BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGUYỄN THANH TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG ARTESƯNAT
KHI CÓ MẬT DIHYDRO ARTEMISININ VÀ
(HOẶC) ACIDSƯCCINIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆUNẢNG CAO ( HPLC )
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ược sĩ ĐẠI HỌC
KHOÁ 1999-2004
Người hướng dẫn: PGS - TS. TRẦN ĐỨC HẬU
Th.s. VÕ NHỊ HÀ
Nơi thực hiện: PHÒNG THÍ NGHIỆM BỘ MÔN
HOÁ DƯỢC - TRƯỜNG ĐẠI HỌC
DƯỢC HANỘI
Thời gian thực hiện: 9/2003 - 5/2004
í4
I
ị
\
* . 'ĩ' ì
í* n
ì ị ~ V ị ị'
Lt-Ui
HÀ NỘI THÁNG 5 - 2004
ĨHl
íftj
LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS - TS Trần
Đức Hậu, Th.s. Vố Nhị Hà hai người thầy trực tiếp hướng dẫn, đã dành
nhiều công sức giúp đỡ và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong suốt
1.2.6 Độc tính 9
1.2.7 Chế phẩm 10
1.2.8 Chỉ định 10
1.3 Các phương pháp định lượng artesunat nguyên liệu
11
1.3.1 Phương pháp đo quang phổ hấp thu vùng tử ngoại 11
1.3.2 Phương pháp HPLC với detector u v 11
1.3.3 Phương pháp HPLC với detector khúc xạ k ế
12
1.3.4 Phương pháp HPLC với detector điện hóa
12
1.3.5 Phương pháp đo kiềm trong môi trường nước 13
1.3.6 Phương pháp đo kiềm trong môi trường khan 13
1.3.7 Phương pháp đo phổ hấp thụ vùng khả kiến dưới dạng muối
hydroxamat sắt
.
14
1.3.8 Các phương pháp định lượng khác 14
1.4 Các phương pháp định lượng artesunat trong viên nén đang áp dụng ở
nước ta
.
14
1.4.1 Phương pháp quang phổ 14
1.4.2 Phương pháp đo kiềm trong môi trường nước 15
1.5 Nhận xét và lựa chọn 15
1.6 Phương pháp HPLC
.
3.1 Xây dựng qui trình kỹ thuật để định lượng artesunat bằng phương pháp
HPLC 30
3.1.1 Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký 30
3.1.2 Khảo sát để lựa chọn điều kiện sắc ký
30
3.1.3 Thử tính thích hợp của hệ thống 32
3.2 áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng artesunat nguyên
liệu
33
3.3 Đánh giá phương pháp 34
3.3.1 Đánh giá tính chính xác của phương pháp
35
3.3.2 Đánh giá tính tuyến tính của phương pháp 35
3.3.3 Đánh giá tính đúng của phương pháp 37
3.3.4 Đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp
38
3.4 Bàn luận và kết quả
.
42
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
BẢNG CHỮ YIẾT TẮT
ART : Artesunat
DHA : Dihydro artemisinin
phát triển mạnh trở lại. Hiện nay ký sinh trùng sốt rét đã kháng lại hầu hết các
loại thuốc quen thuộc: Quinolin, Cloroquin, Quinacrin, Mefloquin, làm cho
việc điều trị sốt rét ngày càng trở nên khó khăn hơn [24]. Do vậy, ngày nay
việc nghiên cứu tìm ra và sản xuất thuốc mới chữa sốt rét đã trở thành một yêu
cầu cấp bách.
