BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI


NGUYỄN KIM OANH NGHIÊN C
ỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH
NUÔI C
ẤY BAO PHẤN LÚA
LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số: 60.42.02.01

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. PHAN HỮU TÔN


Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong bộ môn Sinh học
phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng ñã tận tình giúp ñỡ trong quá trình
thực tập.
ðặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo hướng
dẫn PGS.TS Phan Hữu Tôn - Trưởng Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ
sinh học ứng dụng - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ñã tận tình hướng
dẫn, chỉ bảo, giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài.
Qua ñây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn ñến Trung tâm Bảo tồn và Phát
triển nguồn gen cây trồng - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều
kiện và giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến gia ñình, người thân
và toàn thể bạn bè ñã ñộng viên và khích lệ ñể tôi trong suốt quá trình học tập
và hoàn thiện luận văn.
Xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, ngày 25 tháng 3 năm 2013
Học viên
Nguyễn Kim Oanh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii

MỤC LỤC

Lời cam ñoan i
Lời cảm ơn ii

3.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 24
3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 24
3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 24
3.2 ðịa ñiểm và thời gian tiến hành 24
3.2.1 ðịa ñiểm nghiên cứu 24
3.2.2 Thời gian tiến hành: 25
3.3 Nội dung nghiên cứu 25
3.4 Phương pháp nghiên cứu 25
3.4.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu 26
3.4.2 Cấy bao phấn ñể tạo callus 26
3.4.3 Tái sinh cây từ callus 27
3.4.4 Môi trường nuôi cấy 27
3.5 Bố trí thí nghiệm 27
3.5.1 Thí nghiệm 1 27
3.5.2 Thí nghiệm 2 27
3.5.3 Thí nghiệm 3 28
3.5.4 Thí nghiệm 4 29
3.5.5 Thí nghiệm 5 29
3.5.6 Thí nghiệm 6 30
3.5.7 Thí nghiệm7 30
3.5.8 Thí nghiệm 8 31
3.6 Phương pháp ñánh giá và xử lý số liệu 31
3.6.1 Phương pháp ñánh giá 31
3.6.2 Phương pháp xử lý số liệu 32
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
4.1 Giai ñoạn Tạo callus 33
4.1.1 Phản ứng của bao phấn trong quá trình nuôi cấy 33
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4D Acid 2,4 dichlorophenoxy axetic
Cs Cộng sự
CT Công thức
BAP 6- Benzylaminopurine
Kinetin 6- Furfurylaminopurine
MS Murashige and Skoog, 1962
N6 Chu & Cs, 1976
NAA Naphlene axetic acid
NCBP Nuôi cấy bao phấn
NXB Nhà xuất bản

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

4.1 Ảnh hưởng của kiểu gen ñến sự hình thành callus 35
4.2 ðộng thái hình thành callus sau 5 tuần theo dõi 38
4.3 Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến khả năng tạo callus 40
4.4 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khử trùng ñến tỷ lệ sống của các
dòng nghiên cứu 43
4.5 Ảnh hưởng của môi trường ñến khả năng tạo callus từ bao phấn lúa 46

4.1 Hình ảnh callus 34
4.2 Ảnh hưởng của kiểu gen ñến khả năng hình thành callus 37
4.3 Mối tương quan giữa tỷ lệ bao phấn chết và tỷ lệ bao phấn tạo callus 37
4.4a Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến khả năng tạo callus và tỷ
lệ chết của mẫu cấy dòng N39 41
4.4b Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến khả năng tạo callus và tỷ
lệ chết của mẫu cấy dòng N13
41
4.5a Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khử trùng ñến tỉ lệ sống và tỷ lệ
chết của mẫu cấy dòng N39 44
4.5b Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khử trùng ñến tỉ lệ sống và tỷ lệ
chết của mẫu cấy dòng N13
44
4.6 Ảnh hưởng của môi trường ñến khả năng tạo callus từ bao phấn
lúa 2 dòng N39 và N13 (sau 4 tuần theo dõi)
46
4.7a Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến tỷ lệ tạo thành callus và tỉ lệ
chết ở các công thức dòng N39
49
4.7b Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến tỷ lệ tạo thành callus và tỉ lệ
chết ở các công thức dòng N13
49
4.8 Ảnh callus chấm xanh 52
4.9 Ảnh tái sinh cây xanh 52
4.10 Ảnh rễ cây ăn lan vào môi trường thạch 52
4.11 Ảnh callus tái sinh một cây xanh và một cây bạch tạng 53
4.12 Ảnh rế ức chế chồi phát triển 53
4.13 Ảnh tái sinh cây bạch tạng 53
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


1. MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề
Cây lúa (Oryza sativa.L) là cây lương thực giữ vai trò rất quan trọng,
thuộc nhóm cây tự thụ phấn. ðể tạo ra một giống mới ñối với cây tự thụ phấn
thường người ta tiến hành lai hữu tính sau ñó cho các thế hệ ñời sau tự thụ.
Tuy nhiên, ñể tạo ñược dòng thuần ñồng hợp tử tất cả các gen theo cách này
thường phải mất từ 7 ñến 8 ñời. Nếu bố mẹ khác xa nhau về mặt di truyền thì
số ñời tự thụ cần thiết có thể phải dài hơn nhiều, khi cần tự thụ liên tục trên 10
thế hệ thậm chí vẫn còn phân ly. ðể rút ngắn thời gian tạo dòng thuần, hiện
nay người ta ñã tiến hành kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hoặc bào tử hạt phấn
thường là từ cây F1 và F2 ñể tạo ra cây ñơn bội, sau ñó lưỡng bội hoá bằng xử
lý Colchicine ñể tạo cây nhị bội, ñồng hợp tử về hầu hết các gen.
Như vậy, nuôi cấy bao phấn là một kỹ thuật hữu hiệu ñể tạo ra các
dòng ñồng hợp tử ngay từ thế hệ ñầu tiên (dòng ñơn bội kép), do ñó tiết kiệm
nguồn lực và rút ngắn thời gian cần thiết ñể tạo ra giống mới (Javed,
2007)[32].
Trên thế giới cũng như tại Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ñã
thành công ở nhiều ñối tượng cây trồng trong ñó có cây lúa.Tuy nhiên, hiệu
quả của quá trình nuôi cấy bao phấn lúa phụ thuộc nhiều yếu tố: kiểu gen của
cây ñưa vào nuôi cấy, yếu tố môi trường: nhiệt ñộ, ánh sáng, thành phần các
chất trong môi trường nuôi cấy và các kỹ thuật xử lý trước và sau khi nuôi cấy
bao phấn (Trần Duy Quý, 1999; Asoliman, 2007) [13] [23]. Trong nhiều năm
qua ñã có hàng loạt những nghiên cứu về vấn ñề này, tập trung vào hai hướng
chính là cải tạo về mặt di truyền phản ứng trong nuôi cấy bao phấn thông qua
chọn lọc, lai tạo (Herath, 2007) [31] và tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
(Bidhan, 2005; Chen, 2007) [24] [27]. Có nhiều nghiên cứu về nuôi cấy bao
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
2.1. Giới thiệu về phương pháp nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo giống
cây trồng
Nuôi cấy mô tế bào và bộ phận cơ quan thực vật trong môi trường dinh
dưỡng vô trùng nhằm tạo cây hoàn chỉnh là một hướng nghiên cứu cơ bản và
ứng dụng quan trọng trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng. Ý
tưởng này ñược ñề xuất vào năm 1838 – 1839 trong nội dung học thuyết tế
bào của Schleiden và Schwann. Tuy nhiên, vẫn chưa ñược ứng dụng cho ñến
ñầu thế kỷ 20 Haberlant – nhà sinh lý học thực vật người ðức nhấn mạnh tính
toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông thì mỗi tế bào của cơ thể sinh vật nào
cũng ñều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và ñầy ñủ của sinh
vật ñó. Vì vậy, khi gặp ñiều kiện thích hợp mỗi tế bào ñều có thể phát triển
thành cá thể hoàn chỉnh. ðiều này ñã thu hút nhiều nhà khoa học trên thế giới
quan tâm chú ý ñến hướng nghiên cứu này và họ ñã thu ñược nhiêù thành tựu
to lớn. [17]
Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy invitro bao phấn chứa các bào
tử hoặc các hạt phấn chưa chín trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo nhằm tạo
cây ñơn bội. Số lượng nhiễm sắc thể (NST) của cây ñơn bội ñược lưỡng bội
hoá lên bằng thủ thuật thích hợp tạo cây lưỡng bội ñồng hợp tử hoàn toàn gọi
là cây nhị bội hoá [17]. Nuôi cấy bao phấn thành công ñầu tiên vào năm 1950
do Morel người Pháp thực hiện thành công trên cây Khoả tử (cây một lá
mầm), trên môi trường có bổ sung nước dừa tạo thành mô sẹo. ðến năm 1964
hai nhà khoa học người Ấn ðộ là Guha và Maheshawari nuôi cấy thành công
cây cà ñộc dược (Datura innoxia) [9], hình thành phôi và từ phôi này cho cây
hoàn chỉnh. Thành công này ñã khởi ñầu cho nhiều nghiên cứu về nuôi cấy
hạt phấn của các lòai thực vật hạt kín khác.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 4



