ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN HỮU TRÍ
PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG VI
KHUẨN CLOSTRIDIUM SP. SINH
TỔNG HỢP BUTANOL
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
MÃ SỐ: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Hoàng Quốc Khánh
là người hướng dẫn khoa học trực tiếp em trong quá trình thực hiện luận văn,
thầy đã tận tình hướng dẫn em phương pháp nghiên cứu khoa học, gợi ra
những ý tưởng, lời khuyên quý báu giúp em luôn giữ được sự tự tin cần thiết
để bước đi trên con đường nghiên cứu khoa học.
Với tất cả lòng kính trọng em xin gởi lời cảm ơn đến ThS. Lê Ngọc
Thông, thầy đã tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành tốt công tác
giảng dạy và học tập cũng như thực hiện luận văn.
Em xin cảm ơn tất cả thầy cô Khoa Sinh Học đã tận tâm giảng dạy,
trang bị biết bao kiến thức cần thiết cho em trong suốt 6 năm qua tại trường Đại
Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM.
Cảm ơn anh Nguyễn Duy Long, chị Đào Thị Thu Hiền đã quan tâm tận
tình hướng dẫn em các bước tiến hành thí nghiệm, đưa ra cho em những lời
khuyên bổ ích và đúng lúc.
Cảm ơn các bạn, các em sinh viên cùng làm tại phòng Vi sinh Ứng dụng,
Viện
Sinh học nhiệt đới, các bạn như một gia đình nhỏ luôn cho tôi cảm giác thoải
mái, đã bên tôi trong quá trình thực hiện luận văn, chia vui cùng tôi những
thành công, góp ý cùng tôi những thất bại, giúp đỡ hỗ trợ nhờ đó tôi thiết kế các

2.2.5. Mối liên hệ giữa quá trình sinh dung môi và sự sinh trưởng, phát triển của
Clostridium

26
2.2.6. Phương pháp thu nhận dung môi aceton-butanol-ethanol 27
2.2.7. Nhiên liệu sinh học và ứng dụng của butanol 29
2.2.7.1. Nhiên liệu sinh học 29
- i -
2.2.7.2. Ứng dụng của butanol 30
2.3. Định danh Clostridium bằng kỹ thuật sinh học phân tử 34
2.4. Giới thiệu cây phát sinh loài 37
Ch??ng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 39
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 40
3.2. Dụng cụ, thiết bị và đối tượng nghiên cứu

40
3.2.1. Dụng cụ 40
3.2.2. Thiết bị 40
3.2.3. Môi trường sử dụng nuôi cấy 40
3.2.3.1. Môi trường RCM 40
3.2.3.2. Môi trường T6 41
3.2.3.3. Triple Sugar Iron Agar (TSI) cho thử nghiệm sinh H2S 41
3.2.3.4. Môi trường Indole cho thử nghiệm Indol 41
3.2.3.5. Phenol Red Carbohydrate
Broth 42
3.2.3.6. Thuốc thử kiểm tra sự hiện diện của aceton 42
3.2.3.7. Hóa chất dùng trong điện di 42

4.1. Phân lập và làm thuần giống Clostridium có tiềm năng sinh butanol 69
4.1.1. Thu nhận mẫu phân tích 69
4.1.2. Phân lập và làm thuần chủng Clostridium sp. sinh butanol 70
4.1.3 Chọn lọc các chủng Clostridium sp. có khả năng sinh dung môi 78
4.2. Kiểm tra khả năng sinh butanol của các chủng Clostridium sp. phân lập
được

78
4.2.1. Kiểm tra khả năng đông tụ sữa và định tính acetone 78
3.3.2.3. Kieåm tra hoaït tính
catalase
48
- 5 -
4.2.2.1. Kh nng sinh H2S 80
4.2.2.2.Kh nng mn cm vi rifampicin 80
4.2.2.3. Th nghim Indol 80
4.2.2.4. Th nghim kh nng s dng cỏc ngun carbohydrate khỏc nhau

