CHƯƠNG 6: CÔNG NGHỆ
HỖ TRỢ SINH SẢN
6.1. GIỚI THIỆU
• Khái niệm
Các kĩ thuật can thiệp vào các giai đoạn khác nhau thuộc cơ
chế sinh sản của người và động vật có vú, nhằm giúp cho cá
thể sinh con bình thường gọi là kĩ thuật hỗ trợ sinh sản.

Hệ thống
,
hiệu quả và sự chuẩn độ của các quy trình kĩ thuật

Hệ thống
,
hiệu quả và sự chuẩn độ của các quy trình kĩ thuật
trong phòng thí nghiệm, kết hợp với các phác đồ trị liệu y học,
nhằm hỗ trợ trong suốt cả giai đoạn của tiến trình sinh sản, để
cuối cùng, tạo ra những cá thể mới (ở người và động vật có
vú) được gọi là công nghệ hỗ trợ sinh sản hay công nghệ sinh
sản được hỗ trợ (Assisted reproduction technology - ART).
 Hỗ trợ sinh sản là một quy trình công nghệ, nhằm tạo ra cá
thể mới với nhiều kĩ thuật hỗ trợ phù hợp cho từng giai đoạn
trong tiến trình sinh sản.
CHƯƠNG 6: CÔNG NGHỆ
HỖ TRỢ SINH SẢN
6.1. GIỚI THIỆU
• Ứng dụng:
sử dụng như là một liệu pháp điều trị vô sinh, mà còn là
phương tiện hữu ích, nền tảng để tiến hành các nghiên cứu
khác ở người và động vật (chuyển gen, chẩn đoán sớm, bảo
tồn động vật, nhân bản, thu tê bào gốc

 Năm 1959, con thỏ đầu tiên được ra đời từ phương pháp thụ tinh
trong ống nghiệm.
 Năm 1961, Petrucci (Italia) nêu những điều kiện đế thụ tinh trong
ống nghiệm; được Edward và Steptoe tiếp tục vào năm 1962.

N
ăm
1971
, Steptoe đã bắt dầu thực hiện hút
149
trứng
qua
nội soi ổ

N
ăm
1971
, Steptoe đã bắt dầu thực hiện hút
149
trứng
qua
nội soi ổ
bụng và nuôi được 112 tế bào đến giai đoạn phôi nang; tuy nhiên
không thể tiến hành cấy truyền. Có 1 trường hợp báo cáo cấy thành
công, phôi có hiện tượng làm tổ, nhưng thai lại nằm ngoài tử cung.
 Ngày 25/7/1978, lần đầu tiên một em bé (Louise Brown) ra đời bằng
công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm tại một bệnh viện ở Anh. Năm
1982, bé gái thứ hai (Amadine) ra đời bằng công nghệ này ở Pháp.
 Năm 2005, phác đồ mới trong kĩ thuật trữ trứng đã cải thiện đáng kế
tỉ lệ thụ tinh. Nhiều em bé đầu tiên từ cả trứng và tinh trùng đông lạnh

2
được theo dõi ít nhất qua hai tháng. Ngoài ra các thử nghiệm
NST, xét nghiệm HbsAg, HIV, BW cũng phải được tiến hành. Hơn
nữa nếu người cho trứng đã từng có ít nhất là một con bình thường
thì càng tốt.
CHƯƠNG 6: CÔNG NGHỆ
HỖ TRỢ SINH SẢN
6.2. KĨ THUẬT CHUẨN BỊ GIAO TỬ
6.2.1 Chuẩn bị trứng
• Cho trứng (oocyte donation)
Việc thu nhận nguồn trứng trưởng thành ở người thường được tiến
hành thông qua một phác đồ trị liệu (down regulation protocol) :
- người cho trứng được tiêm GnRHa (DecapepTil 0,1 mg) dưới da
mỗi ngày trong vòng 14 ngày (kể từ ngày thứ 21 của chu kì kinh
nguyệt).
- Thử lại LH và E2, nếu LH > IU/L và E2 > 50 pg/ml thì bắt đầu kích
thích buồng trứng với FSH/hMG. Ngược lại, nếu các giá trị trên chưa
đạt, phải tiếp tục tiêm GnRHa.
-Tiêm phối hợp và song song giữa GnRHa (0,05 mg) với FSH
(Puregon 50 IU; 100 IU), liều lượng tuỳ theo tuổi và trạng thái sinh lí
người cho trứng.
CHƯƠNG 6: CÔNG NGHỆ
HỖ TRỢ SINH SẢN
6.2. KĨ THUẬT CHUẨN BỊ GIAO TỬ
6.2.1 Chuẩn bị trứng
• Cho trứng (oocyte donation)
- Theo dõi sự phát triển (kích thước và số lượng) của nang trứng bằng
siêu âm 2-3 ngày một lần. Đồng thời theo dõi hormone (LH, E2) từ
ngày thứ 6 sau khi kích thích.
- Khi xuất hiện ít nhất hai nang trứng lớn nhất đạt kích thước siêu âm

