ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT
1.1 Định nghĩa
1.2 Nguyên tắc
1.3 Quy trình thực hiện
1.3.1 Chuẩn bị mẫu
1.3.2 Chạy điện di một chiều với SDS-PAGE
1.3.3 Chuyển protein từ gel lên màng
1.3.4 Lai với antibody
1.3.5 Phát hiện và phân tích hình ảnh
1.4 Ưu, nhược điểm
1.4.1 Ưu điểm
1.4.2 Nhược điểm
1.5 So sánh với phương pháp ELISA
1.6 ứng dụng
CHƯƠNG 2. ỨNG DỤNG
2.1 Tình hình bệnh và tác hại bệnh trên thế giởi và ở Việt Nam
2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới
2.1.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam
2.2 Giới thiệu hội chứng Taura- TS
2.2.1 Khái niệm
2.2.2 Đặc điểm cấu trúc và gene của Taura-TS
2.2.3 Biểu hiện bệnh hội chứng Taura ở tôm
2.3 Các phương phápvà kỹ thuật chuẩn đoán virus Taura
2.3.1 Chuẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng
2.3.2 Phương pháp miễn dịch
2.3.3 Phương pháp chuẩn đoán bằng mẫu dò gene
2.4 Vật liệu và phương pháp
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 1

và từng vạch protein được phát hiện bằng cách ngâm màng nitrocellulose với kháng thể
đơn dòng hoặc đa dòng có gắn enzyme hoặc đánh dấu phóng xạ đặc hiệu cho protein
quan tâm. Nếu protein quan tâm được kết hợp bởi kháng thể đánh dấu phóng xạ, vị trí
của nó trên các điểm có thể được phát hiện bằng cách chụp màng lên tấm film X quang.
Gọi là hình X quang.
1.3 Quy trình thực hiện
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 3
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
1.3.1 Chuẩn bị mẫu
-Mẫu được lấy từ mô thực vật, hoặc động vật bằng cách cắt ra thành nhiều mảnh
nhỏ.
-Cho thêm các chất tẩy rửa, muổi, dung dịch đệm khác nhau để ly giải tế bào và hòa
tan protein.
- Rửa sạch các tế bào trong bình nuôi cấy mô hoặc bằng cách thêm dung dịch đệm
phosphate buffered saline (PBS) lạnh và lắc nhẹ nhàng.
• Lysis buffer (dùng để chuẩn bị mẫu để chạy trên gel, các tế bào và mô cần phải
được phân giải để giải phóng protein quan tâm) chứa:
Sodium hydroxide(NaOH): phá vỡ thành tế bào.
Sodium dodecyl sulfate(SDS): hòa tan màng tế bào.
Tris, pH 7,5
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 4
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
Nó sẽ phá vỡ các liên kết hydro giữa các base DNA, SDS cũng làm
biến tính phần lớn các protein trong các tế bào.
-Ngay sau khi ly giải xảy ra, dephosphoryl phân giải protein, và biến tính bắt đầu.
Để ngăn chặn sự tiêu hóa của mẫu bởi các enzyme của tế bào ta thêm chất ức chế
protease và phosphatase vào dung dịch đệm.
-Chuẩn bị mẫu thường được thực hiện ở nhiệt độ lạnh(C) để tránh làm biến tính
protein và suy thoái.
1.3.2 Chạy điện di 1 chiều

