BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
***
LÊ DUY CƯỜNG
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN
TỰ DO TRONG MÁU VÀ NƯỚC TIỂU BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG
Chuyên ngành : Hóa sinh
Mã số : 60.72.04
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ NỘI TRÚ
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN THỊ CHI MAI
HÀ NỘI - 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
***
LÊ DUY CƯỜNG
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN
TỰ DO TRONG MÁU VÀ NƯỚC TIỂU
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
SIÊU HIỆU NĂNG
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ NỘI TRÚ
HÀ NỘI – 2013
LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thị Chi Mai –
Trưởng khoa xét nghiệm Sinh Hóa – Bệnh Viện Nhi Trung Ương, phó trưởng
khoa Kỹ Thuật Y Học- Trường Đại Học Y Hà Nội, người đã cho em nền tảng
kiến thức trên con đường nghiên cứu khoa học và tận tình hướng dẫn em hoàn
thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị ở Bộ môn Hóa sinh
Trường Đại Học Y Hà Nội đã đã dìu dắt và giúp đỡ em trong suốt quá trình

XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨ 22
2.1.1.1. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 31
2.1.1.1. HÓA CHẤ 31
ỨU : 33
2.1.2.1. TIÊU CHUẨN LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG NGHIÊ 33
ỂU 33
2.1.2.2. TIÊU CHUẨN LOI 33
IÊN CU2.2.1 . NGUYÊN LÝ K 34
G TẠODẪNXUẤT 36
2.2.2 . T HIẾT LẬP CÁC THÔNG SỐ CHO H 36
H SINH ỌC BẰNG UPLC 40
2.2.4.1 . KHẢO SÁT ĐỘ TUYẾN 40
N KHI ĐT ĐƯỢ R 2 ≥ 0,99 41
2.2.4.2 . KHẢ O SÁT GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (OQ)VÀ 41
THE CÔG THỨC: 41
LOD = X + 2SD 41
2.2. 41
42
THU HỒI THEO CÔNG THỨC: 42
TIÊU CHUẨN CHẤP NHẬN: THEO AOAC, ĐỐI 42
I ỒG ĐỘ CẤT PHÂN ÍCH Ở MỨC 42
10 - 6 - 10 -4 MOL/L , ĐỘ THU HỒI C 42
MỨ 80-10%. 42
[ 42
25 42
] 42
2. 24 42

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AOAC Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà

Derivation peak (Deri)
Ornithine (Orn)
α-Aminoadipic acid (AADA)
Ethanolamine (EA) Phenylalanine (Phe)
Alanine (Ala)
γ-Amino-N-butyric acid
(GABA)
Phosphoserine (PSer)
allo-Isoleucine (aIle)
Glutamic acid (Glu) Phosphoethanolamine
(PEA)
α-Amino-N-butyric acid
(AABA)
Glutamine (Gln) Proline (Pro)
Ammonia (NH
3
) Glycine (Gly) Sarcosine (Sar)
Anserine (Ans)
Histidine (His) Serine (Ser)
Arginine (Arg)
Homocystine (HCys) Taurine (Tau)
Asparagine (Asn)
Hydroxylysine 1 (Hyl1) Threonine (Thr)
Aspartic Acid (Asp)
Hydroxylysine 2 (Hyl2) Tryptophan (Trp)
β-Alanine (B-Ala)
Hydroxyproline (HyPro) Tyrosine (Tyr)
β-Aminoisobutyric acid
(BAIB)
Isoleucine (Ile) Urea

ỨU : 33
ỨU : 33
2.1.2.1. TIÊU CHUẨN LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG NGHIÊ 33
2.1.2.1. TIÊU CHUẨN LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG NGHIÊ 33
ỂU 33
ỂU 33
2.1.2.2. TIÊU CHUẨN LOI 33
2.1.2.2. TIÊU CHUẨN LOI 33
IÊN CU2.2.1 . NGUYÊN LÝ K 34
IÊN CU2.2.1 . NGUYÊN LÝ K 34
G TẠODẪNXUẤT 36
G TẠODẪNXUẤT 36
2.2.2 . T HIẾT LẬP CÁC THÔNG SỐ CHO H 36
2.2.2 . T HIẾT LẬP CÁC THÔNG SỐ CHO H 36
H SINH ỌC BẰNG UPLC 40
H SINH ỌC BẰNG UPLC 40
2.2.4.1 . KHẢO SÁT ĐỘ TUYẾN 40
2.2.4.1 . KHẢO SÁT ĐỘ TUYẾN 40
N KHI ĐT ĐƯỢ R 2 ≥ 0,99 41
N KHI ĐT ĐƯỢ R 2 ≥ 0,99 41
2.2.4.2 . KHẢ O SÁT GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (OQ)VÀ 41
2.2.4.2 . KHẢ O SÁT GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG (OQ)VÀ 41
THE CÔG THỨC: 41
THE CÔG THỨC: 41
LOD = X + 2SD 41
LOD = X + 2SD 41
2.2. 41
2.2. 41
42
42