5

khác nhau. Kết quả của quá trình nuôi cấy ta nhận ñược cây ñơn bội hoặc cây
tự lưỡng bội hóa. Tỷ lệ cây ñơn bội nhận ñược phụ thuộc vào các yếu tố như:
giai ñoạn phát triển của hạt phấn và thời gian duy trì ở giai ñoạn mô sẹo (tuổi
mô sẹo). Kết quả nghiên cứu cho thấy các hạt phấn ở giai ñoạn mitos ñầu cho
tỷ lệ cây ñơn bội cao nhất. ðối với tuổi của mô sẹo thì mô sẹo càng sớm cấy
chuyển sang môi trường tái sinh cây và thời gian tái sinh cây ngắn thì tỷ lệ
cây ñơn bội càng cao.
ðể tạo những cây nhị bội từ mô hoặc cây ñơn bội, có 2 phương pháp
thường dùng là xử lý mô hoặc cây ñơn bội với colchicine. Các thể nhị bội thu
ñược ñều ở dạng ñồng hợp tử.
Nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn ñược sử dụng ñể tạo dòng thuần,
nghiên cứu thể hiện các gen lặn vì các gen lặn không thể hiện ở cơ thể dị hợp,
ở các cơ thể ñồng hợp tử mang gen lặn thì các gen lặn ñược biểu hiện. Ngoài
ra những cây ñơn bội nhận ñược từ NCBP và hạt phấn là những nguyên liệu
tốt cho chọn dòng tế bào.
Phương pháp nuôi cấy bao phấn ñã góp phần rút ngắn ñược nhiều thời
gian chọn tạo ra một giống mới, làm tăng hiệu quả chọn lọc bởi khả năng biểu
hiện sớm của các gen lặn [33]. Giúp khắc phục tính bất dục ở mức ñộ cao của
các dòng lai xa F1. Chính vì vậy phương pháp này ñang ñược áp dụng rộng
rãi trong chọn tạo giống lúa trên thế giới và ở Việt Nam.
Tuy nhiên, hiện nay NCBP vẫn còn tồn tại những hạn chế, số lượng cây
xanh ñạt ñược thông qua NCBP vẫn chưa ñáp ứng ñược nhu cầu cải thiện di
truyền. Một số yếu tố ảnh hưởng ñến NCBP ñã ñược nghiên cứu như kiểu gen
của mẫu cấy, tốc ñộ tăng trưởng, ñiều kiện của cây cho bao phấn, phương
pháp nuôi cấy (Woo & Chen, 1982) [41]. Mặc dù, các phương thức khác nhau
ñã ñược ñề xuất ñể cải tiến hiệu quả của NCBP nhưng cây xanh tái sinh tần số
vẫn còn rất thấp ñặc biệt là các giống lúa thơm và giống lúa cao sản.