 Liều dùng của các hormone nói trên tuỳ thuộc vào từng loài, tuổi và
trọng lượng con vật; cũng như phụ thuộc vào loại thuốc, thời gian tiêm. Ớ
một số loài như chuột, hiệu quả kích thích rụng trứng còn phụ thuộc vào
chu kì sáng tối
CHƯƠNG 6: CÔNG NGHỆ
HỖ TRỢ SINH SẢN
6.2. KĨ THUẬT CHUẨN BỊ GIAO TỬ
6.2.1 Chuẩn bị trứng
• Gây rụng trứng nhiều (superovulation)
 Hội chứng quá mẫn buồng trứng (Ovarian hyp er-stimulation Syndrome
- OHSS)
Tác động bất lợi nhất của việc kích thích buồng trứng bằng hormone là có
thể xuất hiện hội chứng quá mẫn của buồng trứng và trường hợp chửa đa
thai. Về mặt lâm sàng, hội chứng này nếu nhẹ, hay trung bình không quan
trọng, nhưng biểu hiện nặng có thể đe dọa tính mạng. Hội chứng có một
số biếu hiện:
- Nhẹ : tăng hàm lượng estrogen, buồng trứng to lên chứa các nang nhỏ.
-Trung bình : ngoài các biểu hiện trên còn xuất hiện tiêu chảy, nôn ói.
- Nặng : kích thước nang lớn làm buồng trứng to, độ thấm quanh mao
mạch tăng làm thoát dịch gây tích nước cổ trướng trong ố bụng và tràn
dịch màng phổi, gây khó thở.
CHƯƠNG 6: CÔNG NGHỆ
HỖ TRỢ SINH SẢN
6.2. KĨ THUẬT CHUẨN BỊ GIAO TỬ
6.2.1 Chuẩn bị trứng
• Thu nhận trứng
 Có thể thu nhận trứng động vật bằng nhiều cách : từ ống dẫn trứng sau
khi rụng, từ nang trứng của buồng trứng bằng nội soi-siêu âm hoặc bằng
giải phẫu những con vật còn sống vấ cuối cùng từ nang trứng của buồng
trứng ở những động vật đã bị giết

trứng ultrasound) và gội rửa nang trứng (follicular flushing).
CHƯƠNG 6: CÔNG NGHỆ
HỖ TRỢ SINH SẢN
6.2. KĨ THUẬT CHUẨN BỊ GIAO TỬ
6.2.1 Chuẩn bị trứng
Cấu trúc buồng trứng của động vật có vú
CHƯƠNG 6: CÔNG NGHỆ
HỖ TRỢ SINH SẢN
6.2. KĨ THUẬT CHUẨN BỊ GIAO TỬ
6.2.1 Chuẩn bị trứng
• Quan sát và phân loại trứng
 Kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại (x6 - xl2) dùng để kiểm tra dịch và
với độ phóng đại cao hơn (x25 - x50) được sử dụng để quan sát tế bào
trứng. Nếu trứng trưởng thành, lớp tế bào cumulus sẽ làm trứng trở nên
mờ, nhạt
m
ầ
u
;
nếu trứng chưa trưởng thành chúng sẽ tối và cũng khó quan
mờ, nhạt
m
ầ
u
;
nếu trứng chưa trưởng thành chúng sẽ tối và cũng khó quan
sát.
 Trứng thường được quan sát với chất lượng khác nhau thông qua sự hiện
diện của lớp tế bào cumulus ( kinh nghiệm của người thao tác rất quan
trọng trong việc đánh giá chất lượng trứng thông qua cảm quan hiển vi).

80
IU/ml tại
37
°
c trong
30
-
60
giây
.
Dùng một pipette nhọn tách lớp
80
IU/ml tại
37
°
c trong
30
-
60
giây
.
Dùng một pipette nhọn tách lớp
cumulus xung quanh trứng ra khỏi phức hợp OCC. Rửa trứng vài lần bằng
dung dịch thu trứng có bổ sung 10% huyết thanh. Khi trứng đã tách khỏi
các cumulus, tiêu chuẩn đánh giá cũng giống như khi trứng còn lớp
cumulus. Kĩ thuật này thuận lợi là trứng được đánh giá cấn thận hơn và
thường sử dụng trong ICSI
CHƯƠNG 6: CÔNG NGHỆ
HỖ TRỢ SINH SẢN
6.2. KĨ THUẬT CHUẨN BỊ GIAO TỬ

