ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
HUỲNH NHÃ VÂN
CÁC CAO CHIẾT VÀ SAPONIN CHIẾT TỪ
THÂN RỄ CÂY CÁT LỒI (Costus speciosus)
Chuyên ngành: SHTN (Hướng SLĐV) Mã
số: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. Nguyễn Thị Thu Hương
Tp. HCM, Tháng 9 – 2012
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Thị Thu Hương đã tạo điều kiện
và tận tình hướng dẫn, gợi mở cho em nhiều kiến thức trong suốt thời gian thực hiện
đế tài.
Em xin chân thành cảm ơn Th.S. Trần Mỹ Tiên và DS. Lương Kim Bích đã
giúp đỡ và truyền đạt kinh nghiệm làm việc cho em trong thời gian qua.
Cảm ơn chị Minh Anh, chị Thanh Hải, chị Trung Dung, bạn Mỹ Duyên, bạn
Huấn và các em sinh viên Thanh Nhân, Chất, Mỹ Thảo và Minh đã giúp đỡ, cùng tôi
thảo luận và giải quyết khó khăn trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Cảm ơn những người bạn thân thiết đã động viên, giúp đỡ tôi vượt qua khó
khăn.
Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện, ủng hộ con
trên con đường học vấn.
Tp. HCM, ngày 13 tháng 9 năm 2012
Ký tên
Huỳnh Nhã Vân
MỤC LỤC
MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC BẢNG vii
1.2.5.3. Hậu quả của mãn kinh 15
1.2.5.4. Liệu pháp hormone thay thế 16
1.3. Phytoestrogen 16
1.3.1. Giới thiệu 16
1.3.2. Cơ chế hoạt động của phytoestrogen 17
1.3.3. Một số tác động của phytoestrogen 18
1.3.3.1. Phytoestrogen và ER 18
1.3.3.2. Phytoestrogen và sự sinh tổng hợp steroid 19
1.3.3.3. Phytoestrogen và sự tăng trưởng- tăng sinh tế bào 20
1.3.3.4. Phytoestrogen và đái tháo đường 20
1.3.4. Diosgenin 21
1.3.5. Các phương pháp đánh giá tác dụng estrogen của phytoestrogen 22
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 24
2.1. Nguyên liệu và phương pháp chiết xuất 24
2.2. Đối tượng nghiên cứu 24
2.3. Thiết bị - hóa chất 25
2.3.1. Thiết bị 25
2.3.2. Hóa chất 25
2.4. Phương pháp nghiên cứu 26
2.4.1. Thử tinh khiết 26
2.4.1.1. Xác định độ ẩm trong dược liệu 26
2.4.1.2. Xác định độ tro 27
2.4.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 28
2.4.3. Định lượng saponin bằng phương pháp cân 29
2.4.4. Định lượng diosgenin trong dược liệu bằng HPLC-MS 30
2.4.5. Khảo sát độc tính cấp diễn đường uống và liều cho uống 31
i
2.4.6. Phương pháp gây mô hình giảm năng sinh dục 32
2.4.7. Khảo sát tác dụng kiểu estrogen 32
2.4.7.1. Phương pháp khảo sát chu kỳ động dục đầu tiên ở chuột non 33
3.4.4.1. Thể trọng chuột trước và sau thử nghiệm ở nhóm chuột non 56
3.4.4.2. Thể trọng chuột trước và sau thử nghiệm ở chuột trưởng thành bình
thường 56
3.4.4.3. Thể trọng chuột trước và sau thử nghiệm ở nhóm chuột giảm năng
sinh dục 58
3.4.5. Bàn luận 59
3.5. Tác dụng của Cát lồi trên mô hình giảm năng sinh dục-đường huyết cao 64
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 69
4.1. Kết luận 69
4.1.1. Tác dụng estrogen 69
4.1.2. Tác dụng hạ đường huyết 69
4.2. Đề nghị 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO 71
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA Analysis of Variance
AQP Aquaporin
ArKO Aromatase Knock-out
BMI Body Mass Index