81
4.2.3. Xỏc nh nng butanol tng hp bng sc ký lng cao nng 84
4.3. Bo qun chng phõn lp bng phng phỏp ụng khụ. 86
4.4. nh danh cỏc chng Clostridium sp. s dng trỡnh t 16S rDNA 87
4.4.1. Khuch i PCR trỡnh t 16S rDNA 87
4.4.2. Kt qu gii trỡnh t v nh danh 88
4.4.3. Tho lun chung 95
Chng 5. KT LUN V NGH 98
5.1. Kt lun
99
5.2. ngh
99
65
Bảng 3.9: Điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G-
Clos-
1205-A-21
65
Bảng 3.10: Trình tự 16S rDNA của các loài Clostridium từ NCBI và EMBL 67
Bảng 4.1: Các loại mẫu và địa điểm thu mẫu 69
Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase, hình thái khuẩn lạc nhuộm gram của
các chủng vi khuẩn Clostridium phân lập được trên môi trường RCM của nhóm
mẫu I có pH acid (pH ? 6,5).

71
Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase, hình thái khuẩn lạc nhuộm gram của
các chủng vi khuẩn Clostridium phân lập được trên môi trường RCM của nhóm
mẫu II có pH trung tính (6,5<pH ? 7,5).

72
Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase, hình thái khuẩn lạc nhuộm gram của
các chủng vi khuẩn Clostridium phân lập được trên môi trường RCM của nhóm
mẫu III có pH kiềm (pH > 7,5).

73
- 7 -
Bảng 4.5: Đặc điểm hình thái, kích thước tế bào sinh dưỡng và bào tử của các
chủng vi khuẩn thuộc nhóm mẫu I phân lập được trên môi trường RCM 75
Bảng 4.6: Đặc điểm hình thái, kích thước tế bào sinh dưỡng và bào tử của các
chủng vi khuẩn thuộc nhóm mẫu II phân lập được trên môi trường RCM


Hình 2.5: C. beijerinckii sLM01 hoạt động thủy phân cellulose 20
Hình 2.6: Con đường chuyển hóa acid và dung môi của Clostridium 22
Hình 2.7: Quá trình thay đổi hình thái, sinh dung môi kết hợp hình thành bào tử

ở
C. acetobutylicum 27
Hình 2.8: Cấu trúc butanol (C4H9OH) 31
Hình 2.9: Xe 100% Butanol

34
Hình 2.10: Cây phát sinh loài cho thấy mối quan hệ của các loài Clostridium
trong cluster I

38
Hình 3.1: Quy trình phân lập và định danh Clostridium sinh butanol 45
Hình 3.2: Đường chuẩn HPLC cho glucose 57
Hình 3.3: Đường chuẩn HPLC cho butanol 58
Hình 3.4: Bản đồ vùng gene 16S rDNA của Clostridium. 63
Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc của một số chủng Clostridium sp. phân lập 74
Hình 4.2: Hình dạng bào tử của một số chủng Clostridium sp. 77
Hình 4.3: Sự lên men glucose của các chủng Clostridium sp. phân lập 82
Hình 4.4: Lượng butanol tổng hợp của các chủng Clostridium sp. được chọn sau
7 ngày lên men. 85
Hình 4.5: Bảo quản các chủng vi khuẩn bằng phương pháp đông khô 86
Hình 4.6: Sản phẩm PCR khi sử dụng cặp mồi 27F-1492R để khuếch đại vùng

gen

khí methane sinh học (sản xuất từ lò ủ chất phế thải), hydrogen sinh học. Nhiên liệu
ở thể lỏng được ưa chuộng hơn vì có độ tinh khiết cao, chứa nhiều năng lượng, dễ
dàng chuyên chở, dễ tồn trữ và bơm vào bình nhiên liệu của xe. Nhiên liệu sinh học
đang là vấn đề quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới vì nhiều lý do: giá xăng cổ
sinh ngày càng cao, trữ lượng dầu thô và khí đốt ở các mỏ dầu có giới hạn và sẽ cạn
kiệt trong tương lai (dự đoán khoảng năm 2100), nhiều quốc gia muốn ít phụ thuộc
vào việc nhập khẩu nhiên liệu cổ sinh trong khi quốc gia họ có khả năng sản xuất
nhiên liệu thay thế, và bị áp lực chính trị phải giảm lượng khí CO2

