Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iBỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
NGUYỄN MINH THANH
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN
MẮC HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN
NUÔI TẠI HUYỆN VĂN CHẤN – TỈNH YÊN BÁI, ỨNG
DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR TRONG CHẨN ðOÁN
LUẬN VĂN THẠC SỸ NÔNG NGHIỆP
Hà Nội - 2013
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
i
LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn
này là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn
này đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được ghi rõ
nguồn gốc.
Hà Nội, tháng 10 năm 2013
Tác giả luận văn
Nguyễn Minh Thanh
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
ii
LỜI CẢM ƠN
Cho đến nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình. Nhân dịp
này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến toàn thể thầy cô giáo trong
khoa Thú y, đặc biệt PGS.TS Nguyễn Thị Lan người hướng dẫn khoa học và
tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
1.1.1. Khái quát về lịch sử hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn
(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) 3
1.1.2 Tình hình nghiên cứu PRRS trên thế giới và trong nước 5
1.2. Virus PRRS 10
1.2.1 Hình thái cấu trúc của virus PRRS 10
1.2.2. Phân loại virus PRRS 12
1.2.3. Sức đề kháng của virus PRRS 13
1.3. Dịch tễ học của bệnh 13
1.3.1. Động vật cảm nhiễm 13
1.3.2. Phương thức lây truyền 14
1.3.3. Cơ chế sinh bệnh 15
1.4. Triệu chứng của lợn mắc PRRS 17
1.4.1. Lợn nái 17
1.4.2. Lợn đực giống 17
1.4.3. Lợn con theo mẹ 17
1.4.4 Lợn con cai sữa và lợn choai 18
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iv
1.5. Bệnh tích của lợn mắc PRRS 18
1.5.1. Lợn nái mang thai 18
1.5.2. Lợn nái nuôi con, lợn choai và lợn vỗ béo 18
1.5.3. Lợn con theo mẹ 18
1.6. Các phương pháp chẩn đoán PRRS 19
1.6.1. Chẩn đoán lâm sàng 19
1.6.2 Chẩn đoán bằng phương pháp giải phẫu bệnh 19
1.6.3. Chẩn đoán bằng phương pháp huyết thanh học 19
1.6.4. Kỹ thuật RT - PCR 20
CHƯƠNG II ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
3.7. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch trên một số cơ quan của lợn mắc
PRRS 58
3.8. Kết quả xác định virus PRRS bằng phương pháp RT-PCR 63
3.8. Kết quả xác định virus PRRS bằng phương pháp RT-PCR 63
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 65
Kết luận 65
Đề nghị…………………………………………………………………………… 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
STT Tên viết tắt Tên ñầy ñủ
1 CPE Cytopathogenic Effect
2 ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
3 HE Hematoxyline Eosin
4 IHC Immunohistochemistry
5 IFA Immunofluorescent assay
6 PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome
7 PRRSV Porcine reproductive and respiratory syndrome virus
8 RT-PCR Reverse transcription polymerasae chain reaction
9 TCID
50
50% Tissue culture infective dose
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vii
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Hình 3.1. Nái bị sảy thai 47
Hình 3.2. Lợn sốt, chán ăn 47
Hình 3.3. Lợn khó thở 47
Hình 3.4. Tím tai 47
Hình 3.5. Lợn con tiêu chảy 47
Hình 3.6. Lợn bị phát ban 47
Hình 3.7. Phổi viêm, hoại tử 51
Hình 3.8.Tím tai 51
Hình 3.9. Hạch lâm ba sưng, tụ máu 51
Hình 3.10. Thận xuất huyết điểm 51
Hình 3.11. Hạch lâm ba sưng, tụ máu 51
Hình 3.12. Lách nhồi huyết 51
Hình 3.13. Viêm kẽ phồi 57
Hình 3.14. Viêm kẽ phồi 57
Hình 3.15. Hạch lâm ba viêm, hoại tử 57
Hình 3.16. Hạch lâm ba viêm, hoại tử 57
Hình 3.17. Thận xuất huyết 57
Hình 3.18. Thận xuất huyết 57
Hình 3.19. Virus tập trung ở phổi (IHCx10 62
Hình 3.20. Virus tập trung ở phổi (IHCx40) 62
Hình 3.21. Virus phân bố ở hạch (IHCx10) 62
Hình 3.22. Virus phân bố ở hạch (IHCx40) 62
Hình 3.23. Kết quả phản ứng RT- PCR với mồi ORF5 64
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
1
MỞ ðẦU
Tính cấp thiết của ñề tài.
Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn - PRRS (porcine
Xuất phát từ những thực tế trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
" Nghiên cứu một số ñặc ñiểm bệnh lý của lợn mắc hội chứng rối
loạn hô hấp và sinh sản nuôi tại huyện Văn Chấn - tỉnh Yên Bái, ứng
dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn ñoán ".
Mục ñích của ñề tài
- Làm rõ một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của lợn mắc hội chứng rối loạn
hô hấp và sinh sản nuôi tại địa bàn huyện Văn Chấn - Tỉnh Yên Bái.
- Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chẩn đoán bệnh.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài
- Cung cấp các thông tin nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc chẩn đoán,
phòng và chống dịch bệnh có hiệu quả.
- Tạo cơ sở để giúp các nhà quản lý, hộ chăn nuôi đưa ra các biện pháp
tái đàn nhanh chóng và bền vững sau khi dịch xảy ra, giúp nâng cao hiệu quả
trong chăn nuôi.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
3
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về lịch sử và tình hình nghiên cứu Hội chứng rối loạn hô
hấp và sinh sản trên lợn
1.1.1. Khái quát về lịch sử hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn
(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS)
Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn là bệnh truyền nhiễm nguy
hiểm của lợn mọi nòi giống, mọi lứa tuổi (lợn nái, lợn con theo mẹ, lợn con
sau cai sữa, lợn choai, lợn thịt và lợn đực giống). Triệu chứng lâm sàng đặc
trưng ở cơ quan hô hấp và sinh sản. Lợn nái chửa bị bệnh, dấu hiệu rõ nhất là
sảy thai, đẻ non, thai chết lưu, lợn sinh ra chết yểu, chậm động dục trở lại sau
cai sữa (Đào Trọng Đạt, 2008 [3]). Tỷ lệ bị bệnh, tỷ lệ chết cao hay thấp phụ
ra ở 25 tỉnh với hơn 180.000 lợn mắc bệnh và 45.000 con đã bị chết.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
5
Ở Việt Nam, theo thông báo của Cục Thú y, 2007 [2] các kết quả điều
tra huyết thanh học tại một số trại lợn giống của các tỉnh phía Nam đã phát
hiện có sự lưu hành của PRRS virut chủng cổ điển, độc lực thấp. PRRS đã
xuất hiện và lưu hành tại nước ta từ năm 1997. Tuy nhiên sự bùng phát thành
dịch và gây tổn thất đáng báo động cho ngành chăn nuôi lợn thực sự mới bắt
đầu từ tháng 3 năm 2007.
1.1.2 Tình hình nghiên cứu PRRS trên thế giới và trong nước
1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Đã có nhiều nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ học, căn bệnh, cơ chế sinh
bệnh, triệu chứng, bệnh tích của PRRS và biện pháp phòng chống.
Nelson EA, Christopher - Henning J, Drew T, Wensvoort G, Collins JE,
Benfield DA, 1993 [30] trên cơ sở phân tích cấu trúc gen của các chủng PRRSV
phân lập từ các vùng địa lý khác nhau đã xác định được 2 nhóm virut là:
- Nhóm 1: Gồm những virut thuộc dòng Châu Âu, đại diện là chủng
Lelystad, gồm 4 subtyp.
- Nhóm 2: Gồm những virut thuộc dòng Bắc Mỹ, đại diện là chủng virut
2332.
Meng XJ và cs [26]; Kapur V và cs 1996 [23], bằng kết quả phân tích
trình tự nucleotid và axit amin của VR 2332 và virut Lelystad cho rằng các
virut này đang tiến hoá do đột biến ngẫu nhiên và do tái tổ hợp trong gen.
Kết quả nghiên cứu của Thanawongnuwech R và cs, 1998 [36] cho biết
thời gian nhiễm trùng huyết, tốc độ bài thải và tái sản trong đại thực bào của
PRRSV ở lợn 4 đến 8 tuần tuổi dài hơn so với lợn 16 đến 24 tuần tuổi.
Theo Wills RW và cs, 1997 [44] khi bị nhiễm PRRSV sẽ làm tăng tính
mẫn cảm của lợn đối với Streptococcus suis serotyp 2, và làm trầm trọng thêm
tình trạng bệnh do Salmonella choleraesuis trong cơ thể lợn khi có kế phát.
cảm, đã làm thay đổi phản ứng huyết thanh của những lợn này.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
7
Nhiều nhà khoa học đã khẳng định, đặc trưng của PRRSV là nhiễm
trùng kéo dài. Đây là một đặc trưng của nhóm Arterivirut. Sự tồn tại dai dẳng
của PRRSV gây ra lây nhiễm "âm ỉ", virut hiện diện ở mức độ thấp nhất trong
cơ thể và giảm dần theo thời gian (Wills, 1997 [43]).