cAMP cyclic Adenosine Monophosphate
DHEA-S Dehydroepiandrosterone - sulfate
E2 17β-estradiol
EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay
ER Estrogen Receptor
ERE Estrogen Response Element
ERαKO Estrogen Receptor α Knock-out
FSH Follicle-Stimulating Hormone
GH Growth Hormone
GLUT2 Glucose Transporter 2
Bảng 3.6: Tỉ lệ % các giai đoạn động dục và tỉ lệ động dục (%P + %E) ở nhóm chuột
trưởng thành bình thường từ ngày 1 đến ngày 14 47
Bảng 3.7: Tỷ lệ % động dục dương tính (%P + %E) ở nhóm chuột giảm năng sinh
dục từ ngày 7 đến ngày 15 49
Bảng 3.8: Trọng lượng tử cung-buồng trứng (mg%) ở nhóm chuột non 50
Bảng 3.9: Trọng lượng tử cung-buồng trứng (mg%) ở chuột trưởng thành bình
thường 52
Bảng 3.10: Trọng lượng tử cung (mg%) ở nhóm chuột giảm năng sinh dục 53
Bảng 3.11: Phần trăm kết hợp (B/B0 100) tính được từ các nồng độ chuẩn 54
Bảng 3.12: Nồng độ 17β-estradiol (E2) huyết tương ở nhóm chuột giảm năng sinh
dục 55
Bảng 3.13: Thể trọng trước và sau thử nghiệm ở nhóm chuột non 56
Bảng 3.14: Thể trọng trước và sau thử nghiệm ở chuột trưởng thành bình thường 57
Bảng 3.15: Thể trọng trước và sau thử nghiệm ở nhóm chuột giảm năng sinh dục .58
Bảng 3.16: Đường huyết trước và sau thử nghiệm ở các lô chứng 65
Bảng 3.17: Đường huyết trước và sau thử nghiệm ở các lô GNSD-tiêm STZ 65
v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Costus speciosus Koenig Smith 1
Hình 1.2: Con đường sinh tổng hợp các steroid 6
Hình 1.3: Sự điều hòa hormone thông qua trục H-P-G 7
Hình 1.4: Cơ chế hoạt động ở mức độ phân tử của estrogen 9
Hình 1.5: Hình ảnh mô học tử cung chuột mang thai 4,5 ngày 11
Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của 17β-estradiol, cholesterol, diosgenin và dioscin 21
Hình 2.1: Sơ đồ chiết saponin toàn phần 30
Hình 2.2: Vị trí cắt tử cung để khảo sát trọng lượng (ở chuột giảm năng sinh dục) 36
Hình 3.1: Kết quả sắc ký định tính saponin và sapogenin trong Cát lồi 42
Hình 3.2: Sắc ký đồ chuẩn diosgenin 43
Hình 3.3: Sắc ký đồ cao tổng Cát lồi 44
Hình 3.4: Sắc ký đồ saponin Cát lồi 45
trọng lượng tử cung và thay đổi sự tăng sinh trong tử cung ở liều 700 mg/kg.
Cát lồi còn là nguồn diosgenin quan trọng. Diosgenin là một sapogenin steroid có
cấu trúc tương tự như estradiol và được xem như một phytoestrogen. Tewari P.V. và
cs. (1973) báo cáo rằng hoạt động estrogen của 1600 μg diosgenin phân tách từ Cát
lồi gần như tương đương với lượng 150 μg neoclinestrol [49]. Ngoài ra, Cát lồi còn
thể hiện tác dụng giảm đường huyết tốt trên mô hình đái tháo đường thực nghiệm
[22], [23], [24], [38].
Từ các nghiên cứu trên và nhằm mở rộng nguồn phytoestrogen ở Việt Nam
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát một số tác dụng dược lý của các
cao chiết và saponin chiết từ thân rễ cây Cát lồi (Costus speciosus)” với các nội
dung sau:
- Khảo sát tác dụng estrogen của cao tổng Cát lồi và saponin toàn phần từ Cát
lồi trên cơ địa chuột nhắt trắng non, chuột trưởng thành bình thường và chuột
bị gây giảm năng sinh dục qua các chỉ tiêu:
Sự xuất hiện giai đoạn động dục dương tính (estrus phase).
