ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ
MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ
NHIÊN
PHẠM THỊ CẨM
NHUNG
KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG
CHỐNG OXY HÓA CỦA RỄ CỦ CÂY SẮN DÂY PUERARIA
THOMSONII BENTH.
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm (hướng Hóa Sinh) Mã số:
60 42 30
Hướng dẫn khoa học: TS. VÕ VĂN
LẸO
Thành phố Hồ Chí Minh – 2011
LỜI CẢM
ƠN
Khoảng thời gian làm khoá luận là khoảng thời gian khó
quên
nhất trong đời tôi. Tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến
tất
cả những người đã giúp đỡ tôi trong thời gian vừa
qua.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Võ Văn
Lẹo,
thầy đã trực tiếp hướng dẫn, kiên nhẫn truyền đạt những
kiến
thức quí báu, tận tình giúp đỡ em hoàn thành khoá luận
này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị công
nhân


iv
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ
v
MỞ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3
1.1 Tổng quan về thực vật
học

3
1.1.1. Giới thiệu về họ Đậu (Fabacecae)
3
1.1.2. Giới thiệu về cây Sắn dây Pueraria thomsonii. Benth 4
1.2. Tổng quan về hóa
học

6
Thành phần hoá học của Sắn
dây

6
1.3. Tổng quan về tác dụng dược lý và công dụng
9
1.3.1. Tác dụng dược lý
9


20
2.4.2. Thử tinh khiết
21
i
2.4.3. Khảo sát thành phần hoá học
22
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu về tác dụng chống oxy hoá
28
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
28
3.1. Khảo sát về thực vật
học

28
3.1.1. Đặc điểm hình thái dược liệu
28
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu rễ
29
3.1.3. Đặc điểm bột dược liệu
31
3.2. Thử tinh khiết
32
3.2.1. Xác định độ
ẩm

32
3.2.2. Xác định độ tro
32
3.3. Nghiên cứu thành phần hoá

56
TÀI LIỆU THAM KHẢO
57
i
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
dd: dung
dịch
DCM:
Dichloromethane
DE: Diethyl
Ether
EA: Ethyl
Acetate
HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Sắc kí lỏng cao
áp).
Me:
Methanol
MS: Mass Spectometry (Phương pháp khối
phổ).
NMR: Nuclear Magnetic Resonance (Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân)
.
SKLM: Sắc kí lớp
mỏng
Pđ: phân
đoạn
5
DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ
ĐỒ
Hình 1.1 Cây
sắn

Hình 3.6 Bột dược liệu
31
Hình 3.7 Các cấu tử trong bột rễ củ Sắn
dây

31
Hình 3. 8. Kiểm tra cao cồn bằng
SKLM.

35
Hình 3. 9. Kiểm tra kết quả phân bố lỏng - lỏng.
38
Hình 3. 10 Kiểm tra các phân đoạn từ cao DE. Hệ CHCl
3
: MeOH : H
2
O (7:3:1)
.

40
Hình 3. 11 Kiểm tra các phân đoạn từ cao EA. Hệ CHCl
3
: MeOH : H
2
O (7:3:1)
.

42
Hình 3. 12 Sắc đồ kiểm tra các chất phân lập. Hệ CHCl
3

Hình 3. 22 Phổ UV của P6
48
Hình 3. 23 Cấu trúc của P6 (= Daidzein)
51
Sơ đồ 1.1 Vị trí phân loại của Sắn
dây

4
Sơ đồ 3.1. Quy trình chiết rễ củ Sắn dây bằng ngấm kiệt với cồn 96%
34
Sơ đồ 3.2. Tách các phân đoạn bằng chiết phân bố lỏng - lỏng
37
Sơ đồ 3.3 Phân lập các chất từ cao diethyl ether.
39
Sơ đồ 3.4 Phân lập các chất từ cao ethyl acetat.
41
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
ĐỒ
Bảng 3. 1. Kết quả xác định độ ẩm của rễ củ Sắn dây.
32
Bảng 3. 2 Kết quả xác định độ tro của bột rễ củ Sắn dây
32
Bảng 3. 3. Kết quả định tính sơ bộ thành phần hoá học rễ củ Sắn
dây.
33
Bảng 3. 4 So sánh λ
max