Cơ chế mà virut sử dụng để tấn công vào hệ thống miễn dịch của cơ thể
chưa được làm rõ. Thời gian tồn tại của virut được nói đến trong nhiều nghiên
cứu, nhưng kết quả khác nhau. Sử dụng phản ứng khuyếch đại gen (PCR)
ARN đã phát hiện ở lợn đực hậu bị (6-7 tháng tuổi) PRRSV tồn tại tới 120
ngày sau khi gây nhiễm (Batista, 2002 [15]) và bài thải virut sang động vật
khác kéo dài đến 36 ngày (Bierk, 2001 [17]).
Về thời gian tồn tại của PRRSV trong quần thể: Bằng gây bệnh thực
nghiệm, Horter DC, 2002 [22] đã phát hiện được PRRSV trong 100% cá thể
trong tổng số 60 lợn 3 tuần tuổi sau 63 ngày gây nhiễm và 90% sau 105 ngày
gây nhiễm.
Nếu lợn mẹ bị nhiễm bệnh trong khoảng 85-90 ngày của giai đoạn
mang thai, PRRSV có thể nhiễm sang bào thai, lợn con sinh ra mắc bệnh bẩm
sinh ngay sau khi sinh. Trong những trường hợp này, ARN của PRRSV được
phát hiện trong huyết thanh vào ngày 120 sau khi đẻ (Benfield D, 1992 [16]).
Lợn chỉ báo được nhốt lẫn với những lợn mắc bệnh này (98 ngày sau khi
sinh) đã phát hiện kháng thể PRRSV vào ngày 14 sau đó (Benfield D, 1992
[16]). Sự tồn tại dai dẳng của PRRSV trong từng cá thể dao động trong
khoảng thời gian từ 154 đến 157 ngày sau khi nhiễm [22,12].
*) Truyền lây gián tiếp
Nhiều thông báo cho rằng dụng cụ, thiết bị, ủng và quần áo bảo hộ của
công nhân chăn nuôi là những nguồn mang PRRSV tiềm tàng lây nhiễm cho
lợn mẫn cảm (Otake,2002 [34].
bản năng di trú của chúng và khuynh hướng làm tổ ở các đầm phá gần các trại
lợn. Và vì PRRSV có thể sống sót trong nước đến 11 ngày và trong mương
chứa chất thải của lợn tới 7 ngày. Đây có thể là giả thuyết đáng tin cậy, tuy
nhiên hiện nay vẫn còn nhiều tranh cãi về vấn đề này.
Một số nghiên cứu khác đã cho thấy rằng lợn gây bệnh thực nghiệm có
thể lây nhiễm cho lợn chỉ báo qua không khí ở khoảng cách 1m. Theo
Torremorel và cs, 1997 [37], hiện nay người ta đã chứng minh rằng virus
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
9
sống có thể lây lan tới 105 m qua sử dụng mô hình ống thẳng áp lực âm, dẫn
tới lây nhiễm lợn chỉ báo mẫn cảm.
1.1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam, Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn đã được
phát hiện từ năm 1997 khi nhập 51 lợn giống từ Mỹ. Bằng phản ứng huyết
thanh học đã xác định được 10 trong số 51 lợn giống trên có phản ứng dương
tính với PRRSV.
Trong các năm 2003-2005, Trần Thị Bích Liên và Trần Thị Dân,
2003[11] bằng kỹ thuật ELISA, khảo sát 1082 mẫu huyết thanh của lợn thu
nhận từ 21 trại nuôi công nghiệp và hộ chăn nuôi của các tỉnh thành thuộc
miền Đông Nam Bộ cho thấy:
- 85,71% số cơ sở chăn nuôi phát hiện có lợn nhiễm PRRSV và
36,78% số mẫu huyết thanh dương tính.
- Lợn hậu bị và lợn thịt lúc giết mổ có tỉ lệ nhiễm cao nhất: 51,24% và
49,25%.
- Khu vực chăn nuôi tập trung có tỷ lệ nhiễm (56,72%) cao hơn so với
khu vực chăn nuôi gia đình (29,98%).
- Trong 130 mẫu huyết thanh dương tính có 59,23% số mẫu nhiễm
chủng Bắc Mỹ, 36,92% số mẫu nhiễm cả hai chủng Bắc Mỹ và Châu Âu, chỉ
có 3,8% số mẫu nhiễm chủng Châu Âu.
nhân nucleocapxit kích thước 25 - 35 nm. Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
11Hình 1.2. Hình thái Virus PRRS
Sự nhân lên của virus không bị ảnh hưởng khi dùng hợp chất ức chế
tổng hợp AND là 5 - bromo - 2 deoxyuridin, 5 - iodo - 2 deoxyuridin và
mitomicin C chứng tỏ acid nucleic đó là ARN. Sợi ARN này có khối lượng
khoảng 15.1 kb.