Sự thay đổi trọng lượng tử cung(-buồng trứng).
Sự thay đổi hàm lượng 17β-estradiol trong huyết tương.
Sự thay đổi thể trọng.
- Khảo sát tác dụng hạ đường huyết của cao tổng Cát lồi và saponin toàn phần
từ Cát lồi trên mô hình giảm năng sinh dục đi kèm với gây tăng đường huyết
bằng streptozotocin.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về Cát lồi
1.1.1. Phân loại – mô tả
Cát lồi có tên khoa học là Costus speciosus Koenig Smith, còn gọi là mía dò,
đọt đắng, đọt hoàng, tậu chó (Lạng Sơn), sẹ vòng, cây chót, nó ưởng. Thuộc ngành
Ngọc Lan (Mangoliophyta), lớp Hành (Liliopsida), bộ Gừng (Zingiberales), họ Mía
dò (Costaceae) [6].
A B
Hình 1.1: Costus speciosus Koenig Smith
1.1.3. Thành phần hóa học và các hợp chất trong thân rễ Cát lồi
Thân rễ Cát lồi tươi chứa 77-87% nước, khi khô là 5,5% nước, 0,75% chất tan
trong ether, 6,75% chất albuminoid, 66,65% carbohydrate, 10,65% xơ, và
9,70% tro [6].
Thành phần chính chiết xuất được từ Cát lồi là diosgenin. Pandey V.B. và
Dasgupta (1970) đã chiết từ rễ khô Cát lồi được 2,12% diosgenin tinh khiết,
tigogenin và một số saponin khác. Lượng diosgenin tối đa tách được từ thân cây là
0,65%, từ lá 0,37% và từ hoa 1,21% [49].
Thân rễ Cát lồi còn chứa các thành phần gồm: β-sitosterol (một
phytoestrogen), prosapogenin A và B của dioscin, dioscin, gracillin, sitosterol,
protodioscin, methyl protodioscin, 31-norcycloartanone, cyloartanol, cycloartenol,
cycloalaudenol, tetradecyl 13-methylpentadecanoate, tetra 11-methyltriadecanoate,
4-oxotriaconsanoic acid, 14-oxoheptacosanoic acid, 15-oxooctacosnoic acid,
methylprotogracillin, protogracillin và một số hợp chất khác [49].
Thân rễ cho ra dầu chứa pinocarveol (59,9%), cadinene (22,6%), cineol
(10,7%), p-methoxybenzophenone (3,3%) và cavacrol (1,3%) [49].
Phân tích GC-MS chiết xuất từ thân rễ Cát lồi của Lijuan và cs. (2011) cho ra
6 hợp chất chính gồm diosgenin (56,31%), 9,19-cycloergost-24(28)-en-3-ol (28%),
9,12,15-octadecatrien-1-ol (5,91%), hexadecanoic acid (4,28%), 9,12-
octadecadienoic acid và β-sitosterol (3,87%); 14 hợp chất vết gồm chủ yếu là tinh
dầu (0,02-3%) và 8 hợp chất chưa biết khác [35].
Phạm Kim Mãn và cs. (Viện Dược liệu, 1985) nghiên cứu về thành phần
saponin steroid trong Cát lồi (Mía dò) chứng minh saponin steroid lên men trong
môi trường nước sẽ biến thành dạng spirostan (vòng F đóng). Khi thủy phân dạng
spirostan sẽ nâng cao hiệu suất diosgenin lên nhiều lần [6].