54
MỞ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, việc phòng và chữa các bệnh do sự tác động của các gốc tự do như một
số
bệnh ung thư, tim mạch, tiểu đường và một số chứng bệnh của phụ nữ tiền mãn
kinh
đang ngày càng trở nên cấp thiết trong công tác chăm sóc sức khoẻ ở nhiều quốc
gia
trên thế giới [40] và việc tìm ra các chất chống oxy hoá có nguồn gốc tự nhiên để
làm
thuốc chữa các bệnh trên là một nhu cầu thực tế của xã
hội.
Ở phương Đông, Sắn dây (Pueraria thomsonii Benth.) là một loại thảo dược phổ
biến
được dùng lâu đời ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam. Các
nghiên
cứu
cho thấy thành phần hóa học của rễ bao gồm chủ yếu là các isoflavon,
saponin và
tinh
bột. Trong y học cổ truyền, Sắn dây được dùng để chữa bệnh cảm
sốt, sởi mọc
không
đều, viêm ruột, kiết lỵ kèm sốt và khát nước. Bột Sắn dây được
dùng như một
thứ
nước giải khát thông thường, pha nước uống giải nhiệt, làm mát
cơ thể trong mùa
hè.

với các mục tiêu cụ thể như
sau:
- Từ rễ củ Sắn dây được trồng ở Việt Nam, khảo sát phương pháp chiết xuất
cao
toàn phần và tách thành các phân đoạn có độ phân cực khác
nhau.
- Từ các phân đoạn đơn giản tiếp tục phân lập và xác định cấu trúc của hợp
chất
chính có trong các phân đoạn
này.
8
Khao sat tinh ch6ng oxy hoa cua cac cao chi6t tlr cac dung moi c6
eli)
phan
qrc
khac nhau,
CUa
cac phan
dOI_lll
thu
dUQ'C
tlr phan b6 J6ng-J6ng va
CUa
cac ch
t
phan
lp
dugc tren mo hinh ch6ng oxy hoa in vitro (mo hinh
DPPH).
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

tác
dụng phủ đất, lấy lá làm thức ăn cho gia súc. Cá biệt có loài P. tuberosa (Roxb.
Ex
Willd) DC mọc ở Nêpan, Pakistan và Ấn Độ, rễ củ có độc, thường dùng để
thuốc
cá.[10]
1.1.2. Giới thiệu về cây Sắn dây Pueraria thomsonii.
Benth
1.1.2.1. Tên
gọi
Tên khoa học: Pueraria thomsonii Benth; Pueraria lobata (Willd.) Ohwi.;
Pueraria
trilobata Backer.; Pueraria hirsuta
Schneid.
Tên khác: Cát căn, Bạch cát, Khau cát (Tày), Bẳn mắm kèo
(Thái).
Tên nước ngoài: Kudzu bean, Kudzu vine (Anh), Koudzou
(Pháp)
Hình 1.1 Cây
sắn
dây
(Pueraria thomsonii
Ben
t
h.)
1.1.2.2. Vị trí phân
loại
Lớp Ngọc Lan
(Magnoliopsida)
↓

Sắn
dâ
y
Lá kèm 2, hình bầu dục đầu nhọn mũi mác, dài 9-11 mm, rộng 0,5-1 mm,
nhiều
lông.
Rễ củ lớn, màu xám, vỏ ngoài có nhiều đường vân tròn quanh củ, bần dày, một
số
chỗ bong ra, củ cắt ngang màu trắng, nhiều sợi, có vài vòng
nâu.[10]
1.1.2.4. Phân bố sinh
thái
Pueraria DC. là chi nhỏ, gồm các loài là dây leo quấn, phân bố chủ yếu ở các
vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Á (16 loài); Việt Nam có 5 loài, trồng từ vùng
núi
đến đồng bằng. Cây ưa sáng, biên độ sinh thái rộng, sinh trưởng phát triển tốt
trên
nhiều vùng đất và tiểu khí hậu khác
nhau.
Mùa hoa: tháng 9 – 10, mùa quả: tháng 11 –
12.
1.1.2.5. Bộ phận dùng và cách chế
biến
Rễ củ (Radix Puerariae) thường gọi là Cát căn, được thu hái từ cuối tháng 10
đến
tháng 3 - 4 năm sau, đem rửa sạch đất cát, thái mỏng, phơi sấy khô. Trong y học
cổ
truyền, người ta còn đem xông sinh (lưu huỳnh) để tẩy trắng, cho vào bao bì
phù