not found
Hình 3.5. Kết quả phân tích ở nhiệt độ 430 C Error: Reference source not
found
Hình 3.6. Kết quả phân tích ở nhiệt độ 480 C: Error: Reference source
not found
Hình 3.7. Sự cải thiện hiệu năng phân tách khi thay đổi thành phần pha di
động A-B Error: Reference source not found
Hình 3.8: Kết quả thử nghiệm với dung dịch B tự pha. .Error: Reference
source not found
Hình 3.9: Kết quả phân tích mẫu máu của bệnh nhân MSUD (1) 59
Hình 3.10: Kết quả phân tích mẫu máu của bệnh nhân MSUD (2) Error:
Reference source not found
Hình 3.11. Kết quả phân tích mẫu máu của bệnh nhân citrullinemia (1)
Error: Reference source not found
Hình 3.12. Kết quả phân tích mẫu nước tiểu của bệnh nhân citrullinemia(1)
Error: Reference source not found
Hình 3.13. Kết quả phân tích mẫu máu của bệnh nhân citrullinemia (2)
Error: Reference source not found
Hình 3.14. Kết quả phân tích mẫu máu của bệnh nhân viêm gan virus cấp
Error: Reference source not found
Hình 3.15. Kết quả phân tích acid amin máu của bệnh nhân suy gan cấp
và bán cấp Error: Reference source not found
Hình 3.16. Kết quả phân tích acid amin máu của bệnh nhân viêm gan
chưa rõ nguyên nhân Error: Reference source not found
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Định lượng acid amin tự do trong máu và nước tiểu là một công cụ
quan trọng trong chẩn đoán và theo dõi các rối loạn chuyển hóa bẩm sinh
(RLCHBS). Đây cũng là một công cụ quan trọng để theo dõi tình trạng dinh
dưỡng ở bệnh nhân được nuôi dưỡng bằng đường tĩnh mạch. Sử dụng phân

thấp và đòi hỏi về bảo trì phức tạp nên kỹ thuật này trở nên không phù hợp
với các phòng xét nghiệm.
Trong những năm gần đây, một phương pháp mới đã được ứng dụng để
thay thế cho phương pháp sắc ký trao đổi ion: sắc ký lỏng siêu hiệu năng
(UPLC). So với sắc ký trao đổi ion, phương pháp UPLC có ưu thế vượt trội ở
hiệu năng và rút ngắn được thời gian phân tích. Khoa Hóa sinh bệnh viện Nhi
Trung Ương đã được trang bị hệ thống UPLC nhằm phân tích acid amin tự do
trong các dịch sinh vật, phục vụ cho việc chẩn đoán, sàng lọc, theo dõi điều trị
một số RLCHBS. Để có thể áp dụng thiết bị UPLC vào phân tích acid amin tự
do, cần phải đánh giá phương pháp trước khi đưa vào sử dụng. Do đó chúng
tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu định lượng acid amin tự do trong máu và
nước tiểu bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng” với hai mục tiêu:
1. Đánh giá quy trình định lượng acid amin tự do trong máu và nước
tiểu bằng phương pháp UPLC.
2. Ứng dụng kỹ thuật phân tích acid amin tự do trong máu và nước tiểu
bằng UPLC ở một số bệnh nhi nghi ngờ rối loạn chuyển hóa.
3
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Các phương pháp sắc ký
1.1.1. Lịch sử phương pháp sắc ký
Cùng với quang phổ, sắc ký từ lâu đã trở thành một trong hai công cụ quan
trọng và không thể thiếu được của hóa phân tích. Có thể nói, nhờ những tính
năng ưu việt của mình, sắc ký đã trở thành nền tảng quan trọng trong các ứng
dụng để phân tích, tách chiết các hợp chất cần nghiên cứu. Trong các phương
pháp tách hiện nay, sắc ký là phương pháp hữu hiệu nhất để tách các chất ra khỏi
một hỗn hợp phức tạp về thành phần và hàm lượng. Phát minh ra sắc ký có thể
xem là một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực hóa học ở thế kỷ XX.
Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsve đã phát minh ra kỹ thuật sắc
ký vào năm