Vào đầu thập niên 70, các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết xuất được
# từ là cây Thanh hao hoa vàng một chất có tác dụng điều trị bệnh sốt rét gọi là
Quinghaosu (QHS) hay là artemisinin. ở Việt Nam, cây Thanh hao hoa vàng
cũng đã được trồng và chiết xuất được artemisinin. Chất này có vòng
1
Secquiterpen lacton và nhóm Peroxyl nội phân tử. Chất này đã được chứng tỏ
có hiệu lực chống sốt rét tốt với những bệnh nhân mắc chủng kháng thuốc,
hơn thế nữa artemisinin và các dẫn xuất của nó có khả năng vượt qua hàng rào
máu não nên rất có hiệu lực trong điều trị sốt rét thể não [10]. Tuy nhiên, do
độ tan của artemisinin trong nước kém và tỷ lệ tái phát sau khi dùng còn cao
nên tác dụng điều trị của artemisinin phần nào còn bị hạn chế. Để hoàn thiện
khả năng điều trị của artemisinin. Các nhà khoa học đã tiếp tục nghiên cứu và
bán tổng hợp ra một số dẫn xuất mới như: artesunat, arterether và artermether
có tác dụng điều trị cao hơn artemisinin, đồng thời có thể sử dụng cả đường
tiêm, trong số các chất đó thì artesunat được dùng phổ biến nhất hiện nay.
Nước ta hiện nay cũng đã tổng hợp được artesunat và đang đưa vào sản
xuất với quy mô lớn. Việc kiểm tra chất lượng nguyên liệu và thành phẩm
artesunat là rất quan trọng, tuy nhiên trong thực tế việc định lượng artesunat ở
các cơ sở cho thấy còn nhiều điều bất cập, thường cho kết quả rất cao phụ thuộc
người định lượng.
Để xây dựng một phương pháp định lượng artesunat có tính đặc hiệu cao
đồng thời góp phần làm cơ sở xây dựng tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam,
trong khoá luận này chúng tôi tiến hành đề tài “Định lượng artesunat khi có
mặt dihydroartemisinin và (hoặc) acid succinic bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC)” với những mục tiêu sau:
chim hai lần, thành phiếm hẹp, phủ lông mềm, có mùi thơm, cụm hoa hình
cầu hợp thành một chùm kép, lá bắc tổng bao hình trứng hoặc hình bầu dục.
3
Hoa màu vàng nhạt, mỗi hoa gồm sáu hoa: giữa là hoa lưỡng tính, xung quanh
là hoa cái, hoa chỉ có kích thước 0,5 - lmm. Quả bế hình trứng, dài lmm, mặt
vỏ có tuyến chứa tinh dầu, trên thị trường tại Trung Quốc thường bị trộn một
cây khác gọi là hoàng cao hay xú cao cũng họ Cúc nhưng lá quanh năm màu
mới vàng, còn trước đó màu lục [13].
Thanh hao hoa vàng phân bố ở nhiều nơi trên thế giới như Trung Quốc,
Nhật Bản, ấn Độ, Bắc Mỹ, Iran. Mông cổ, Đông Âu, [11], [13].
Tại Việt Nam, Thanh hao hoa vàng còn có một số tên gọi khác như:
Thanh cao hoa vàng, ngải sĩ, ngải dại, ngải đắng, ngải hôi, ngải hoa vàng, cây
lá ngải, cây mọc hoang dại thành từng cụm dọc ven sông, suối, chân đồi nơi
ẩm thấp ánh sáng nhiều. Cây mọc nhiều ở các tỉnh phía Bắc như: Lạng Sơn,
Quảng Ninh, Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Hà Bắc, Vĩnh Phú, Tuyên
Quang, Hòa Bình, và dọc các tỉnh miền trung: Thanh Hóa, Nghệ An, .[10],
[13].
1.1.2. Thành phần hóa học của cây Thanh hao hoa vàng
Tất cả các bộ phận trong cây Thanh hao hoa vàng đều có chứa tinh dầu
và hàm lượng tinh dầu trong Thanh hao là rất khác nhau, nó phụ thuộc vào
giống và nơi trồng, dao động từ khoảng 0,5 - 0,6%. Tinh dầu có màu vàng
nhạt và có mùi long não với thành phần chủ yếu là: camphor, 1,8 - cineol, p
íamesen, p caryophylen, p cubeben, Artemisia ceton, p mycren, [13].