gel lên màng nitrocellulose hoặc polyvinylidene difluoride( PVDF). Ta chọn màng
nitrocellulose.
- Cắt kính thước màng tế bào vào giấy lọc cho cùng kích thướt với gel
+ Xử lý các gel nhẹ nhàng trong đệm SDS. Không ngâm gel trong bộ đệm khác
như PBS, bởi vì để giữ cho protein điện tích âm.
- Ngâm màng, giấy lọc, và miếng thấm trong bộ đệm western transfer buffer.
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 6
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
- Khi lắp ráp các lớp thấm để thực hiện việc chuyển protein, tránh có không khí
hoặc bong bóng ở giữa màng và gel, ta giữ màng và gel ướt cho đến khi phân tích
western blot hoàn thành.
- Thực hiện chuyển protein trên màng trong khoảng 30 phút với cường độ
20mA/cm.
+ Trong thực tế, phương pháp này không được sử dụng phổ biến vì chúng mất
nhiều thời gian; electrblotting được ưa thích hơn. Kết quả của hai quá trình “ thấm” các
protein được tiếp xúc trên bề mặt một lớp mỏng để phát hiện. Cả hai mạng tế bào được
lựa chọn cho các thuộc tính cụ thể không protein ràng buộc( tức là liên kết tất cả các
protein tốt như nhau).
+Protein ràng buộc dựa trên tương tác kỵ nước, cũng như tính tương tác giữa các
màng tế bào và protein. Màng nitrocellulose rẻ hơn so với PVDF, nhưng mỏng manh hơn
và không đứng lên cùng probing lặp đi lặp lại.
+Tính đồng nhất và hiệu quả tổng thể của chuyển protein từ gel màng có thể được
kiểm tra bằng cách nhuộn màng với coomasise Brilliant blue hoặc S thuốc nhuộm
ponceau. Ponceau S phổ biến hơn do độ nhạy cao hơn và độ hòa tan nước, sau này làm
cho nó dể dàng hơn để sau đó destain và thăm dò màng
1.3.4 Lai với antibody
- Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí như đã
phân tách trên gel. Rửa màng lai 5-10 phút trong dung dịch TTBS.
TTBS là hỗn hợp của Tris-buffered saline và Tween 20 0.05%
 Nếu trong TTBS mà không cho Tween thì kháng thể nó bám

Phản ứng này diễn ra bằng cách chuyển đổi thuốc nhuộm hòa tan thành một dạng
không hòa tan của một màu sắc khác nhau tủa thành các vết ngay bên cạnh các enzyme
và qua xuất hiện vết tren màng.
Phản ứng phát triển của blot sau đó dừng lại bằng cách rửa đi những thuốc nhuộm
hòa tan. Hàm lượng protein được đánh giá thông qua densitometry ( cường độ vết là)
hoặc quang phổ.
 Phát hiện bằng huỳnh quang
Các đầu dò gắn huỳnh quang được kích thích bới ánh sáng và sự phát xạ kích thích
sau đó được phát hiện bởi một photosensor như CCD máy ảnh kỹ thuật số và cho phép
phân tích dữ liệu xa hơn như phân tích trọng lượng phân tử, số lượng phân tử. Huỳnh
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 8
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
quang được coi là phương pháp tốt nhất để định lượng, nhưng ít nhạy cảm hơn
Chemiluminescent.
 Phát hiện bằng phương pháp Chemiluminescent
Phương pháp phát hiện Chemiluminescent phụ thuộc vào ủ màng lai với một chất
nền sẽ làm cho luminese tiếp xúc với reporter trên kháng thế sơ cấp. Ánh sang sau đó
được phát hiện bởi phim ảnh, và gần đây hơn bởi máy ảnh CCD chụp một ảnh kỹ thuật
số. Những hình ảnh được phân tích bởi densitometry, đánh giá số lượng tương đối của
nhuộm protein và định lượng các kết quả về mật độ quang học. Mới hơn phần mền cho
phếp phân tích trọng lượng phân tử nếu các tiêu chuẩn thích hợp được sử dụng.
1.4 So sánh với phương pháp ELISA
2.2.1 Phương pháp ELISA ( enzyme linked immunosorbent assay)
Còn được gọi là EIA( enzyme immuno assay)
Nguyên tắc: dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể được gắn
với một enzym bằng liên kết đồng hoá trị. Kháng nguyên được gắn với giếng plastic và
kháng thể liên kết với enzyme được gắn với kháng nguyên. Kháng thể không gắn kháng
nguyên sẽ bị rửa trôi đi. Enzyme được giữ lại và vì vậy lượng kháng thể gắn enzyme
được phát hiện bằng cách cho thêm vào một cơ chất(introphenol phosphate) làm thay
đổi màu do hoạt tính của enzyme. Ðộ màu tạo thành là tỉ lệ với lượng enzyme bám ở