sa thải để phù
hợp với nghị định thư Kyoto (1997) quy định.
Butanol, acetone, ethanol là những dung môi có khả năng sử dụng làm
nhiên liệu. Hiện nay, ethanol đang được sử dụng nhiều, tuy nhiên người ta chú ý đến
butanol hơn vì cấu tạo của nó có bốn nguyên tử carbon nên nặng hơn, ít bay hơi,
đồng thời có khả năng tạo ra năng lượng cao hơn ethanol và acetone [45].
Với kỹ thuật hiện nay, có 2 phương thức hữu hiệu để chế biến nhiên liệu
sinh học:
?C ho lê n me n (nh ờ v i si nh vậ t và en zy me tr on g đ iều ki ện yế m k hí ) c hấ t
đường (từ mía, củ cải đường, v.v.), tinh bột [từ hạt ngũ cốc (bắp, lúa, lúa mì,
v.v.) và củ (khoai tây, khoai mì, v.v.)], hay cellulose để tạo ra ethanol
(C2H5OH), propanol (C3H7OH) và butanol (C4H9OH).
?T rí ch dầu từ t hự c vậ t, tả o g iàu ch ất dầu , h ay từ m ỡ đ ộn g vậ t ( ép vớ i áp
suất cao và nhiệt, hoặc bằng dung môi, hay phối hợp cả hai).
Trong đó các vi khuẩn lên men từ sinh khối để sinh dung môi có rất nhiều ưu
thế như: hạn chế việc tổng hợp nên các hợp chất có khả năng gây ung thư, sử dụng
tạo ra các dẫn xuất dung môi cung cấp cho nhu cầu của công nghiệp thực phẩm và
hương liệu; các phụ phế phẩm của nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm có thể trở
thành nguồn cơ chất đầy tiềm năng, rẻ tiền cho quá trình lên men để sản xuất các
dung môi cho giá trị thương mại cao. Tuy nhiên, việc tầm soát để phân lập và chọn
các chủng vi sinh vật cần thiết là đòi hỏi đầu tiên trong các quy trình lên men sinh

CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU
15
NGUYEÃN HÖÕU TRÍ
Kể từ năm 2000, các quốc gia trên thế giới lần lượt thật sự tuân thủ thoả
hiệp Rio de Janeiro (1992) và nghị định thư Kyoto (1997), tìm cách hạn chế thải khí
nhà kính (CO2, CH4, N2O, ) khi sử dụng nhiên liệu cổ sinh thay thế bằng năng
lượng xanh (như năng lượng mặt trời, gió, thủy điện, ), do đó nhiên liệu sinh học
đang được quan tâm phát triển. Nhiên liệu sinh học là loại chất đốt tái tạo, sản xuất
từ nguyên liệu động thực vật gọi là sinh khối, gọi là “tái tạo” vì chất đốt cơ bản
carbon (C) nằm trong chu trình quang hợp ngắn hạn, đốt nhiên liệu sinh học thải khí
CO2, rồi thực vật hấp thụ lại CO2 đó để tạo thành sinh khối, chế biến nhiên liệu sinh
học trên lý thuyết coi như không làm gia tăng CO2 trong khí quyển.
Nhiên liệu sinh học có thể ở thể rắn như củi, than củi (than đá thuộc loại cổ
sinh, không tái tạo); thể lỏng (như xăng sinh học, diesel sinh học); hay thể khí như
khí methane sinh học (sản xuất từ lò ủ chất phế thải), hydrogen sinh học. Nhiên liệu
ở thể lỏng được ưa chuộng hơn vì có độ tinh khiết cao, chứa nhiều năng lượng, dễ
dàng chuyên chở, dễ tồn trữ và bơm vào bình nhiên liệu của xe. Nhiên liệu sinh học
đang là vấn đề quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới vì nhiều lý do: giá xăng cổ
sinh ngày càng cao, trữ lượng dầu thô và khí đốt ở các mỏ dầu có giới hạn và sẽ cạn
kiệt trong tương lai (dự đoán khoảng năm 2100), nhiều quốc gia muốn ít phụ thuộc
vào việc nhập khẩu nhiên liệu cổ sinh trong khi quốc gia họ có khả năng sản xuất
nhiên liệu thay thế, và bị áp lực chính trị phải giảm lượng khí CO2

sa thải để phù
hợp với nghị định thư Kyoto (1997) quy định.
Butanol, acetone, ethanol là những dung môi có khả năng sử dụng làm
nhiên liệu. Hiện nay, ethanol đang được sử dụng nhiều, tuy nhiên người ta chú ý đến
butanol hơn vì cấu tạo của nó có bốn nguyên tử carbon nên nặng hơn, ít bay hơi,
đồng thời có khả năng tạo ra năng lượng cao hơn ethanol và acetone [45].

