Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN VIỆT NAM
ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÁI NGUYÊN
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT TỔ HỢP ENZYME PHÂN GIẢI
PROTEIN TỪ GAN TỤY CỦA CUA BIỂN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Mã ngành: 60. 42. 30
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Hoài Châu
HÀ NỘI – 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hoài Châu –
Viện trƣởng Viện Công nghệ Môi trƣờng – Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã hƣớng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình
học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ thân Môi
trƣờng – Viện Công nghệ Môi trƣờng đặc biệt là PGS.TSKH. Ngô Quốc
Bƣu đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Duy Nhứt – Trung tâm ứng
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APS Ammonium persulphate
Tris.Base Tris (hydroxy methyl) amiomethane (HOCH
3
)CNH
2
TEMED Trichloroacetic acid
kb kilo base
kDa kilo Dalton
PCR Polymerase Chain Reaction
U Unit
ADN Acid Deoxyribonucleic
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
TCA Trichloroacetic acid
OD Optical density
SDS-PAGE Sodium dodecylSulphate polyacrylamide gel Electrophorei
SDS Sodium dodecyl sulphate
DEP Diethoxylphosphoryl
DFP Di-isopropylfluorophosphate
3,4-DCI 3,4-Dichloroisocoumarin
Bảng 3.17. Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzyme
Bảng 3.18. Hàm lượng protease thu được so sánh với mẫu của Nga
Bảng 3.19. Kết quả mẫu đem chạy điện di
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide
Hình 1.2. Mô hình enzyme protease thủy phân
Hình 1.3. Cấu trúc không gian enzyme protease
Hình 1.4. Sơ đồ phân loạ i protease
Hình 1.5. Sơ đồ cơ chế xúc tác trung tâm hoạt động của enzyme
Hình 1.6. Cơ chế xúc tác của cysteine protease.
Hình 1.7. Cơ chế hoạt động của Aspartic protease
Hình 1.8. Mô hình phân tử enzyme protease
Hình 1.9. Nội tạng cua biển
Hình 1.10. Sự phân bố của cua vua đỏ (vùng màu vàng)
Hình 1.11. Loài cua vua (king crab)Paralithodes camtschaticus
Hình 2. Đường chuẩn Tyrosine
Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cồn tới enzyme protease.
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tốc độ máy lọc màng tới enzyme protease
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ (NH
4
)
2
SO
4
lên hoạt tính của protease
Hình 3.4. Ảnh hưởng của độ pH lên hoạt tính của enzyme protease
Hình 3.5. So sánh giữa các phương pháp kết tủa thu hồi enzyme
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzyme
1.6. CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE 15
1.7. NGUỒN THU NHẬN ENZYME PROTEASE 18
1.7.1. Enzyme protease từ động vật 18
1.7.2. Enzyme protease từ thực vật 18
1.7.3. Enzyme protease từ vi sinh vật 19
1.7.3.1. Vi khuẩn 19
1.7.3.2. Nấm …………………………………………………………………………20
1.7.3.3. Xạ khuẩn……………………………………………………………………21
1.7.3.4. Virus…………………………………………………………………………21
1.8. TỔ HỢP ENZYME HEPATOPANCREAS (HP) TỪ GAN TỤY CỦA
CUA BIỂN 22
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1.8.1. Sản phẩm thu đƣợc từ gan tụy cua biển……… …….……………….22
1.8.2. Ứng dụng trong y học……………………………….……………… 24
1.8.3. Giới thiệu về loài cua nghiên cứu tại Nga………………………… 25
1.9. ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE 26
1.9.1. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm………………………………27
1.9.2. Trong chế biến thuỷ sản 27
1.9.3. Trong công nghiệp chế biến sữa 28
1.9.4.Trong công nghiệp sản xuất bia 28
1.9.5. Trong công nghiệp da 28
1.9.6. Trong công nghiệp dệt 29
1.9.7. Trong công nghiệp y – dƣợc 29
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 31
2.1.1. Nguyên liệu 31
2.1.2. Hoá chất 31
2.1.3. Thiết bị 32
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.2.10. Điện di protein trên gel polyacrylamide xác định khối lƣợng tổ hợp
enzyme…………………………………………………………………… 42
2.2.11. Phƣơng pháp sấy đông khô dịch chiết enzyme ………………… 44
3.1. Khảo sát mẫu nội tạng cua biển thu nhận từ 2 nguồn thu nhận khác nhau
45
3.2. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas…………………………….48
3.2.1. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng cồn theo các tỷ lệ khác
nhau 48
3.2.2. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng phương pháp lọc màng
52
3.2.3. Tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas từ gan tụy cua biển dùng
(NH
4
)
2
SO
4
54