 Các trứng được lấy trực tiếp từ việc chọc hút nang thường chưa trưởng
thành, sau khi thu nhận, phải đưa trứng vào ống nghiệm chứa môi trường
nuôi có đệm HEPES, huyết thanh và heparin (đã ủ ở 37°C). Trước khi
đưa vào môi trường nuôi chín, trứng phải được rửa bằng môi trường thu
đưa vào môi trường nuôi chín, trứng phải được rửa bằng môi trường thu
nhận (đã được làm ấm 37°C) và lần cuối cùng rửa bằng môi trường nuôi
chín. Sau đó đưa trứng vào các giọt môi trường nuôi đã tạo sẵn trên đĩa
Petri, mỗi giọt thường chứa từ 1-10 tế bào trứng.
 Môi trường nuôi chín trứng khác nhau giữa các loài, đồng thời khác
nhau về mục đích sử dụng và đôi khi tuỳ thuộc vào các phòng thí nghiệm.
Môi trường cho IVM được chia thành hai loại : đơn giản (simple medium)
và phức tạp (complex medium). Môi trường đơn giản là hệ thống đệm
bicarbonate chứa các muối như pyruvate, lactate và glucose.
CHƯƠNG 6: CÔNG NGHỆ
HỖ TRỢ SINH SẢN
6.2. KĨ THUẬT CHUẨN BỊ GIAO TỬ
6.2.1 Chuẩn bị trứng
• Nuôi trứng trưởng thành:
Sự khác biệt chủ yếu giữa các loại môi trường đơn giản với nhau là nồng
độ ion và nồng độ các chất cung cấp năng lượng trong môi trường. Các
môi trường thường được cung cấp huyết thanh hay albumin và một lượng
thích hợp
các
kháng sinh (thường dùng là penicillin, streptomycin và
thích hợp
các
kháng sinh (thường dùng là penicillin, streptomycin và
gentamicin). Các môi trường phức tạp thường chứa thêm một số yếu tố
như amino acid, vitamin, purine và những chất khác.
 Môi trường IVM còn được bổ sung hormone (FSH, LH/ hCG, estradiol,

đ
ạo
giả (Artificial vagina
-
AV) cấu tạo gồm vỏ
•
Hay
đ
ượ
c
s
ư
̉
dụ
ng
Âm
đ
ạo
giả (Artificial vagina
-
AV) cấu tạo gồm vỏ
ngoài cứng, ruột bằng cao su mềm, phễu hứng tinh, đai cao su (với heo
cần phải có thêm song liên cầu dể tạo áp lực và các nhu động).
• Thời điểm tốt nhất để lấy tinh dịch thử là sau khi kiêng giao hợp hoặc
xuất tinh từ 3 - 5 ngày (có thể từ 2 - 7 ngày) đê’ tránh sự giảm thế tích
tinh dịch và số lượng tinh trùng. Nếu kiêng giao hợp quá lâu (> 7 ngày),
có thể giảm độ di động, tăng số lượng tinh trùng chết và dị dạng trong
mẫu tinh dịch, khả năng thụ tinh của tinh trùng cũng bị giảm.
.
CHƯƠNG 6: CÔNG NGHỆ

n
ô vuông
đó
.
100
, sau đó chia cho tổng số tinh trùng đếm được trong
n
ô vuông
đó
.
• Những nghiên cứu về hình dạng tinh trùng người được thông qua kĩ thuật
nhuộm màu và gắn chất phát huỳnh quang (vào NST), có thể được sử
dụng như một yếu tố phụ để xác định hình dạng sau khi quan sát. Các tinh
trùng có hình dạng xấu có thể do quá trình đóng gói NST còn lỏng, và
điều này sẽ làm thất bại sự khử xoắn (decondensation) trong quá trình thụ
tinh.
• Đối với những hư hỏng trên NST của tinh trùng, có thể sẽ được phát hiện
bằng phương pháp nhuộm chromomycin (CMA3) và nhuộm Aniline blue
(AAB).
CHƯƠNG 6: CÔNG NGHỆ
HỖ TRỢ SINH SẢN
6.2. KĨ THUẬT CHUẨN BỊ GIAO TỬ
6.2.2 Chuẩn bị tinh trùng
c/ Kháng thể kháng tinh trùng - tinh trùng và miễn dịch
• Tinh trùng gây đáp ứng miễn dịch không chỉ giữa hai loài khác nhau (ví
dụ giữa người và động vật) hoặc hai cá thể khác nhau cùng loài (ví dụ
nam và nữ) mà kể cả trong cùng một cá thể. Nguyên nhân của hiện tượng
này là hệ thống miễn dịch phát hiện được chất ngoại sinh và nội sinh
này là hệ thống miễn dịch phát hiện được chất ngoại sinh và nội sinh
trước khi tinh trùng phát triển trong quá trình dậy thì, kết quả là hệ miễn