1.1.4. Tính vị - công dụng theo y học cổ truyền
Cát lồi có vị chua, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu
thủng, chống viêm. Loài cây này còn sở hữu nhiều hoạt tính khác như: chất làm se,
kích dục, thuốc xổ, tẩy giun sán, chất tẩy, giảm sốt và long đờm. Cả thân, lá và thân
rễ Cát lồi đều được dùng chữa bệnh. Thân rễ Cát lồi biểu hiện tính trợ tim, lợi mật,
Tác giả Lijuan và cs. (2011) tiến hành nghiên cứu tác động của cao cồn chiết
từ thân rễ Cát lồi và diosgenin trên sự co tử cung ở chuột cống trắng. Kết quả: Chiết
xuất thân rễ Cát lồi có khả năng làm tăng sự co tử cung bằng cách đi vào kênh
Calcium type I và phóng thích calci từ lưới cơ tương, từ đó có tiềm năng ứng dụng
trong những ca sinh khó do sự co dạ tiến triển chậm. Tuy nhiên dữ liệu cho thấy tác
động lên sự co tử cung không do tác động kiểu estrogen và không do tác động của
diosgenin mà chủ yếu do tác dụng của β-sitosterol có trong Cát lồi [35].
1.1.7. Tác dụng giảm đường huyết của Cát lồi
Chiết xuất nước từ thân rễ Cát lồi thể hiện tác dụng giảm đường huyết đáng
kể khi cho uống đồng thời với gây quá tải glucose [38]. Eremanthin, một
sesquiterpene lactone, chiết xuất từ thân rễ Cát lồi có hoạt tính giảm đường huyết và
giảm rối loạn lipid. Chiết xuất hexan (250 mg/kg), ethyl acetate (400 mg/kg) và
methanol (400 mg/kg) từ thân rễ Cát lồi có tác dụng giảm đường huyết đáng kể,
trong đó chiết xuất hexan có tác dụng bình thường hóa các chỉ số sinh hóa ở chuột
đái tháo đường gây bởi streptozotocin (60 mg/kg, i.p.) [22], [23], [24].
Chiết xuất từ rễ Cát lồi ngoài tác động kháng tăng đường huyết còn giúp giảm
mỡ máu và kháng oxy hóa, từ đó đóng vai trò trong việc hỗ trợ điều trị bệnh lý đái
tháo đường và những biến chứng của nó [11].
1.2. Estrogen
1.2.1. Giới thiệu
Estrogen (hay oestrogen) là nhóm hormone sinh dục đóng vai trò chủ yếu
trong chu kỳ động dục ở động vật hữu nhũ hay chu kỳ rụng trứng ở người, giúp duy
trì chức năng sinh sản ở động vật cái. Ở cả nam lẫn nữ, estrogen có một phạm vi tác
động rộng trên tim mạch, hệ cơ-xương, miễn dịch và hệ thống thần kinh trung ương.
Estrogen nội sinh gồm 3 loại chủ yếu: estrone (E1), estradiol (E2 hay 17β-estradiol)
và estriol (E3). Trong đó estradiol có hiệu lực mạnh nhất.
Ở nữ, estrogen được sản xuất chủ yếu bởi buồng trứng trong độ tuổi sinh sản
và bởi nhau thai ở thời kỳ mang thai. Ngoài ra, nó còn được sản xuất bởi tuyến
thượng thận và với số lượng ít hơn ở các mô khác như mô mỡ, xương, não, và vú
[41]. Estrogen được tổng hợp từ tiền chất ban đầu là cholesterol (Hình 1.2).
của hormone từ vùng dưới đồi – GnRH, các gonadotropin LH và FSH, và các steroid
sinh dục estradiol hoặc testosterone dẫn đến sự dậy thì cả về bên ngoài (sự phát triển
của vú và cơ quan sinh dục) lẫn bên trong (tử cung, buồng trứng, tinh hoàn) [14].
Các neuron của vùng dưới đồi sản xuất GnRH, hormone này đi vào thùy
trước tuyến yên gây ra sự phóng thích theo dạng xung (đặc biệt vào buổi tối) của hai
gonadotropin LH và FSH. Sau khi được vận chuyển đến cơ quan sinh dục, các
gonadotropin gắn vào các thụ thể màng liên kết với phức hợp protein G bên trong tế
bào mục tiêu. Ở nữ, LH làm tăng cường sự sản xuất androgen của tế bào vỏ và
progesterone của tế bào hạt. FSH kích thích sự sản xuất estrogen của tế bào hạt [39].