Cùng trong một điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là
hằng định và các chất khác nhau thì có thời gian lưu khác nhau tùy thuộc vào
bản chất, cấu tạo và tính chất của chất đó. Vì vậy thời gian lưu là đại lượng
định tính các chất.
Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đổi thì thời gian lưu
có thể thay thế bằng thể tích lưu. Thể tích lưu là thể tích pha động thu được
sau cột trong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu.
Hệ số chọn lọc
Hai chất chỉ được tách ra khi chúng có các giá trị k’ khác nhau, hệ số
chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký
5
Ở đây ta quy ước chất B bị lưu giữ mạnh hơn chất A, như vậy α luôn lớn
hơn 1, càng lớn thì khả năng tách của hai chất càng rõ. Thường phân tích
trong điều kiện trong khoảng 1,5 đến 2.
S ố đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết
Hiệu lực cột thường được biểu thị qua hai thông số: Số đĩa lý thuyết (N)
hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H). Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết,
ở mỗi tầng sự phân bố các chất tan vào hai pha đạt một trạng thái cân bằng
mới. Mỗi tầng được giả định như một lớp pha tĩnh có chiều cao H. Đĩa lý
thuyết được định nghĩa như là một khu vực của hệ thống phân tách mà trong
đó thiết lập một cân bằng nhiệt động học giữa nồng độ trung bình của chất tan
trong pha tĩnh và trong pha động.
Số đĩa lý thuyết N được tính theo các công thức:
Trong đó: W : Là chiều rộng peak ở đáy peak
W1/2 : Là chiều rộng peak đo ở nửa chiều cao peak
Chiều cao của đĩa lý thuyết được tính theo công thức :
Trong đó L là chiều cao của cột sắc ký. Với một điều kiện sắc ký nhất
định, chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa lý thuyết (N) là hằng định đối với
mỗi chất phân tích.
Độ phân giải (R

ký khí trên cột. Thông thường mỗi một chất có đặc tính lý hóa phân tử mà
được đẩy ra khỏi cột sắc ký với một đỉnh duy nhất ở một thời điểm nhất định
trên sắc ký đồ. Khi một sản phẩm nào đó xuất hiện hai đỉnh trên sắc ký đồ thì
chắc chắn sản phẩm đó chứa hai chất khác nhau và ngược lại
−
Xác định trọng lượng phân tử protein ngay cả khi protein chưa được tinh
sạch: Trong trường hợp này thường áp dụng sắc ký lọc gel, các chất được y
ra khỏi cột sắc ký phụ thuộc vào kích thước và trọng lượng phân tử của
chúng. Trên cơ sở sắc ký của các chất có trọng lượng phn tử chuẩn trong ùng
điều kiện sẽ tính toán được trọng lượng của chất cần xác định
−
Tinh chế một chất: Nhờ khả năng phân tách rất ưu việt mà sắc ký trở
thành một công cụ vô cùng hữu hiệu trong quá trình tinh chế một chất từ các
nguồn khác nha
1.1. Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC
Thuật ngữ “siêu hiệu năng” được dịch từ cụm từ viết liền
Ultraperformanc ® được đăng ý bảo hộ độc quyền bởi tập đoàn Waters của
Hoa Kỳ. Hệ thống UPLC ứng dụng trong phân tích acid amin có đặc điểm:
sử dụng áp suất cao chạy trên các cột phân tích có kích thước tiểu phần 17
m , đường kính cột 2,1m , chiều dài cột 150mm. Hệ thống cho phép nhận
dạng và định lượng 42 loại acid amin phổ biến và các hợp chất có liên quan
một với tốc độ 32 phút/ mu . Thời gian phân tích được rút ngắn trongk hi độ
8
nhạy, độ đặc hiệu và hiệu năng phân tách được cải thiện là ưu điểm của hệ
thống UPL
UPLC là công nghệ cải tiến từ HPLC, với nguyên tắc cơ bản của sắc ký
phân bố pha đảo (pha tĩnh ít phân cực và pha di động phải phân cực). Trong
HPLC, để tăng hiệu năng tách của cột sắc ký, người ta sử dụng chất nhồi cột
với kích thước rất nhỏ, thường dưới 10µm với đường kính các xoang xốp bên
trong các hạt từ 80-120Å cho phân tích các phân các phân tử nhỏ và 300Å

phần sẽ làm tăng hiệu năng phân tách, mặt khác, hiệu năng này sẽ giảm nếu
tăng tốc độ pha động hoặc tăng tốc độ tuyến tính. Với các tiểu phần có kích
thước nhỏ hơn 2.5 µm, không chỉ có ý nghĩa làm tăng hiệu suất mà hiệu suất
còn không bị giảm khi tăng tốc độ pha động (giúp giảm thời gian chạy sắc ký
bằng cách tăng áp suất của bơm) hoặc khi tăng tốc độ tuyến tính . Bằng việc
sử dụng các tiểu phần có kích thước nhỏ hơn, tốc độ và số đỉnh sắc ký trên
một đơn vị thời gian (độ phân giải) được mở rộng tới những giới hạn mới–
được gọi là sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC. Trong HPLC, áp suất của bơm
tối đa là 400 bars, nhưng trong UPLC thì hệ thống bơm có thể đạt đến áp
suất 1000 bars hoặc cao hơn. Điều này cho phép sử dụng các tiểu phần có
kích thước bé hơn ( < 2µm) và tạo ra tốc độ pha di động lên đến 5mL/ phút.
Sử dụng tiểu phần có kích thước nhỏ hơn cho phép
10
◊ Đạt được độ phân giải tốt hơn hiệu quả phân tách
◊
Rút ngắn thời gian chạy sắc k
◊
Tăng độ nhạy do đỉnh sắc ký đồ nhọn hơn và cao hơ n
Công nghệ này đã tận dụng đầy đủ những nguyên lý sắc ký để chạy cột
phân tách được nhồi bằng các loại tiểu phần có kích thước bé hơn và hoặc
có tốc độ pha di động nhanh hơn để làm tăng tốc độ, tăng độ phân giải và
độ nhạy
1.1. Hệ thống UPL
Hệ thống bao gồm
1) Hệ thống bơm cao áp và quản lý dung mô
- Bộ quản lý dung môi bốn dòng dung mô
- Bộ quản lý mẫu với Flow Through Needl
- Bộ ổn nhiệt cho cột với bộ tiền làm nóng linh hoạ
- Khay chứa dung mô
- Bộ kít hoạt động cho m

sử dụng bộ phát hiện tín hiệu huỳnh quang, và ở mức pmol với detector tử
ngoại (UV- ultraviolet).
1.2.2. Các mẫu bệnh phẩm dùng cho phân tích
Khi tiến hành sàng lọc thường quy cho các rối loạn acid amin, tốt nhất
là nên tiến hành cả trên mẫu máu và nước tiểu. Sự giảm nhẹ của các loại acid
amin chỉ có thể phát hiện được trong máu. Ngược lại, sự lắng đọng của các acid
amin với ngưỡng lọc rất thấp của thận cũng như các khiếm khuyết vận chuyển ở
thận sẽ để lại bằng chứng trong nước tiểu. Ý nghĩa trong chẩn đoán của định
lượng acid amin niệu và máu khác xa nhau: Ví dụ, tăng cystein, arginine, lysine
và ornithin trong nước tiểu là tiêu chuẩn chẩn đoán cho bệnh cystein niệu. Mặt
13
khác, sự tăng này nếu xảy ra trong máu lại liên quan tới ba hội chứng chuyển
hóa trong đó có sự tăng arginine, lysine hoặc ornithin tương ứng.
Dịch não tủy hiếm khi được sử dụng để chẩn đoán các khiếm khuyết
trong chuyển hóa các chất dẫn truyền thần kinh, mà được dựng nhằm cung
cấp thêm thông tin, xác định chẩn đoán và đánh giá mức liên quan của não.
Dịch kính có giá trị trong khám nghiệm tử thi của các RLCH khi không thể
lấy được nước tiểu và các thay đổi của máu sau khi bệnh nhân tử vong.
Nồng độ acid amin trong dịch kính là xấp xỉ tương đương với nồng độ của
chúng trong máu ngoại trừ glutamic, glycine, prolie chỉ bẳng 1/10 so với
trong huyết tương
Dịch ối cũng có giá trị giới hạn trong chẩn đoán trước sinh đối với các
bệnh acid amin. Không giống như các rối loạn acid hữu cơ, ở hầu hết các rối loạn
acid amin bẩm sinh, các chất chuyển hóa trung gian không tích tụ trước khi sinh,
mà phải sau khi sinh mới bắt đầu xuất hiện. Những kiểu thay đổi acid amin bất
thường trong nước ối chỉ có thể phát hiện được ở hai rối loạn chu trình urê: đó là
sự thiếu hụt enzyme argininosuccinate lyase bệnh argininosuccinic acid máu) và
argininosuccinate synthetase (bệnh citrulline máu.
1.2.3. Tình trạng lâm sàng và tiền sử bệnh
Thông tin lâm sàng một phần quan trọng trong chẩn đoán tại khoa