Ngoài thành phần tinh dầu thì hoạt chất có tác dụng điều trị sốt rét là
artemisinin mà các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết tách và xác định cấu
trúc từ năm 1972, đó là một secquiterpen lacton có cầu nối peroxyd nội phân
tử. Ngoài artemisimin người ta còn xác định được một loạt hợp chất
secquiterpen khác như sau [15]:
4
Aitemisinin
1.2.2. Phương pháp điều chế
Sự phát hiện và phân lập artemisinin từ Artemisia annua là một thành
công lớn trong việc sử dụng dược liệu để điều trị sốt rét. Artemisinin có hiệu
lực mạnh và có tác dụng nhanh ngay cả đối với chủng Plasmodium đã kháng
Cloroquin. Tuy nhiên, các thí nghiệm lâm sàng cho thấy rằng khi điều trị bằng
artemisinin thì tái phát xảy ra sớm hơn so với khi dùng Cloroquin mặc dù
bệnh nhân sạch ký sinh trùng trong máu. Nhằm tăng độ tan và tăng hiệu lực
điều trị của artemisinin, người đã nghiên cứu bán tổng hợp ra một số các chất
dẫn xuất của nó, trong đó quan trọng nhất là artesunat.
Artesunat được bán tổng hợp từ nguyên liệu ban đầu là artemisinin qua
giai đoạn trung gian là dihydro artemisinin (DHA), trên cơ sở phương pháp
của các nhà khoa học Trung Quốc, D.L. Klayman, P.Brosi và cộng sự, trường
Đại Học Dược Hà Nội đã bán tổng hợp được artesunat qua hai giai đoạn với
* hiệu suất cao [15].
*Giai đoạn 1:
6
Artemisinin được khử hóa nhóm lacton thành dihydro artemisinin bởi
natri borohydrid (NaBH4) trong môi trường methanol và ở nhiệt độ 0 - 5°c. Sơ
đồ phản ứng như sau:
Kết quả thu được DHA ở hai dạng đồng phân là a và 13 , trên thực tế
DHA cũng có tác dụng điều trị sốt rét mạnh hơn artemisinin hai lần nhưng
việc sử dụng cũng có hạn chế do vậy người ta tiếp tục bán tổng hợp ra
artesunat.
*Gí'ai đoạn 2 :
DHA được este hóa thành artesunat khi tác dụng với anhydrit succinic
hoặc acid succinic với xúc tác là dimethylamino pyridin (DMAP) hoặc hỗn
hợp của DMAP và dicyclohexyl carbodiimid (DCC).
Sơ đổ phản ứng:
Ngày nay, từ DHA ngoài artesunat người ta còn có thể bán tổng hợp ra
nhiều chất khác có hoạt lực tác dụng tương tự như artesunat như arteether
Artesunat ức chế hoạt tính của cytorom oxydase và hệ vận chuyển —
glutamin trong hồng cầu. ở pH cao artesunat tạo ra tức thì các dạng oxi hoạt
động.
Các loại thuốc như miconazol có tác dụng làm tăng hiệu lực của
artesunat còn các chất chống oxi hóa như acid ascorbic, glutathion, vitamin
E, lại làm giảm hoạt tính của artesunat [10].
1.2.5. Dược đông học
Artesunat dùng theo đường uống được hấp thu từ 24 - 64%, thời gian bán
thải t1/2=41 phút. Thuốc bị giảm hoạt tính do bị chuyển hóa tại gan, thuốc qua
được hàng rào máu - thai nhi nên tránh dùng thuốc cho phụ nữ có thai.
Artesunat thải trừ qua đường nước tiểu, các chất được thải trừ bao gồm: deoxy
artemisinin, dihydro deoxy artemisinin.
1.2.6. Độc tính
Được thử tại bộ môn Dược lý Đại học Y Hà Nội [6].
Độc tính cấp: LD50 trên chuột nhắt = 1200 [1081-1331] mg/kg bằng đường
uống.
Khi cho chuột nhắt trắng uống artesunat liều 4mg/g thể trọng trong 5 ngày liền
không thấy hình ảnh tổn thương cấu trúc tế bào ở mô gan và thận, cấu trúc chung của
gan và thận không thay đổi, có hiện tượng xung huyết các mạch trong thận.
Độc tính bán cấp: cho thỏ uống qua xông vào dạ dày dung dịch natri
artesunat 2ml/kg/24h với liều 20mg/kg/24h vào giờ nhất định trong ngày, cho
uống liên tục trong 30 ngày chưa thấy có độc tính bán cấp.