tiến hành đề tài nghiên cứu: “PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN
CLOSTRIDIUM SP. SINH TỔNG HỢP BUTANOL”.
Đề tài được thực hiện nhằm giải quyết các vấn đề:
1. Phân lập, sàng lọc và xác định các chủng vi khuẩn Clostridium sp. kỵ khí
nghiêm ngặt, có khả năng sinh butanol từ các nguồn mẫu khác nhau như đất
canh tác nông nghiệp, phân của động vật, bùn ao hồ.
2. Kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng Clostridium sp. phân
lập được là Gram dương, hình thành nội bào tử, sinh tổng hợp butanol.
3. Xác định khả sinh tổng hợp butanol của các chủng Clostridium sp. phân
lập được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao năng HPLC.
4. Định danh các chủng Clostridium sp. phân lập được bằng kỹ thuật sinh học
phân tử: tách chiết DNA bằng DNAzol Direct PCR, khuếch đại đoạn gene
16S rDNA có kích thước 1,5 kb sử dụng cặp mồi Eubac27F và 1492R. Các
sản phẩm khuếch đại được tinh sạch và giải trình tự, xây dựng cây phát sinh
loài để xác định mối quan hệ giữa các loài phân lập được.
CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU
2.1. Tổng quan về giống Clostridium
Clostridium là các loài bao gồm tập hợp các loài Gram dương, kị khí nghiêm
ngặt, hình thành nội bào tử và hình que, hơn 150 loài đã được xác nhận cho thấy sự
đa dạng về kiểu hình, các đặc điểm sinh lý và môi trường phân bố. Nhiều loài sinh
trưởng kị khí lên men điển hình, năng lượng bắt nguồn từ sự oxi hóa không hoàn
toàn các hợp chất hữu cơ [9], [13].
Các chủng Clostridium sp. có sự phân bố rất đa dạng, pH thích hợp từ 6,5 -
7,0. Tuy nhiên, có những loài có khả năng thích nghi với pH cao thấp hơn tùy theo
khả năng trao đổi chất của chúng vì pH làm ảnh hưởng đến khả năng sử dụng đường
và từ đó dẫn tới những sự giải thích nhầm lẫn về khả năng sử dụng đường của các vi
sinh vật này (trong điều kiện thí nghiệm) [35].
Hình 2.1 Tế bào sinh dưỡng C. acetobutylicum [31].

dung môi và điều chỉnh dòng năng lượng trong trao đổi chất của Clostridium đã
được khám phá, trình tự của hầu hết các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp
dung môi và acid đã được xác định [16]. Bản đồ vật lý về NST của C.
acetobutylicum ATCC 824, C. beijerinckii NCIMB 8052 và C. saccharobutylicum
NCP 262 đã được xây dựng [33], [50]. Những nghiên cứu về phân loại học cho phép
xác định đúng về các chủng vi khuẩn được phân lập và sử dụng ở các phòng thí
nghiệm trước đây cho rằng tất cả đều là loài C. acetobutylicum [29], [30]. Rất nhiều
enzyme liên quan đến quá trình sinh dung môi của C. acetobutylicum hoặc của C.
beijerinckii hoặc cả hai loài đã được khám phá [10], [16]. Chương trình giải trình tự
bộ gen C. acetobutylicum ATCC 824 đã hoàn thành và đóng vai trò quan trọng
trong việc làm sáng tỏ đặc điểm di truyền cũng như quá trình sinh tổng hợp dung
môi của vi khuẩn này [49]. Những nghiên cứu này cho thấy hoàn toàn có thể cải
thiện được quá trình lên men sinh tổng hợp dung môi của các chủng Clostridium sp.
Một số loài Clostridium sp. đã được nghiên cứu tận tường về sự trao đổi
chất cũng như những phản ứng sinh hóa quan trọng, trong đó rõ ràng nhất là
Clostridium saccharobutylicum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum,
Clostridium beijerinckii, và Clostridium acetobutylicum [33].
Clostridium acetobutylicum: C. acetobutylicum có khả năng làm tan
gelatin và lên men được raffinose, ngoài ra C. acetobutylicum có khả năng lên men
saccharose, pectin và lên men yếu turanose.
Clostridium beijerinckii: C. beijerinckii, trước đây được gọi là C.
acetobutylicum, là vi khuẩn Gram dương, hình thành bào tử và có hình que. C.
beijerinckii có khả năng biến dưỡng các polysaccharide thành các acid như acetate
và butyrate hoặc thành các dung môi bao gồm acetone, butanol và ethanol. C.
beijerinckii không có khả năng thủy phân gelatin (ngoại trừ chủng NRRL B593), có
khả năng lên men saccharose, methyl
-
glucopyranoside, turanose, dextrin, pectin,
có khả năng sử dụng các đường
D- và L- arabitol, dulcitol và inositol, nhưng dùng