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2.4. Thu nhận tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng cách điều chỉnh pH dịch
ly tâm 545
3.3. So sánh giữa các phƣơng pháp tủa pH, cồn và ammonium sulfate 57
3.4. Khảo sát ảnh hƣởng của dung dịch đệm đến hoạt tính của tổ hợp enzyme
hepatopancreas 58
3.5. Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ ly tâm đến khả năng tinh sạch tổ hợp
enzyme hepatopancreas 59
3.6. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH tới hoạt tính của enzyme 60
3.7. Hàm lƣợng protein 62
3.8. Chạy điện di xác định khối lƣợng phân tử tổ hợp enzyme 62
khó lành. Tổ hợp enzyme hepatopancreas tách từ cua biển trong thành phần
của mình, ngoài colagenase còn chứa các protease serin, nhờ vậy mà chúng có
khả năng thủy phân nhiều đối tƣợng cơ chất khác nhau và thể hiện tính năng
2
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
điều trị đặc thù. Vì vậy, nhóm nghiên cứu chúng tôi lựa chọn đề xuất đề tài:
“Nghiên cứu tách chiết tổ hợp enzyme phân giải protein từ gan tụy cua biển
Việt Nam” nhằm bƣớc đầu thu nhận tổ hợp enzyme hepatopancreas phân giải
protein từ gan tụy cua biển ở Việt Nam, tiến tới chế tạo băng gạc điều trị vết
thƣơng mang lại sản phẩm có giá trị công nghệ cao ứng dụng trong y học và
cuộc sống.
Trong khuôn khổ của đề tài luận văn này, chúng tôi tiến hành:
- Khảo sát quá trình tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas phân giải
protein từ gan tụy cua biển Việt Nam.
- Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình tách chiết và đánh giá
hoạt tính tổ hợp enzyme thu đƣợc.
3
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
băng gạc phủ vết thƣơng trên cơ sở xenlulo vi mô đƣợc cấy enzyme phân giải
protein có khả năng làm sạch vết thƣơng mà không cần đến sự trợ giúp của
phẫu thuật, nghĩa là có khả năng làm tan các protein hoại tử để chúng thấm
vào lớp vải phủ. Trong số các loại vật liệu phủ vết thƣơng đã nghiên cứu chế
tạo và đƣa vào sử dụng trong điều trị nhƣ các loại băng Proteox, Dalcek-
tripsin trên ơ sở vật liệu xenlulo tự nhiên có chứa các loại enzyme phân giải
protein và các chất hoạt tính sinh học khác nhau, loại băng Multiferm chứa tổ
hợp enzyme đƣợc lấy ra từ gan tụy của một số động vật biển cho hiệu quả
điều trị cao nhất. Sử dụng chế phẩm Multiferm cho phép làm sạch bề mặt vết
thƣơng khỏi các mô hoại tử cũng nhƣ quá trình lên da non diễn ra nhanh 2,3
lần so với phƣơng pháp điều trị truyền thống. Nhiều kết quả thực nghiệm chỉ
ra rằng băng Multiferm chứa tổ hợp enzyme hepatopancreat phân giải protein
cho phép làm sạch vết loét dinh dƣỡng khỏi khối mủ - hoại tử hiệu quả hơn
2,3 lần so cới băng chứa tripsin và mexidon [21]
1.1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nƣớc.
Năm 1960, protease mới bắt đầu đƣợc nghiên cứu chính thức ở Việt
Nam. Ở động vật, có những nghiên cứu ban đầu về protease ở các loài cá
dùng trong sản xuất nƣớc mắm [7]. Ở thực vật, có những nghiên cứu về
bromelain ở dứa [3], papain ở đu đủ [2] và các protease ở bí đao [4]. Vai trò
của enzyme protease đƣợc ứng dụng rất rộng rãi vào trong đời sống của con
ngƣời. Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của
các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các
lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu nhằm theo hƣớng tách, tinh sạch
5
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối
liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng
enzyme trong thực tế.
Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã đƣợc tiến hành bởi nhiều tác giả
Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý nhƣ:
hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải
phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển
protein qua màng. Các protease có thể hoạt động nhƣ các yếu tố phát triển của
cả tế bào ác tính và tế bào bình thƣờng, trong sự phân chia tế bào, sinh tổng
hợp ADN… Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức
năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên đƣợc phân bố rất rộng rãi trên
nhiều đối tƣợng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ,
dứa ) và động vật (gan, tụy, dạ giày, ).
Hình 1.2. Mô hình enzyme protease thủy phân
7
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cấu trúc
không gian đặc trƣng của protease. Đáng chú ý là cấu trúc không gian của
protease tách chiết từ gan tụy của loài cua vua (king crab) đƣợc ông Kuzmin.