B
Glc
a
: β –glucopyranose Glc
c
: α
–glucofuranose
Glc
b
: α –glucopyranose Glc
d
: β
–glucofuranose
- Dữ liệu phổ NMR của một số hợp chất trong rễ củ Sắn
dây:
+ Daidzein: APCI – MS (M + H)
+
: 255,137.
1
H-NMR (DMSO), δ: 6.83 (2H,
d,
J=8Hz, H-3’), 6.88 (1H, d, J = 2Hz, H-8), 6.97 (1H, dd, J = 9, 2Hz, H-6), 7.37
(2H,
d, J = 8Hz, H-2’), 7.94 (1H, d, J = 9Hz, H-5), 8.25 (1H, s, H-2).
13
C-NMR:
153.0
(C-2), 123.7 (C-3), 175.0 (C-4), 127.5 (C-5), 115.1 (C-6), 162.7 (C-7), 102.3
(C-8),
157.4 (C-9), 116.9 (C-10), 122.8 (C-1’), 130.3 (C-2’), 115.3 (C-3’), 157.6

=
8Hz, H-2’), 8.28 (1H, s, H-2).
13
C-NMR: 153.7 (C-2), 122.3 (C-3), 180.0
(C-4),
162.0 (C-5), 99.0 (C-6), 164.3 (C-7), 93.6 (C-8), 157.4 (C-9), 104.4 (C-10),
121.1
(C-1’), 130.0 (C-2’), 115.2 (C-3’), 157.4 (C-4’), 115.2 (C-5’), 130.0 (C-6’).
[31]
+ Puerarin: APCI – MS (M+H)
+
: 417,297.
1
H-NMR (DMSO) δ: 4.90 (1H, d, J
=
9Hz, glc H-1). 6.85 (2H, d, J = 8Hz, H-3’), 7.03 (1H, d, J = 9Hz, H-6), 7.40 (2H,
d,
J = 8Hz, H-2’), 8.06 (1H, d, J = 8Hz, H-5), 8.20 (1H, s, H-2).
13
C-NMR: 154.4
(C-
2), 125.5 (C-3), 178.2 (C-4), 128.1 (C-5), 116.2 (C-6), 163.1 (C-7), 113.1
(C-8),
154.5 (C-9), 118.4 (C-10), 124.2 (C-1’), 131.4 (C-2’), 116.2 (C-3’), 158.6
(C-4’),
116.2 (C-5’), 131.4 (C-6’), Glc: 75.6 (C-1), 72.9 (C-2), 80.0 (C-3), 71.7 (C-4),
82.7
(C-5), 62.7 (C-6).
[31]
1.3. Tổng quan về tác dụng dược lý và công dụng

khoa học cho việc giải thích tác dụng điều trị bệnh mạch vành của Sắn dây trên
lâm
sàng.[11]
1.3.1.2. Tác dụng hạ huyết
áp
Cao Sắn dây với liều 750 mg/kg tiêm tĩnh mạch có khả năng đối kháng với tác
dụng
kích thích tim của isoprenalin, ngoài ra còn làm giảm nhịp tim và gây hạ huyết
áp.
Trên mạc treo ruột chuột nhắt trắng nhỏ dung dịch puerarin 0,5% có tác dụng
đối
kháng với những hiện tượng do andrenalin gây nên như gây co bóp các vi
động
mạch, lưu lượng tuần hoàn
giảm.[11]
1.3.1.3. Tác dụng chống loạn nhịp
tim
Puerarin, daidzein và dạng chiết cồn từ Sắn dây, trên chuột cống trắng và chuột
nhắt
trắng với những mô hình gây loạn nhịp tim bằng aconitin, bari clorid, calci
clorid,
chloroform và thắt động mạch vành trái trước đều có tác dụng đối kháng rõ rệt
với
loạn nhịp tim do các tác nhân trên gây nên. So sánh tác dụng của 3 dạng thuốc
trên
thấy rằng daidzein có tác dụng kháng loạn nhịp tim tương đối mạnh, đối với
các
loạn nhịp tim trên đều có tác dụng rõ rệt, dạng chiết cồn có tác dụng giống
với
daidzein, điều đó chứng tỏ daidzein là thành phần chủ yếu có tác dụng chống