-Chạy trên gel SDS-PAGE.
-Tắc nghẽn với protein dư.
-Kháng thể đối kháng với
protein X được đánh dấu
phóng xạ hay enzyme
-Trích từ kháng nguyên.
-Phức hợp giữa kháng
nguyên-kháng thể.
- Cho thêm chất tạo màu.
-Chạy trên đĩa plastic.
-Tắc nghẽn với kháng
nguyên dư.
-Kháng thể gắn đặc hiệu với
kháng nguyên thông qua
enzyme.
2.3 Ưu, nhược điểm
2.3.1 Ưu điểm
- Cho kết quả nhanh.
- Sinh phẩm dễ bảo quản.
- Có thể làm số lượng hàng loạt hay ít mẫu.
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 10
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
- Không đòi hỏi thiết bị đặc biệt, không cần máy móc, dụng cụ đắt tiền.
- Độ đặc hiệu cao. Đọc kết quả bằng mắt thường.
- Có thể thực hiện ở các tuyến cơ sở.
2.3.2 Nhược điểm
- Chỉ xác định được sự có mặt của protein hiện diện nhưng không xác định
được số lượng cụ thể.
- Chi phí giá thành cao do western blot chỉ có thể thực hiện với điều kiện các
kháng thể kháng lại protein quan tâm là có sẵn

qua, Virus hội chứng Taura (TSV) đã bùng phát ở nhiều khu vực nuôi tôm trên thế giới,
đặc biệt là các nước Châu Mỹ- Latinh. Vào tháng 4/2005 virus hội chứng Taura lại gây
dịch lớn tại Châu Mỹ (Infofis, 6/4/2005), khiến sản lượng tôm của Venezuela sụt giảm
khoảng 90%. Và dần dần virus hội chứng Taura cũng đã lây lan sang các nước Châu Á
khi tôm TCT được du nhập và nuôi nhiều như ở Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan. Năm
1999/2000 TSV được phát hiện ở TCT tại Trung Quốc và Đài Loan (Tu et al., 1999; Yu
và Song, 2000) với 19 trường hợp thông báo cho OEI từ Đài Loan vào năm 1999, dẫn
đến 700.000 trường hợp và 200.000 tôm chết vào năm 2000 và dẫn đến 500.000 trường
hợp và 50.000 tôm chết vào năm 2001.
3.1.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam
Việt Nam có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển nghề nuôi tôm biển. Sản lượng
tôm xuất khẩu toàn quốc đã từng đạt 40-45 ngàn tấn/năm, chiếm gần 10% sản lượng tôm
Châu Á, mang lại lợi ích đáng kể cho người nuôi tôm (Lý Thị Thanh Loan 2001).
Cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm trên qui mô công nghiệp, “dịch bệnh”
tôm tại Việt Nam cũng đã bắt đầu xuất hiện ngay từ những năm đầu thập niên 90. Năm
2003, bệnh hội chứng Taura đã bùng phát ở tôm thẻ chân trắng, gây ảnh hưởng nghiêm
trọng tại nhiều vùng nuôi như Quảng Ninh, Phú Yên, Bạc Liêu, Cà Mau.
3.2 Giới thiệu về hội chứng Taura-TS
3.2.1 Khái niệm
Tên phổ biến thường gọi là virus gây bệnh hội chứng Taura (TSV). Ngoài ra có một
số tên gọi khác chỉ tác nhân gây bệnh hội chứng Taura như: hội chứng Taura (Taura
Syndrome – TS); bệnh Hội chứng Taura (Taura Syndrome Disease – TSD); bệnh đỏ
đuôi (Red Tail Disease – RTD) (Lightner, 1996).
3.2.2 Đặc điểm cấu trúc và gene của TST
TSV là loại virus RNA có dạng hình khối 20 mặt, đường kính 30 – 32 nm, không có
vỏ envelope được sao chép trong nguyên sinh chất tế bào vật chủ.
Genome của TSV có kích thước khoảng 9 kb, xoắn đơn thẳng, có 10.205
nucleotid, tạo chuỗi poly–A –3’, chứa hai khung đọc mở (Open Reading Frame - ORF)
lớn
3.2.3 Biểu hiện bệnh hội chứng Taura ở tôm