2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trong công tác chọn giống, dòng ñồng hợp t ử ñóng vai trò quan trọng.
ðể tạo ñược dòng dồng hợp tử, các nhà chọn giống phải mất 8 – 10 thế hệ
mới tạo ra dòng ñồng hợp tử thông qua phương pháp tự thụ. ðể rút ngắn chu
kỳ chọn tạo người ta ñã sử dụng phương pháp nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ñể
nhanh chóng tạo ra dòng thuần và nhân nhanh các dòng phục vụ công tác
chọn tạo giống. Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn invitro kích thích tiểu bào tử phát
triển thành cây ñơn bội trong môi trường nuôi cấy bao phấn, hạt phấn sau ñó
lưỡng bội hóa bằng Colchicine sẽ tạo ra cây lưỡng bội ñồng hợp tử tất cả các
kiểu gen. ðây là công cụ hữu ích, cần thiết cho phát triển một giống mới, ñưa
nhanh vật liệu di truyền ra thực tiễn. Các tác giả người Pháp E.Toulé và
Y.Demarly (1998) cho rằng: bình quân con người tiết kiệm ñược 5 năm khi sử
dụng kỹ thuật ñơn bội vào việc tạo giống mới.
Cây lúa mỳ ñơn bội ñược phát hiện thấy ñầu tiên là con lai khác loài
Triticum conpactum và Aegilops Cylindrica (Aase, 1926) [17]. Kể từ ñó, hiện
tượng ñơn bội ñã ñược ghi nhận ở nhiều loài khác thuộc nhóm lúa mỳ:
T.monococcum (Kihara và Kytajma, 1993), T.urgidum (Nakajima, 1935),
T.Vulgare (Yamasaki, 1934) [17].
Năm 1964 Guha - Maheswari ñã tiến hành nuôi cấy bao phấn ở cà ñộc
dược (Datura inoxia) và công trình này ñã thu ñược những kết quả ñầu tiên.
Thành công này ñã khởi ñầu cho nhiều nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn, hạt
phấn các loài thực vật. Tiếp sau ñó Nisch, 1967 tạo thành công cây thuốc lá
ñơn bội từ NCBP thuốc lá (Nicotiana) [1].
Kỹ thuật NCBP lúa (Ozyza sativa) ñược Niizeki và Oono thực hiện
thành công ñầu tiên vào năm 1968. ðến nay kỹ thuật này ñược ứng dụng rộng
rãi ở nhiều nước: Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc…Các nhà khoa học IRRI,
Triều Tiên, Ấn ðộ ñều kết luận các giống lúa thuộc loài phụ Japonica tạo cây
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
NCBP lúa, hàng năm họ ñã tạo ra ñược trên 8000 dòng thuần ñơn bội kép từ
NCBP các cây F
1
(Chu & cs, 1985) [29].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 9

Ở Nhật những giống cây trồng mới cũng ñược tạo ra từ quá trình nuôi
cấy bao phấn (Li & cs, 1984) [34].
2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở nước ta, việc nghiên cứu NCBP ñã ñược tiến hành từ những năm
1976 nhưng việc ứng dụng vào thực tế chọn giống còn rất hạn chế do chưa
ñược quan tâm, ñầu tư.
Hiện nay, kỹ thuật NCBP lúa ñã, ñang ñược nghiên cứu ở nhiều cơ
quan nghiên cứu và bước ñầu ñã thu ñược những kết quả ñáng khích lệ.
NCBP ngày càng ñược sử dụng rộng rãi trong chọn tạo giống do chọn tạo
nhanh các dòng ñơn bội thuần, rút ngắn thời gian tạo ra một giống mới so với
phương pháp truyền thống.
Theo công bố của Viện Công nghệ Sinh học, ñã tạo ra ñược 23 dòng
ñồng hợp tử từ các giống lúa lai, trong ñó có 2 dòng A12 và A17 có nhiều ñặc
tính tốt. Hai dòng này ñã ñược ñưa vào trồng với diện tích lớn tại Hải Phòng
và Thái Bình vụ xuân năm 1990-1991 [6].
Viện Di truyền Nông nghiệp kết hợp NCBP với chọn dòng biến dị ñã tạo
ra 50 dòng bất dục ñực nhân mẫn cảm với nhiệt ñộ (TGMS) mới, và tạo ra 12
dòng thuần có ưu thế lai tương ñương con lai F
1
là DT 26, DT 29, J1, AC 24 (ðỗ
Năng Vịnh, 2002) [120]. Thử nghiệm môi trường NCBP của 14 giống lúa,