thụ
thể estrogen [5]
[28].
Ngoài ra, cho đến nay nhiều nghiên cứu dịch tễ học trên phụ nữ châu Á và phụ
nữ
Âu Mỹ cho thấy các chế độ ăn giàu phytoestrogen đã cải thiện các triệu chứng
thiếu
hụt estrogen ở phụ nữ mãn kinh và có thể dự phòng ung thư vú, loãng xương
và
bệnh lý tim mạch. Tuy nhiên các chất này thể hiện tác dụng sinh học thông qua
các
cơ chế cực kỳ phức tạp. Tác dụng của chúng trên tế bào phụ thuộc vào lượng
thụ
thể α và β của estrogen. Mối liên quan giữa chế độ ăn giàu phytoestrogen và
tần
suất thấp mắc phải ung thư vú và ung thư niêm mạc tử cung đã được khảo sát rất
kỹ
lưỡng và đã được khẳng định trên quần thể phụ nữ sinh sống ở Đông Á (Nhật
Bản,
Đài Loan) và Hawaii. [16],
[39]
1.3.2. Sắn dây trong Đông y cổ
truyền
- Tính vị, công
năng:

Sắn dây có vị ngọt, cay, tính bình, quy vào các kinh tỳ,
vị.

Có tác dụng giải độc, thải nhiệt, sinh tân chỉ khát, thoái chẩn, thăng dương, chỉ

Thược dược 4 g, Sinh khương 5 g, Cam thảo 4 g, nước 600 ml, sắc
còn
200 ml, chia 3 lần uống trong
ngày.

Chảy máu mũi, tâm thần phiền muộn: Củ sắn dây tươi giã nát, vắt lấy
nước
cốt, uống mỗi lần một chén
con.

Chữa rắn cắn: giã lá sắn dây tươi vắt lấy nước uống, bã đắp lên nơi rắn
cắn.

Vết thương chảy nhiều máu: Dùng lá sắn dây tươi giã nát, đắp vào
vết
thương.

Bột rắc những nơi mồ hôi ẩm ngứa: Bột sắn dây 5 g, Thiên hoa phấn 5
g,
Hòa thạch 20 g, trộn đều, tán nhỏ, rắc những nơi ẩm
ngứa.

Chữa trẻ sốt: Củ sắn dây 20 g, thêm 200 ml nước sắc còn 100 ml, cho
trẻ
uống trong
ngày.

Bột Sắn dây pha nước uống có đường giúp giải nhiệt, làm mát cơ
thể.[12]
1.3.3. Sắn dây trong dược học hiện

+ JuveCare: Là một loại thực phẩm chức năng được nhập khẩu từ nước
ngoài.
Sản phẩm cung cấp hỗn hợp các chiết xuất bổ sung nội tiết tố nữ, cung
cấp
năng lượng…Thành phần gồm: Jujube Dates (Đại Táo), hỗn hợp
Proprietary
Blend với các acid amin, Lá Ginkgo Biloba, Isoflavones (từ rễ cây Kudzu:
củ
sắn dây ).
[42]
+ Ỷ Lan: là một loại thực phẩm chức năng được sản xuất từ các nguyên
liệu
thiên nhiên có tác dụng bổ sung, cân bằng nội tiết tố cho nữ giới… Thành
phần
gồm: Delta - immun, cao Hà thủ ô đỏ, cao mầm Cải củ, cao Cát căn, cao lá
Dâu
non, cao lá Sen bánh tẻ, cao Broccoli, Isoflavonoid, Pregnenolone, DHEA
[43]
+ Metabosol: là một loại thực phẩm chức năng gồm các loại thảo dược, có
thể
dùng chung với thuốc tây điều trị đái tháo đường típ1 và đái tháo đường típ
2.
Thành phần: alpha liopic acid, Lycium fruit (kỷ tử), Morinda citrifolia
(Nhàu),
Dioscorea (hoài sơn), Cinnamon (Quế chi), Cornus (Sơn thù), Pueraria
(Cát
căn), Phelledendron amurerense (Hoàng bá)
[44].
Hình 1.4 Một
số chế