Về khả năng gây đột biến của artesunat được thử tại bộ môn Dược lý,
trường Đại học Y Hà Nội cho thấy rằng: artesunat không làm tăng tần số rối
9
loạn nhiễm sắc thể ở tế bào tủy xương hoặc tế bào tinh hoàn, không làm xuất
hiện các rối loạn nhiễm sắc thể, không gây nên các rối loạn về sinh sản. Các
chuột con được đẻ ra không có dị tật bẩm sinh: Quan sát được cả ở F1 và F2
số lượng cũng như trọng lượng của chuột con được đẻ ra bình thường, khi
chuột chửa uống artesunat không gây nên bất thường ở thế hệ con.
o c o c h 2c h 2c o o h
Nhận xét:
- Phương pháp có trong TCN và nhiều tiêu chuẩn cơ sở.
- Phương pháp định lượng dễ thực hiện, trang thiết bị dễ định lượng các
cơ sở đều có thể có được.
- Sản phẩm đo quang không phải trực tiếp là artesunat mà là sản phẩm
của chuyển hóa của nó trong môi trường kiềm - Q289. Theo Nguyễn
Mạnh Cường [5], điều kiện áp dụng là phải khống chế được lượng
dihydro artemisinin trong chế phẩm, khi đó phép định lượng mới có
kết quả đúng. Tuy nhiên trong chế phẩm viên nén khó có thể khống
chế được lượng dihydro artemisinin.
1.3.2. Phương pháp HPLC với detector u v
Định lượng artesunat với pha động là acetonitril - đệm phophat pH=5,l
(tỷ lệ 38:62) [23] hoặc với pha động acetonitril-đệm acetat pH=5,5 (tỷ lệ 1:1)
11
[22], bước sóng phát hiện là 235nm. Hoặc để định lượng artesunat trong dược
liệu, trong các dịch sinh vật người ta đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao với chương trình sắc ký cột Lichrosorb Rp 60 - 5àm, 125x4 mm, pha
động: 48% CH3CN+31% dung dịch KH2P04 0,05M trong nước + 20% nước,
tốc độ dòng lml/phút, detector u v 210nm và thể tích tiêm 20//1, với chương
trình chạy sắc ký trên, artesunat có tR=2,1 phút [30].
Nhận xét:
Artesunat chỉ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở vùng bước sóng ngắn, trong
phương pháp định lượng này, bước sóng phát hiện là 235nm, sản phẩm định
lượng có thể không phải là artesunat nên DHA (nếu có) có thể sẽ ảnh hưởng
tới kết quả định lượng.
1.3.3. Phương pháp HPLC với detector khúc xạ kế[38]
Định lượng artesunat với pha tĩnh là cột RP18 (12,5x3,5 mm), cỡ hạt
5 ịi m, pha động là acetonitril - đệm pH=3 (dung dịch đệm pH3: l,36g KH2P04
trong lOOOml HaO, điều chỉnh pH tới 3 bằng H3P04) với tỷ lệ 1:1. Tốc độ
tt
Cũng dựa vào nhóm chức acid tự do còn lại trong phân tử artesunat để
tiến hành định lượng. Chế phẩm (khoảng 0,20g) được hòa tan trong ethanol
13
tuyệt đối (50ml). Chuẩn độ bằng dung dịch tetrabutylammonium hydroxide
trong 2-propanol (0,lmol/l). Điểm kết thúc của phép định lượng được xác định
bằng chỉ thị tím tinh thể trong acid acetic khan hoặc bằng kỹ thuật chuẩn độ đến
điểm dừng.
1.3.7. Phương pháp đo phổ hấp thụ vùng khả kiến dưới dạng muối
hydrxamat sắt [9]
Cho artesunat tác dụng với dung dịch hydroxylamin hydroclorid trong
môi trường kiềm. Trung hòa rồi acid hóa dung dịch bằng acid hydrocloric và
cho phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid. sản phẩm tạo thành có màu tím
đỏ. Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch này.