Kết hợp với chỉ thị phân tử với nuôi cấy mô bao phấn, các nhà khoa
học ñã quy tụ ñược nhiều gen quý vào một giống. Nguyễn Hoàng và cs ñã
quy tụ ñược 4 gen kháng bệnh bạc lá lúa là Xa4, Xa5, Xa13 và Xa 21 vào
dòng IRBB60-2 và nhiều dòng mang 2-3 gen kháng bạc lá lúa. Hitalmania và
cs ñã quy tụ ñược 3 gen kháng ñạo ôn chính là Pi1, Pi2-5 và Pita vào giống
kháng ñạo ôn bèn vững ở lúa tạo dòng mẹ TGMS ổn ñịnh và chống chịu cao
với ñiều kiện hiện nay [11].
Võ Minh Tuyển (2002) ñã sử dụng hai loại môi trường MS và N6 ñể nuôi
cấy bao phấn lúa của bao tổ hợp lai TH1 (TGMS-VN7/AC2), TH2 (TGMS-
VN7/BOB), TH3 (TGMS-VN7/253) tạo dòng TGMS mới có ñộ thuần cao và
xác ñịnh ñược ngưỡng nhiệt ñộ chuyển hóa của các dòng TGMS mới [18].
Lê Hùng Lĩnh và Hồ Hữu Nhị ñã chọn lọc ñược 3 dòng TGMS mới
là Bio MS2, Bio MS7, Bio MS10 là những dòng có ñộ bất dục cao (98,8%
ñến 100%) và có nhiều ñặc tính nông sinh học tốt khi nuôi cấy tổ hợp lai
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 11

F1 và một dòng vật liệu chứa gen TGMS bằng phương pháp nuôi cấy bao
phấn lúa [10].
Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã
nuôi cấy bao phấn một số dòng TGMS: Peiai 64S. ðây là dòng TGMS có
nguồn gốc từ Trung Quốc, có gen tương hợp rộng cho phép lai xa giữa các
loài phụ ñể tạo ưu thế lai cao. Do ñó, các dòng tái sinh cây từ nuôi cấy bao
phấn dòng Peiai 64S là nguồn vật liệu có giá trị trong việc chọn tạo các dòng
TGMS mới (Nguyễn Thị Lý Anh và cs, 2004) [2].
2.3. Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy bao phấn lúa
Thành công của nuôi cấy bao phấn chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố.
Một số yếu tố ảnh hưởng ñến NCBP ñã ñược nghiên cứu như: Kiểu gen của

Japonica, khi bổ sung thêm alanine vào môi trường thì khả năng tạo mô sẹo
tăng cao (trích theo Chen, 1991) [29]. Theo Heberle Bors (1985), Balachan -
dran & cs (1996) thì sự phản ứng của các giống lúa khác nhau có liên quan
ñến yếu tố tế bào chất (trích theo Võ Thị Minh Tuyển, 2002) [18], nhưng
Quimio và Zapata lại cho rằng: “Sự hình thành mô sẹo và tái sinh cây ñược
ñiều khiển bởi gen lặn mà không liên quan tới yếu tố tế bào chất” (trích theo
Nguyễn Thị Thanh Huyền, 2008) [8] [41].
Kiểu gen ñóng vai trò quyết ñịnh sự thành công hay thất bại trong nuôi
cấy bao phấn. Tạo cây ñơn bội hạn chế ở một số loài, ngoài trong cùng một
loài khả năng tạo cây ñơn bội là khác nhau. NCBP lúa các giống thuộc loài
phụ Japonica ñạt tỷ lệ thành công cao hơn nuôi cấy các giống thuộc loài phụ
Indica (trích theo Phan Hữu Tôn, 2005)[17]. Theo Yamaghishi và cộng sự
cũng nhận thấy các giống lúa thuộc loài phụ Indica và các dòng lúa lai giữa
Japonica/Indica nói chung cho khả năng NCBP thấp hơn các giống thuộc loài
phụ Japonica. Ông cũng phát hiện ra một vùng nhiễm sắc thể số 1 kiểm soát
sự hình thành mô sẹo và vùng nhiễm sắc thể số 10 kiểm soát tỷ lệ tái sinh cây
xanh và cây bạch tạng [17].
Như vậy kiểu gen của cây cho bao phấn là yếu tố quyết ñịnh hình thành
mô sẹo và tái sinh cây xanh từ NCBP lúa.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 13

