BHQ2, DABCYL
Texas Red
BHQ2, BHQ3, DABCYL
ROX
BHQ2, BHQ3, DABCYL
Cy5
BHQ2, BHQ3
Copyright: Tài liệu đại học ©