S và cs…[30] mô phỏng theo cấu trúc không gian dƣới đây:
1.3.1. Exopeptidase
Exopeptidase phân cắt liên kết peptide ở hai đầu tự do của chuỗi
polypeptide. Dựa vào vị trí phân cắt liên kết peptide ở đầu C và đầu N ,
exopeptidase đƣợ c phân chia thà nh hai loạ i : Aminopeptidase và
Carboxypeptidase.
Protease
(E.C.3.4)
Exopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)
Endopeptidase
(E.C. 3.4.21-99)
Aminopeptidase
Carboxypeptidase
Serine proteinase
Cystein proteinase
Aspartic proteinase
Metallo proteinase
9
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide.
Aspartic protease (E.C.3.4.23): Hầu hết các aspartic protease thuộc
nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa nhƣ: pepsin,
chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl
trong trung tâm hoạt động và thƣờng hoạt động mạnh ở pH trung tính. Trung
tâm hoạt động của aspartic protease chứa bộ ba amino acid Asp-Xaa-Gly. Các
aspartic protease phổ biến gồm có pepsin, rennin, protease acid của vi sinh
vật.
Metallo protease (E.C. 3.4.24): Metallo protease là nhóm protease
đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng nhƣ các vi sinh vật bậc cao hơn. Các
metallo protease thƣờng hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh
dƣới tác dụng của EDTA. Trung tâm hoạt động chứa ion kim loại trực tiếp
tham gia phản ứng xúc tác (chủ yếu là ion Zn
2+
). Hầu hết các metall protease
bị ức chế bởi các phức chất nhƣ EDTA nhƣng không bị ức chế bởi sulfhydryl
và DEP.
1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI HOẠT TÍNH PROTEASE
Trên thế giới hiện nay có rất nhiều các công bố nghiên cứu về các yếu
tố ảnh hƣởng đến hoạt tính protease cũng nhƣ tác động khác nhau với mỗi
loại protease có nguồn gốc khác nhau. Có những yếu tố ảnh hƣởng âm tính
đến hoạt độ xúc tác của protease này nhƣng lại có tác động tích cực đến hoạt
độ xúc tác của protease khác.
11
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Một số yếu tố ảnh hƣởng thƣờng đƣợc khảo sát dƣới đây:
a) Chất hoạt động bề mặt.
b) Dung môi hữu cơ, đa số đều ảnh hƣởng ít nhiều đến hoạt độ của
protease, chúng thƣờng ảnh hƣởng tới khả năng phân cực của protease cũng
nhƣ cơ chất.
sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P
2
: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng.
Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có
thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các
liên kết peptid định trƣớc.
Sau đây là cơ chế xúc tác của 1 số loại protease đặc trƣng:
1.5.1. Serine protease
Trung tâm hoạt động xúc tác sự phân giải cơ chất của enzyme này chứa
bộ ba Ser-His-Asp [12]. Sự thủy phân diễn ra theo hai bƣớc bao gồm:
+ Bƣớc một: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa enzyme tự do và cơ
chất tạo thành phức trung gian [25]. Tiếp theo đó là sự acyl hóa và giải phóng
ra sản phẩm đầu tiên là R’-NH
2
+
.
+ Bƣớc hai: diễn ra quá trình khử acyl hóa, phức chất trung gian
enzyme - cơ chất phản ứng với phân tử H
2
O giải phóng ra sản phẩm thứ hai
cùng với sự tái sinh lại của enzyme tự do.
1.5.2. Metallo protease
Trung tâm xúc tác của hầu hết metalloprotease có dạng His-Glu-Xaa-
Xaa-His. Enzyme này hoạt động phụ thuộc vào sự có mặt của các cation hóa
trị 2 và có thể bị kìm hãm bởi quá trình thẩm tách hoặc sự có mặt của chất tạo
phức. Dựa vào những nghiên cứu tia X cho thấy thermolysine có khả năng tạo
phức với chất ức chế là acid hydroxamic. Kết quả là Glu-143 giúp phân tử
E + S Enzyme – S Enzyme – S + P
1
Enzyme + P
do N và C của mỗi thùy trong phân tử enzyme. Xaa ở đây là Ser hoặc Thr có
chuỗi bên có thể tạo liên kết hydro với aspartic, trong khi đó hầu hết
retropepsin thì Xaa là Ala.
Hình 1.7. Cơ chế hoạt động của Aspartic protease
Phức hợp ES
Tứ diện trung gian
Phức hợp EP
Copyright: Tài liệu đại học ©