III
)
N N
N
N N
N
+Chất
ti
chố
i
ng
o
t

xy hóa
N
e
N N
N
N
N
N
N
N N
F
e
(
II
)
N

FRAP:
 Đệm acetat: 300 mM
(pH=3,6)
 10 Mm 2,4,6-tripyridyl-s-triazin (TPTZ), pha trong 40 mM
HCl
 20 mM FeCl
3
.6H
2
O trong nước
cất
Tỷ lệ các thành phần trong thuốc thử FRAP theo thứ tự trên là 10:1:1 (v/v).
Dung
dịch được yêu cầu pha mới trong
ngày.
+
an
o
x
d
a
n
Tiến
hành:
1,5 ml thuốc thử được trộn với 50 l mẫu. Hỗn hợp này được mang đi ủ
trong

thời
gian 1,5 giờ ở 37
O

peroxy hoá lipid, là một phương pháp thuận tiện và nhạy cho việc đánh giá nồng
độ
lipid peroxid trong nhiều mẫu khác nhau bao gồm thuốc, thực phẩm và mô sinh
học
từ người và động vật. [19], [32],
[36].
Phương pháp đo MDA dựa vào phản ứng với acid thiobarbituric. MDA phản
ứng
với acid thiobarbituric (TBA) ở 90
O
C trong môi trường acid tạo phức
MDA-TBA
có màu hồng, gồm 2 mol TBA kết hợp với một mol MDA. Phức màu được hoà
tan
trong dung môi hữu cơ như butanol rồi đo phổ hấp thu UV ở bước sóng 532
nm
(Hình
1.6).
O
OHC-CH2-CHO
O
H H
H
H
N
N
O
H
-2H
2

T
B
A
Thuốc
thử:
Tween 80 (1%), FeSO4 (10-3 M), acid ascorbic (10-2 M), acid trichloracetic
(30%),
acid thiobarbituric
(0,25%).
Tiến
hành:
Một hỗn hợp dung dịch gồm 2ml tween 80 (1%); 0,2 ml FeSO
4
(10 - 3 M); 0,2
ml
acid ascorbic (10 - 2 M) và 0,2 ml mẫu được trộn đều, sau đó mang đi ủ ở 40
O
C
trong tối trong thời gian 48 giờ. Kết thúc phản ứng peroxy hóa lipid bằng cách
thêm
1,3 ml acid trichloracetic (30%). Hỗn hợp này cũng được trộn đều và được ủ
trong
thời gian 1giờ. Sau đó dung dịch này được mang đi ly tâm ở tốc độ 600
vòng/phút
trong thời gian 10 phút. Lấy 2 ml dịch ly tâm, cho vào 1 ống nghiệm, thêm vào 2
ml
acid thiobarbituric (0,25%), đặt vào nước sôi khoảng 15 phút, để nguội, đo độ
hấp
thu ở bước sóng 532 nm. Kết quả đo được lặp lại trên 3 mẫu thử và lấy giá trị
trung

hấp
thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển
từ
tím sang vàng nhạt. Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất chống oxy
hóa
được minh họa trong hình 1.7
[16].
N
N
.
O
2
N
N
.
N
O
2
+ AH
O
2
N
NH
N
O
2
+
A

.

hấp
thu ở bước sóng 517 nm. Kết quả đo được lặp lại trên 3 mẫu thử và lấy giá trị
trung
bình.
Tính kết
quả:
(%) ức chế gốc DPPH của các mẫu thử được tính theo công
thức:
% ức chế DPPH = [(Ac - At)/Ac]


100
Trong đó, Ac: độ hấp thu của mẫu chứng (không có mẫu
thử)
At: độ hấp thu của mẫu thử nghiệm ở t = 16
phút.
1.4.4. Phương pháp xác định khả năng bất hoạt enzyme xanthin
oxidase
Phương pháp được thực hiện theo Noro và cộng sự (1983) [29],
[33]
Nguyên
tắc:
Xanthin oxidase là một enzyme tiền oxy hóa xúc tác phản ứng oxy hóa xanthin
tạo
acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do O
2
 Phương pháp thử xanthin
oxidase
sử
dụng phổ UV-Vis khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthin oxidase của

I (%) = [(Ac-As)/Ac] 
100
Trong đó, Ac: Giá trị mật độ quang của mẫu chứng (không có mẫu
thử)
As: Giá trị mật độ quang của mẫu thử
nghiệm

Trích đoạn Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu thành phần hoá học

---