1.2.3. Cơ chế hoạt động của estrogen
1.2.3.1. Cơ chế hoạt động ở mức độ phân tử
Cũng như các hormone khác, estrogen tác động lên tế bào đích thông qua thụ
thể estrogen (ER). Đa số các ER trong bào tương đều ở trạng thái bất hoạt trong
phức hợp với các HSP (heat shock protein). Khi estrogen gắn vào, ER sẽ được phóng
thích khỏi phức hợp và di chuyển vào bên trong nhân. Có 4 cơ chế tác động của ER
(Hình 1.4): (A) cơ chế hoạt động kinh điển trên gene, (B) cơ chế hoạt động không
kinh điển trên gene, (C) cơ chế không trên bộ gene và (D) cơ chế hoạt động trên bộ
gene ty thể.
Trong cơ chế hoạt động kinh điển trên gene, dimer được tạo thành từ hai ER
đã gắn ligand (17β-estradiol) sẽ gắn với ERE (estrogen response element) hiện diện
trên promoter của các gene mục tiêu và điều hòa sự phiên mã của chúng. Trong cơ
chế hoạt động không kinh điển trên gene, ER thay đổi sự phiên mã bằng cách gắn
với các nhân tố phiên mã khác và biến đổi hoạt động của chúng. Cơ chế hoạt động
không trên bộ gene của estrogen có thể được khởi sự ngay trên màng tế bào thông
qua các ER trên màng hoặc bởi một kiểu thụ thể estrogen khác – GPR30 (G- protein-
coupled receptor 30). Sự hoạt hóa các protein G và nhiều con đường tín hiệu khác
nhau dẫn đến sự phosphoryl hóa và hoạt hóa các protein trong bào tương và khởi sự
đáp ứng của tế bào. Hơn nữa, sự phosphoryl hóa của các nhân tố phiên mã khác
nhau, bao gồm các ER, còn dẫn đến sự thay đổi biểu hiện của nhiều gene. Sự hoạt
hóa các con đường truyền tín hiệu có thể cũng được khởi sự bởi một phần nhỏ
bộ khi đáp ứng với các nồng độ estrogen và progesterone tuần hoàn. Estrogen có
nhiều tác động khác nhau trên các loại tế bào khác nhau ở tử cung. Ở tử cung chuột
chưa trưởng thành (21 ngày tuổi), tốc độ tăng sinh tế bào rất thấp. Sự tăng sinh được
khởi sự khi đáp ứng với estrogen tuần hoàn lúc dậy thì. Estrogen gây ra sự tăng sinh
đối với cả tế bào biểu mô và chất nền.
ERα là loại ER chiếm ưu thế trên tử cung trưởng thành. Mặc dù ERα được
biểu hiện nhiều trên tế bào biểu mô, sự tăng sinh của các tế bào này khi đáp ứng với
estradiol được cho là gián tiếp thông qua nhân tố tăng trưởng (growth factor), một
mitogen đối với biểu mô, tiết ra bởi chất nền khi đáp ứng với estrogen. Các nghiên
cứu in vitro cho thấy rằng, tùy theo bản chất của ligand và nhân tố đáp ứng trên
DNA mà nó gắn vào, ERα và ERβ có thể có những tác động trái ngược nhau trên sự
phiên mã gene. ERβ có thể tác động như một tác nhân ức chế trên hoạt động phiên
mã của ERα ở nồng độ gần bão hòa của estradiol. Một cách giải thích cho tác dụng
ức chế này đó là ERβ có thể tạo dị dimer với ERα, từ đó điều hòa chức năng của ER.
A: Lát cắt ngang tử cung ở vùng có phôi (IM) với phôi (em) bên trong lòng tử cung. B:
Lát cắt dọc tử cung ở vùng không có phôi (INTER). C và D: Tử cung được tiêm thuốc
nhuộm Chicago blue. C: Tử cung ngày 4,5 của thai kỳ. D: Tử cung ngày 5,5 của thai kỳ.