Hình 1.3. Hình ảnh cấu trúc hệ gen của virus PRRS
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
12
Virus PRRSV có các loại Protein cấu trúc bao gồm:
- Nuclecapsid Protein (N, ORF7) (ORF: open reading frame) khoảng
14 -15 kDa, đây là Protein vỏ bọc nhân.
- Membrane Protein (M, ORF6) khoảng 18 - 19 kDa là Protein liên
kết vỏ bọc.
- Envenlope Glycoprotein (E, ORF5) từ 24 - 25 kDa là Protein liên
kết vỏ bọc kết hợp glycogen.
Ngoài ra còn có 3 loại Glycoprotein cấu trúc ít thấy hơn và được ký hiệu là
ORF 2, 3 và 4.
1.2.2. Phân loại virus PRRS
Về tính đa dạng di truyền, virus PRRS có hai chủng chính: Chủng virus
có nguồn gốc ở Châu Âu (virus Lelystad - LV) và chủng virus có nguồn gốc ở
Bắc Mỹ (VR - 2332). Ngoài sự khác biệt giữa các lần phân lập người ta đã
Các chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit dễ dàng tiêu
diệt virus. Ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng.
1.3. Dịch tễ học của bệnh
1.3.1. ðộng vật cảm nhiễm
Mọi giống lợn ở các lứa tuổi đều cảm nhiễm với PRRSV. Các cơ sở
chăn nuôi công nghiệp với quy mô lớn, bệnh thường lây lan nhanh, tồn tại lâu
dài trong đàn nái, rất khó thanh toán. Lợn nái thường truyền mầm bệnh cho
bào thai (Lê Văn Năm, 2007 [8], Đào Trọng Đạt, 2008 [3]).
Theo tổ chức Nông lương thế giới (FAO), PRRSV không lây truyền và
gây bệnh cho người và các động vật khác. Tuy nhiên, một số loại thuỷ cầm
như vịt trời (Mallard duck) đã được chứng minh là rất mẫn cảm với virus
PRRS và virus có thể nhân lên ở loài vịt này. Đây chính là nguồn phát tán
virus ra diện rộng, khó khống chế.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
14
1.3.2. Phương thức lây truyền
Virus có trong dịch mũi, nước bọt, phân, nước tiểu của lợn ốm, hoặc
mang trùng và phát tán ra môi trường. Tinh dịch của lợn đực giống cũng được
xác định là nguồn phát tán mầm bệnh, virus ở tinh dịch cũng có thể lây nhiễm
sang bào thai. Ở lợn mẹ mang trùng, virus có thể lây nhiễm qua bào thai từ
giai đoạn giữa thai kỳ trở đi và virus cũng được bài thải qua nước bọt và sữa.
Lợn trưởng thành có thể bài thải virus trong 14 ngày trong khi đó lợn con và
lợn choai bài thải virus tới 1 - 2 tháng.
Virus có khả năng phân tán thông qua các hình thức: Vận chuyển lợn
mang trùng, phân tán theo gió (có thể đi xa tới 3 km), qua bụi, bọt nước, dụng
cụ chăn nuôi và dụng cụ bảo hộ lao động nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo và có
thể do một số chim hoang dã.
Sự lây truyền qua không khí là quan trọng trong việc phát tán virus
giết chết đại thực bào (tới 40%). Đại thực bào bị giết chết nên sức đề kháng
của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng. Do vậy lợn bệnh thường dễ dàng
bị nhiễm khuẩn kế phát.
Có nhiều báo cáo về nhiễm trùng kế phát ở đàn lợn trong ổ dịch PRRS,
đặc biệt ở chuồng nuôi lợn sơ sinh. Tác nhân chủ yếu liên quan đến nhiễm
trùng kế phát là: Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, Salmonella
cholerasuis, Pasteurella multocida và Actinobacillus pleuropneumoniae, SIV,
EMCV, virus giả dại (Aujeszky), Porcine cytomegalovirus, Porcine
respiratory coronavirus và Porcine paramyxovirus.
Các nhà nghiên cứu đã phân lập virus từ phổi, gan, lách và huyết thanh
hoặc dịch cơ thể lợn con sinh ra cả sống và chết nhưng không phân lập được
từ thai chết khô, họ cũng phát hiện kháng thể chống PRRSV đặc hiệu trong
dịch xoang ngực hoặc sữa đầu. Dấu hiệu này chỉ ra rằng truyền bệnh qua nhau
thai là phổ biến trong giai đoạn cuối kỳ chửa, nhưng cơ chế của giảm sinh sản
còn chưa được hiểu biết.
Copyright: Tài liệu đại học ©