2.3.2. Giai ñoạn phát triển của hạt phấn
Bản chất của NCBP là kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây ñơn
bội trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong ñiều kiện vô trùng. Vì vậy
giai ñoạn phát triển của hạt phấn tại thời ñiểm tách rời và nuôi cấy có ảnh
hưởng rất quan trọng ñến kết quả nuôi cấy (Phan Hữu Tôn, 2005) [17].
Kết quả nghiên cứu cho thấy các hạt phấn ở giai ñoạn mitos ñầu cho tỷ

2.3.3. ðiều kiện sinh lý của cây cho bao phấn
Hiệu suất tạo cây ñơn bội từ NCBP phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của
cây cho bao phấn. Hiệu suất này còn phụ thuộc vào mùa vụ khi cây ñược
trồng trong ñiều kiện tự nhiên [26]. Theo Chen và Lin (1976), Chen và Tsay
(1984) cho rằng bao phấn nào ñược lấy từ những bông trỗ sớm thì cho kết quả
nuôi cấy tốt hơn bao phấn ở bông trỗ muộn. Tỷ lệ tạo callus ở bao phấn lấy từ
nhánh cấp 3 thấp hơn bao phấn lấy ở nhánh mẹ, nhánh cấp 1, nhánh cấp 2. Lý
do bao phấn từ nhánh cấp 3 cho hiệu quả nuôi cấy kém hơn có thể là vì những
nhánh này thiếu dinh dưỡng, tuy nhiên không có sự sai khác rõ rệt giữa những
hoa ở các vị trí khác nhau trên bông (trích theo Phan Hữu Tôn, 2005) [17].
Theo Nguyễn Văn Uyển (1984), quang chu kỳ, cường ñộ ánh sáng và
nhiệt ñộ mà cây cho bao phấn sinh trưởng và phát triển cũng ảnh hưởng ñến
kết quả nuôi cấy [21] [29]. Có sự khác nhau giữa các cây trồng ở các tháng
khác nhau trong năm, theo Yeh và Tsay (1987) thì tỷ lệ % tạo callus của các
bao phấn lấy từ cây trỗ từ tháng 2 - tháng 4 biến ñộng từ 27% - 42%. Nếu bao
phấn lấy vào tháng 2 lúc nhiệt ñộ xuống 15
0
C sẽ không có khả năng tạo callus.
Biên ñộ ngày/ñêm khi cây trồng cho hạt phấn thấp 15
0
C/20
0
C có ảnh hưởng
nghiêm trọng hơn là nhiệt ñộ cao 30
0
C - 35
0
C, ñặc biệt ở giai ñoạn sinh
trưởng sinh thực, phân bào giảm nhiễm. Vì nhiệt ñộ thấp ñã ức chế việc hình
thành bào tử gây nên sự phân chia bất bình thường của lớp tế bào thành bao

kiện ñể hạt phấn phát triển theo hướng sinh dưỡng (trích theo Niizeki, 1999)
[37]. Theo Nitch (1974), thì nhiệt ñộ thấp ñã ñịnh hướng lại sợi tơ vô sắc
trong phân bào, kết quả tạo ra 2 tế bào (hai bào tử) có nhân cân bằng. Những
bào tử này có khả năng phát triển thành phôi cao hơn những tế bào có nhân
phát sinh và phát triển. Tuy nhiên Sunderland (1980), lại cho rằng xử lý lạnh
ñã làm chậm quá trình già hóa của bào tử. Gần ñây, người ta cho rằng xử lý
lạnh ñã làm ngừng tác ñộng của một số gen hoặc ức chế sản phẩm của gen
(Enzym chịu trách nhiệm phát triển bào tử). Do ñó, những bào tử ñã ñược xử
lý nhiệt ñộ sẽ ít bị phân hóa và dễ dàng phát triển bào tử thể có 2 nhân cân
bằng (trích theo Phan Hữu tôn, 2005) [17].