Le=luminal epithelium. S=stroma. Ge=glandular epithelium. Myo=myometrium.
Hình 1.5: Hình ảnh mô học tử cung chuột mang thai 4,5 ngày [54]
Nồng độ ERβ trong tử cung thay đổi trong suốt chu kỳ kinh nguyệt với nồng
độ cao nhất trong quá trình tăng sinh khi lượng estrogen và ERα cũng đạt tới đỉnh.
Ngoài ra, trên tử cung còn non, ERα và ERβ được biểu hiện với lượng như nhau
trong biểu mô và chất nền (stroma), và estradiol được chứng minh là làm giảm sự
biểu hiện ERβ trong chất nền [52].
Hơn nữa, estrogen còn có vai trò kích thích sự giữ nước ở nội mạc tử cung
(bao gồm chất nền, biểu mô mặt trong tử cung và biểu mô tuyến) thông qua con
đường vận chuyển nước bởi các kênh điều hòa tính thấm nước aquaporin (AQP).
Dịch nước này sau đó sẽ đi vào lòng tử cung dẫn đến giảm độ nhớt dịch tử cung
[29], [45].
1.2.4.2. Tác dụng của estrogen trên sự cân bằng glucose
được ủng hộ bởi khảo sát chứng tỏ rằng bổ sung estradiol giúp đảo ngược tác dụng
ức chế của sự cắt hai buồng trứng lên gene ob (obese gene – gene mã hóa leptin ở
mô mỡ) và nồng độ leptin tuần hoàn. Hơn nữa, nồng độ leptin trong máu ở phụ nữ
tiền mãn kinh cao hơn so với nam và phụ nữ hậu mãn kinh. Tuy nhiên, các nghiên
cứu đánh giá tác dụng của liệu pháp thay thế estrogen trên nồng độ leptin vẫn còn
mâu thuẫn.
Estradiol còn liên quan đến hormone ghrelin, hormone peptide điều khiển
cảm giác đói. Nghiên cứu cho thấy estradiol làm giảm tác dụng gây thèm ăn của
ghrelin và sự giảm lượng estrogen sau khi cắt buồng trứng liên quan đến sự tăng
nồng độ ghrelin trong huyết tương, làm tăng lượng thức ăn ăn vào và từ đó làm tăng
thể trọng. Từ các nghiên cứu trên cho thấy estradiol cung cấp một vai trò bảo vệ đối
với sự tăng cân [21].
1.2.4.4. Tác dụng kháng oxy hóa của estrogen
Các nghiên cứu gần đây cho thấy estradiol có hoạt tính kháng oxy hóa. Sự
peroxide hóa lipid thường được gây ra bởi các gốc oxy tự do, ·O2- và H2O2, và sự tổn
thương từ các gốc tự do này được ngăn chặn bởi superoxide dismutase và catalase.
Một nghiên cứu ghi nhận rằng estradiol một mình có thể ngăn chặn 70% những tổn
thương từ sự peroxide hóa lipid này. Estradiol ngăn chặn sự gãy mạch DNA theo
kiểu tương tự như các yếu tố bắt gốc tự do; catalase và superoxide dismutase. Hơn
nữa, estrogen còn ức chế sự hình thành của các gốc superoxide [21].
1.2.5. Thiếu hụt estrogen trong mãn kinh
1.2.5.1. Định nghĩa mãn kinh
Mãn kinh, đặc biệt là hậu mãn kinh, được xác định khi một phụ nữ không
thấy kinh nguyệt trong 12 tháng liên tiếp. Tiền mãn kinh được mô tả là khoảng thời
gian trước mãn kinh khi mà chu kỳ kinh nguyệt bắt đầu thay đổi cho đến chu kỳ kinh
nguyệt cuối cùng. Phụ nữ được xác định là hậu mãn kinh khi họ không thấy
Copyright: Tài liệu đại học ©