đến một khía cạnh quan trọng trong sinh học, ông là người đầu tiên chứng minh
rằng sự sống có thể tồn tại được trong điều kiện không có oxy. Dựa vào những điều
quan sát được, ông đưa ra thuật ngữ “anaerobic” [39]. Ngoài ra cũng còn nhiều nhà
khoa học nổi tiếng khác cũng nghiên cứu về sự tổng hợp biobutanol, trong đó có
Beijerinck và Winogradsky. Tuy nhiên, Fitz là người đầu tiên phân lập và nuôi cấy
thuần được chủng vi khuẩn mà ông gọi là Bacillus butylicus [17].
Thuật ngữ Clostridium sau đó được giới thiệu bởi Prazmowski (1880),
thuật ngữ Clostridium bắt nguồn từ “kloth” trong tiếng Hi Lạp có nghĩa là “que
nhỏ”. Loài thuộc giống Clostridium được biết đến lần đầu tiên là C. butyricum
(Prazmowski, 1880). Năm 1912, Chaim Weizmann đã thành công trong việc phân lập
loài C. acetobutylicum có khả năng tổng hợp butanol cao và được gọi là “Weizmann
organism” [17].
Đến thế kỷ XXI, người ta đã phân lập hơn 150 loài Clostridium sp. khác
nhau và có tác động to lớn về cả khía cạnh công nghệ sinh học cũng như thương mại
[17].
2.1.2. Cấu trúc và hình thái tế bào
Clostridium là trực khuẩn Gram dương, kị khí, sinh nội bào tử, phần lớn di
động nhờ các tiên mao mọc khắp quanh cơ thể, tế bào sinh dưỡng hình que nhưng vì
bào tử có kích thước lớn hơn chiều ngang của tế bào sinh dưỡng nên bào tử tế bào sẽ
có dạng hình thoi hay hình dùi trống, có thể thủy giải saccharide và protein. Chúng
phân bố rộng rãi trong tự nhiên, hiện diện thường xuyên trong đất, bùn ruộng, bùn
ao, có thể gây bệnh cho người và động vật, gây hư hỏng thực phẩm, sinh khí H2S
gây mùi khó chịu [16].
Tế bào của hầu hết giống Clostridium có dạng hình que thẳng hoặc cong,
phần đầu có thể là nhọn, tù hoặc tròn, đường kính và chiều dài tùy thuộc vào loài,
thời kì phát triển và thành phần môi trường nuôi cấy [37]. C. acetobutylicum có kích
thước khoảng 0,6 – 0,72?m, chiều dài 2,6 – 4,7?m. C. butyricum có kích thước
khoảng 0,5?m, chiều dài 4 – 12?m. Trong điều kiện môi trường không thích hợp
cho sự sinh trưởng, các tế bào sinh dưỡng chuyển hóa thành nội bào tử, nội bào tử
không hoạt động mà có thể chịu đựng khi gặp điều kiện khắc nghiệt. Nội bào tử có