nguồn thương mại. Phương pháp này có độ chính xác đặc hiệu, độ nhạy lớn hơn những
phương pháp chẩn đoán truyền thống, tế bào học cổ điển.
3.4 Vật liệu và phương pháp
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 13
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
Có nhiều phương pháp được sử dụng nhưng ở đây ta chỉ đi sâu vào phương pháp
western blot
3.4.1 Các dung dịch gốc để nhuộm gel
Dung dịch nhuộm (0,025% Coomassie Brillant Blue R250; 40% methanol; 7%
acetic acid)
Dung dịch giải nhuộm I (40% methanol; 7% acetic acid)
Dung dịch giải nhuộm II (5% methanol, 7% acetic acid)
3.4.2 Các dung dịch gốc để thực hiện western blot
Towbin transfer buffer (25mM Tris, 192mM glycine, 20%MeOH, 0,1%SDS)
3.4.3 Vật liệu
3.4.3.1 Kháng thể
Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đa dòng tổng hợp kháng với WSSV, IHHNV, MBV,
YHV (được sản tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học
Nhiệt Đới)
Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đa dòng đặc hiệu với RTV (được sản tại phòng thí
nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vât – Viện Sinh Học Nhiệt Đới)
Kháng thể thứ cấp: IgG kháng huyết thanh thỏ kháng IgY, được đánh dấu enzyme
Peroxidase.
3.4.3.1 Mẫu
• Chuẩn bị mẫu
Protease của tôm cũng như của các loài động vật thuỷ sinh khác là các protease nội
bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá, sau đó đến nội tạng và cơ thịt. Đặc biệt ở
tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme sẽ tập trung nhiều
nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan khác.
Mẫu đầu và nội tạng tôm sú được phân tách từ tôm sú sống, loại 40 - 50 con/kg

Thực hiện điện di
• Đậy nắp máng điện di. Nối hai điện cực vào bộ cấp điện.
• Bật điện bộ nguồn. Chỉnh dòng điện 100 mA.
• Quan sát sự di chuyển của vạch màu trong gel điện di, nếu vạch màu chạm
đáy gel, tắt bộ điện nguồn. Quá trình điện di đã hoàn tất.
• Đổ bỏ dung dịch điện di. Gở khuôn gel ra máng. Cẩn thận gở tách gel ra
khỏi khuôn gel để tiến hành nhuộm hay blotting.
3.4.4.2 Phương pháp Western Blot
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 15
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
Sau khi thực hiện chuyển protein lên gel SDS ta thực hiện phản ứng gắn protein-
kháng thể bằng phương pháp western blot với những bước như sau:
Tách bỏ phần stacking gel ra khỏi running gel. Ngâm running gel trong Towbin
transfer buffer trong 5 – 15 phút để cân bằng ion.
Ứng với mỗi gel, cắt giấy thấm và màng nitrocellulose cho vừa với cassette.
Làm ướt màng nitrocellulose bằng cách thả dần vào trong khay nước cất trong 2 –
3 phút.
Đặt gel lên màng rồi cho vào giữa hai tờ giấy thấm dày đã cắt ở bước 2. Sau đó
kẹp chúng vào giữa hai tấm bọc nylon mềm (sponge) và kẹp vào cassette. Tất cả các thao
tác này đều phải thực hiện trong một khay chứa Towbin transfer buffer.
Dùng một pipette thủy tinh lăn lên trên để đuổi bỏ bọt khí (nếu có) giữa các lớp.
Cho dung dịch Towbin transfer buffer vào buồng để ngập hai hai lưới điện cực.
Cho cassette đã chuẩn bị ở bước 4 và 5 vào buồng, chú ý đặt mặt có màng nitrocellulose
gần lưới điện cực [+]. Các bước làm được trình bày như hình trên.
Đặt buồng lên trên máy khuấy từ. Nối hệ thống làm lạnh vào buồng. Bật máy
quay từ để làm lạnh dung dịch đệm trong quá trình chuyển band.
Nối buồng với bộ cấp năng. Bật điện bộ cấp năng và điều chỉnh điện thế 50V.
Sau khi hoàn tất chuyển band, chuyển điện thế về zero, tắt nguồn điện.
Tháo cassette và lấy màng ra khỏi hệ thống.
Màng nitrocellulose này sẽ được đưa vào qui trình phát hiện bằng phản ứng