1.3.8. Các phương pháp định lượng khác
Cầu nối peroxyd nội phân tử của artemisinin và artesunat còn thể hiện sự
đáp ứng trên điện cực giọt thủy ngân nên người ta còn dùng phương pháp cực
phổ để định lượng. Ngoài ra, phương pháp cực phổ xung và phân tích phóng
xạ miễn dịch đã được áp dụng để định lượng artemisinin và các dẫn xuất của
nó. Các nhà khoa học Trung Quốc còn miêu tả hai phương pháp khác để định
lượng artemisinin và các dẫn xuất của nó trong mẫu thử sinh học [26]:
- Phương pháp đo độ phóng xạ: sau khi uống thuốc đã được đánh dấu
bằng Tritium.
- Phương pháp phân tích đo mật độ quang trên sắc ký lớp mỏng.
1.4. Các phương pháp định lượng artesunat trong viên nén đang áp
dụng ở nước ta [2], [3]
1.4.1. Phương pháp quang phổ
Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 60mg artesunat
cho vào bình định mức 50ml, thêm 40ml ethanol tuyệt đối và lắc kỹ cho tan
hết hoạt chất, thêm ethanol tới vạch, lắc đều, lọc bỏ dung dịch đầu. Hút chính
phải trực tiếp định lượng artesunat nên sản phẩm phân hủy có thể ảnh hưởng tới
kết quả.
- Phương pháp đo quang phổ tử ngoại ở 289nm thực tế cũng không thể
đánh giá chính xác được khi artesunat đã bị phân huỷ hoặc khi lẫn các tạp chất
khác, bởi sản phẩm phân hủy của chúng cũng hấp thụ vùng tử ngoại do đó dẫn
đến sai số.
- Phương pháp đo kiềm tại chỗ cho kết quả đúng khi artesunat chưa bị thủy
phân.
- Do artesunat chỉ hấp thụ ở bước sóng ngắn nên trong đề tài này chúng
tôi nghiên cứu, xây dựng quy trình kỹ thuật mới để định lượng nguyên liệu
artesunat bằng phương pháp HPLC mà không bị ảnh hưởng bởi DHA và acid
succinic nhằm tăng tính đặc hiệu của nó, từ đó có thể áp dụng trong việc định
lượng artesunat trong các chế phẩm (do dưới dạng bào chế, artesunat thường
I lẫn tạp phân huỷ của nó).
1.6. Phương pháp HPLC [8],[14],[25],[29],[34],[35]
1.6.1. Nguyên tắc
HPLC là phương pháp phân tích sử dụng kỹ thuật tách các chất trong hỗn
hợp dựa vào ái lực giữa các chất với hai pha: pha tĩnh (cột hiệu năng cao) và
pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân
tích được đưa vào cột chúng sẽ được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh tuỳ
thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi
pha động qua bơm với áp suất cao thì tuỳ thuộc vào ái lực của các chất với hai ^
pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi dertector và được
9 chuyển qua bộ sử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được đưa ra máy in hoặc hiển
thị trên màn hình.
16
1.6.2. Co sở lý thuyết
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và
phân bố của các chất tan giữa hai pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với
+ Detector điện hoá (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng).
+ Detector chiết suất.
+ Detector đo độ dẫn nhiệt
Tuỳ thuộc theo chất phân tích mà chọn loại Detector nào cho phù hợp để
đạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất. Trong các loại trên thì Detector
hấp thụ quang phân tử hiện nay đang được dùng phổ biến nhất.
5. Trang bị chỉ thị kết quả. ở đây có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ
biến nhất là máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dưới dạng pic.
Đó là 5 bộ phận cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống HPLC
Hình 2. Sơ đồ khối hệ thống HPLC hoàn chỉnh
18
Hình 3: Giản đồ sắc kỷ hai chất 1 và 2
ậ Kết quả của quá trình tách các chất được Detector phát hiện, phóng đại
và ghi thành sắc ký đồ.
+ tR (Thời gian lưu): Thời gian kể từ khi chất cần phân tích được
bơm vào cột cho đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của
nó.
+ t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua
hệ thống sắc ký.
+ tR’(Thời gian lưu thực) = tR - 10.
+ w 0 5 (Độ rộng píc ở nửa chiều cao)
+ Wb (Độ rộng ở đáy píc)
Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc đồ, nó là một hằng số
đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi.
* * Hệ số dung lượng k’:
19
Copyright: Tài liệu đại học ©