hiện màu
chụp hình
3.5 Kết quả
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 17
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
Giếng 1: Thang protein chuẩn Low Range.
Giếng 2, 3: dịch siêu ly tâm tế bào nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Long An (RTV-
PmLA/SLT)
Giếng 4, 5: dịch tế bào (DTB) Sf9
Giếng 6, 7: DTB nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Cần Giờ bị bệnh (RTV-PmCG).
Giếng 8: DTB nhiễm virus thu từ tôm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA)
Giếng 9, 10: DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng (RTV-PvM).
Nhận xét: Kết quả cho thấy một số vạch protein từ gel điện di đã được thể hiện trên
màng lai này. Đó là các protein gắn đặc hiệu với kháng thể. Kết quả xác định được một
số vạch protein từ các mẫu nhiễm virus khác so với mẫu tế bào đối chứng.
Tên mẫu Các vạch protein thu được (kDa)
RTV- >108 52 51 40
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 18
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
PmoLA/LT
RTV-PmCG 52 51 40 Có 4 vạch 29, 30-
31, 33 kDa
RTV-PmLA 52 51 40 Có 4 vạch 29, 30-
31, 33 kDa
PRV-PvanM 52 51 40 24 9
vạch
trong
17-
29
kDa

3.6 Kết luận
RTV được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9 có nguồn gốc từ tôm sú hay tôm
TCT đều có khả năng gây nhiễm cho tôm sú giống và tôm thẻ thịt ngày tuổi.
RTV của tôm sú và tôm thẻ có các protein đặc trưng giống TSV ở tôm TCT là 52,
51 và 40 kD.
Có thể RTV từ tôm sú là một loại virus mới có liên quan gần với TSV hoặc là TSV
đã biến thể để thích nghi với vật chủ mới là tôm sú
Ngoài ra cần phải sử dụng thêm nhiều phương pháp để đảm bảo kết quả có độ chính xác
cao nhất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] http://www.zun.vn/tai-lieu/tieu-luan-phuong-phap-northern-blot-southern-blot-
western-blot-4843/
[2] http://vbs.ac.vn/bai-tong-quan/sac-ky-mien-dich-immunochromatography-n174/bai-
tong-quan/thu-nghiem-gan-ket-so-cap-n168/bai-tong-quan/ky-thuat-mien-dich-trong-
chan-doan-va-nghien-cuu-n163/
[3] http://vbs.ac.vn/bai-tong-quan/western-blotting-n172/
[4] http://vbs.ac.vn/bai-tong-quan/ky-thuat-elisa-n211/
[5] http://www.vbs.ac.vn/print.php?post=172
[6] http://www.slideshare.net/nguyenhang8966/western-blot1
[7] http://www.scbt.com/protocol_western_immuno_blotting.html
[8] http://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot
[9] http://www.piercenet.com/method/overview-western-
blotting#electrophoreticseparationofproteins
GVHD: ĐOÀN THỊ HOÀI NAM TRANG: 20
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 SVTH: TRẦN THỊ YẾN LỚP 10SH
[10]http://tai-lieu.com/tai-lieu/nghien-cuu-dac-trung-protein-cua-virus-gay-hoi-chung-do-
duoi-o-tom-su-penaeus-monodon-va-tom-the-chan-trang-penaeus-555/
[11] http://doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-tach-chiet-tinh-sach-va-tinh-chat-cua-protease-
tu-noi-tang-va-dau-tom-su-penaeus-monodon-10413/
Ghi chú: