Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGUYỄN THỊ THU HUYỀN
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA
VI KHUẨN Staphylococcus aureus GÂY ĐỘC ĐƢỜNG
RUỘT NHÓM B TRONG THỊT LỢN BÁN TẠI THÁI
NGUYÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
cầu vàng (Staphylococcus aureus) là một trong những nguyên nhân chính gây
ngộ độc thực phẩm. Ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng có thể do ăn, uống phải
độc tố ruột của tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng.
Điều đáng chú ý ở đây là một số độc tố của chúng bền với nhiệt và khó bị
phân hủy ở nhiệt độ cao, một trong số đó là độc tố ruột staphylococcal
enterotoxin B (SEB). SEB cũng là tác nhân gây ra ngộ độc thực phẩm thường
gặp nhất ở S. aureus. Hơn nữa chúng lại có khả năng kháng methiciline,
penicillin, khi gặp điều kiện thuận lợi còn có thể lây lan và gây những căn
bệnh nguy hiểm. Hiện nay, chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu cho nhiễm
độc các độc tố nhóm này, phương pháp phòng ngừa đặc hiệu cũng không có,
việc phòng bệnh và điều trị bệnh ngộ độc do tụ cầu gặp rất nhiều khó khăn vì
không phát hiện kịp thời tác nhân gây bệnh. Vì vậy, việc xác định sự có mặt
SEB trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm đóng vai trò hết sức quan trọng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
Mặt khác, việc giết mổ và bán thịt lợn chủ yếu do tư nhân thực hiện,
phương tiện vận chuyển, dụng cụ bán thịt chưa đạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y.
Việc kiểm tra vệ sinh thú y của cán bộ kiểm dịch còn gặp nhiều khó khăn hiện
chỉ dừng lại ở mức độ kiểm tra cảm quan thịt được bán tại chợ.
Xuất phát từ lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên
cứu tỷ lệ nhiễm và một số đặc tính của vi khuẩn Staphylococcus aureus gây
độc tố đường ruột nhóm B trong thịt lợn ở Thái Nguyên.”
2.Mục tiêu nghiên cứu:
Xác định tỉ lệ nhiễm và đặc tính của độc tố nhóm B ở vi khuẩn
Staphylococcus aureus trên thịt lợn, từ đó làm cơ sở để các nhà dịch tễ học có
những biện pháp nhằm khắc phục tình trạng ngộ độc thực phẩm.
3. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát tình hình giết mổ và xác định tỉ lệ nhiễm Staphylococcus
aureus
nước có nền khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu kém phát
triển [31]. Hiện nay, loài người đang phải đối mặt với nguy cơ nhiễm hơn 200
bệnh truyền nhiễm thông qua thực phẩm. Các triệu chứng lâm sàng khá đa
dạng, từ mức viêm dạ dày, ruột nhẹ cho tới nhiễm trùng, nhiễm độc nặng với
nguy cơ tử vong cao, hoặc dẫn tới các biến chứng phức tạp, ảnh hưởng tới đời
sống của bệnh nhân. Hậu quả và thiệt hại kinh tế do các bệnh lây truyền qua
thực phẩm rất lớn và có xu hướng ngày càng tăng. Ví dụ, mỗi năm ở Hoa Kỳ
có khoảng 76 triệu ca mắc bệnh các loại do thực phẩm ô nhiễm, 325 nghìn ca
nhập viện và 5 nghìn ca tử vong [23]. Các chi phí điều trị cho các bệnh nhân
khoảng 6,5 tỷ đô la, thiệt hại do nghỉ điều trị khoảng 34,9 tỷ đô la/năm.
Các loại mầm bệnh gây nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm:
Người tiêu dùng có thể mắc bệnh khi sử dụng thực phẩm bị ô nhiễm
các mầm bệnh vi sinh vật, độc tố của vi sinh vật hoặc một số kim loại độc.
Trong số hơn 200 bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm có khoảng 40 mầm bệnh
vi sinh vật đã được xác định vai trò gây bệnh [15]. Các mầm bệnh vi sinh vật
bao gồm vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và virus, trong đó các loại vi khuẩn gây
ra tới 90% số ca bệnh tử vong ở người.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5
Thế giới đang trong kỷ nguyên toàn cầu hóa, việc sản xuất và phân
phối một sản phẩm thực phẩm không bị bó hẹp trong không gian địa lý dẫn
đến khả năng lan tràn khắp thế giới các bệnh do thực phẩm ô nhiễm. Đồng
thời, trong quá trình công nghiệp hóa, thực phẩm được sản xuất hàng loạt đã
làm khả năng nhiều người tiêu dùng mắc bệnh tăng cao. Số ca mắc các bệnh
do thực phẩm ô nhiễm tăng đáng kể trong vòng 10 năm trở lại đây [23]
Mặc dù y học hiện nay đã khá phát triển, song các tác nhân gây bệnh
trực tiếp từ thực phẩm vẫn còn chưa được phát hiện đầy đủ. Tại Hoa Kỳ, chỉ
có 14/76 triệu ca mắc, 60/325 nghìn ca nhập viện và 1,8/5 nghìn ca tử vong
do nhiễm trùng độc thực phẩm là chẩn đoán được chính xác nguyên nhân
phẩm từ sữa (đặc biệt là pho-mát) (32%), thịt (22%), xúc xích (15%), cá và
hải sản (11%), trứng và các sản phẩm từ trứng (11%) hoặc các sản phẩm khác
từ gia cầm (9,5%) [19]. Tại Hoa Kỳ, trong số các trường hợp ngộ độc thực
phẩm do S. aureus được báo cáo giữa các năm 1975 và 1982 thì 36% là do
tiêu thụ thịt đỏ nhiễm khuẩn, 12,3% từ sa lát, 11,3% từ gia cầm, từ bánh ngọt:
5,1% đến 1,4%, còn lại là từ các sản phẩm liên quan tới sữa và hải sản [33]. Ở
châu Á các vụ nhiễm S. aureus chủ yếu ở các nước Nhật Bản, Trung Quốc và
trong khu vực Đông Nam Á.
Ở Trung Quốc trong năm 2008 đã xảy ra 1 vụ ngộ độc S. aureus ở trẻ
em vì uống sữa bị nhiễm S. aureus. Còn ở Nhật cũng đã có 2 vụ ngộ độc
S. aureus lớn vào tháng 8 năm 1955 làm ngộ độc hơn 1936 em học sinh tại 5
trường tiểu học ở Tokyo và tháng 6 năm 2006 làm 14780 người bị ngộ độc ở
vùng Kansai. Nguyên nhân của 2 vụ ngộ độc này đều do họ đã uống sữa có
nhiễm S. aureus của tập đoàn Snow.
Trong khu vực Đông Nam Á, hai quốc gia có tỷ lệ ngộ độc S. aureus
cao là Indonesia và Philippines. Việt Nam cũng là một trong những nước có
tỷ lệ nhiễm S. aureus cao ở trong khu vực châu Á. Như vậy, giữa các nước
khác nhau loại thực phẩm dễ nhiễm tụ cầu nhất cũng khác nhau.
Tại Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của chúng rất đa
dạng, thường gặp nhất là các thực phẩm đường phố ăn ngay (46,6%), xúc xích
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7
(96,6%), bánh gato (85%), Patê (83,3%) v.v. Đáng chú ý là vi khuẩn S.
aureus thường được tìm thấy trong các thực phẩm bị nhiễm khuẩn [7].
Tình trạng ngộ độc thực phẩm không chỉ diễn ra ở các thành phố lớn
mà tình trạng nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm còn diễn ra phổ
biến ở nhiều địa phương khác trên cả nước [30]. Tuy nhiên, cho tới nay tại
Việt Nam thực tế chưa có những thống kê cụ thể về số ca mắc hay tử vong do
ngộ độc thực phẩm liên quan đến SEB. Có nhiều nguyên nhân gây khó khăn
Địa điểm
Thời
gian
Số ngƣời
mắc
bệnh
Đặc điểm bệnh
nhân
1
Mầm non bán công Vĩnh
Thọ - Phú Thọ
9/2007
100
Học sinh
2
Mầm non Vườn Hồng, P9
– Tân Bình; Tiểu học Âu
Cơ, Q11 – TP HCM
12/2007
65
Trẻ em (từ 2-5
tuổi)
3
Minh Long – Quảng Ngãi
2/2008
53
Người dân
4
Hà Nội
5/2008
4/2012
300
Khách dự đám
cưới
Việc tìm ra phương pháp phát hiện sớm S. aureus và độc tố SEB của nó
gây nhiễm trùng, nhiễm độc trực tiếp trên thực phẩm mang ý nghĩa quan trọng
và cấp thiết, nhằm loại bỏ và có biện pháp xử lý sớm đối với các thực phẩm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9
đang nhiễm độc nhiễm trùng. Nhưng trước hết chúng ta cần phải tìm hiểu về
đặc tính sinh hoá và nghiên cứu ở mức độ phân tử làm nền tảng. Chính vì vậy,
việc tiến hành đề tài này sẽ là một nhu cầu thực tiễn và cấp bách.
1.2. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
1.2.1. Lịch sử phát hiện
Staphylococcus aureus do Robert Koch phát hiện năm 1878 sau khi
thực hiện phân lập từ mủ ung nhọt.
Năm 1880 Louis Paster cũng đã tiến hành phân lập và nghiên cứu về
Staphylococcus aureus.
Ngày 09/04/1880 bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày
tại hội nghị lần thứ 9 hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học, trong đó ông
sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) và trình bày tương đối đầy
đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ lâm sàng.
Đến năm 1881 Ogston đã thành công trong việc gây bệnh thực nghiệm,
đây là tiền đề cho những nghiên cứu về S. aureus sau này.
Đến năm 1884 Rosenbach đã thực hiện một loạt các nghiên cứu tỉ mỉ
hơn về vi khuẩn này. Và ông đã đặt tên cho vi khuẩn này là Staphylococcus
aureus.
Năm 1926 Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối
Hình 1.1. Hình ảnh vi khuẩn S. aureus dưới kính hiển vi điện tử.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11
Ngoài ra, cầu khuẩn S. aureus không có khả năng tạo bào tử như các vi
khuẩn Chlamydomonas perfringens, Chlamydomonas botulinum, và Bacillus
cereus cũng thường được tìm thấy trong các thực phẩm nhiễm khuẩn [33].
1.2.3.2. Tính chất nuôi cấy
Tụ cầu S. aureus sống hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện, dễ mọc trên các
môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp 30-37
o
C, pH 7,2-7,6
[2].
- Môi trường nước thịt: Sau 5-6h nuôi cấy ở điều kiện 37
o
C vi khuẩn
phát triển làm đục môi trường, sau 24h độ đục tăng, lắng cặn nhiều, không tạo
màng trên mặt môi trường.
- Môi trường thạch thường: Sau 24h nuôi cấy ở điều kiện 37
o
C, vi
khuẩn hình thành những khuẩn lạc dạng S, màu trắng, vàng thẫm hoặc vàng
Hình 1.2. Các độc tố quyết định của S. aureus
Độc tố ruột được sản xuất bởi phần lớn các chủng tụ cầu vàng, nhưng
không phải là tất cả mọi chủng. Các độc tố này là những protein tương đối
bền với nhiệt, nên không bị phá hủy bởi sự đun nấu, có trọng lượng phân tử từ
28000-30000 Dalton và bao gồm 6 loại (type) được ký hiệu từ A tới E [5].
Ono và cs (2008), đã phát hiện ra 2 loại độc tố mới là SES và SET cũng nằm
trong nhóm những độc tố ruột do S. aureus tạo ra [25]. Về miễn dịch, các loại
này được phân biệt khá rõ ràng, mặc dù giữa chúng có những kháng nguyên
chéo. Về cơ chế gây bệnh, độc tố ruột kích thích miễn dịch ở cơ thể vật chủ
tạo ra một lượng lớn interleukin I và II. Các enterotoxin có thể được xác định
bằng các kỹ thuật miễn dịch [3]. Trong các dạng độc tố ruột do S. aureus sinh
ra thì các độc tố SEA, B, C và D là những độc tố thường gặp nhất trong các
vụ ngộ độc thực phẩm do độc tố của tụ cầu. Ngoài ra SEB còn là một trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
những nhóm độc tố do vi sinh vật sản sinh ra được liệt kê trong danh mục vũ
khí sinh học dùng để tấn công khủng bố sinh học và chiến tranh sinh học [18].
- Cơ chế gây bệnh
Việc tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây
bệnh có ý nghĩa quan trọng trong quá trình phòng chống bệnh. Bước quan
(trung bình 2-3 giờ). Bệnh nhân ngộ độc thức ăn do tụ cầu xuất hiện các triệu
chứng nôn ói, đau quặn bụng và tiêu chảy dữ dội, càng về sau phân và chất
nôn chủ yếu là nước. Triệu chứng tiêu chảy do tụ cầu cũng không kèm theo
máu và ít mất nước hơn so với tả và E. coli. Bệnh nhân không sốt hay phát
ban, đây là đặc điểm để phân biệt giữa ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng với
các nhóm vi khuẩn khác; thần kinh người bệnh bình thường. Phần lớn trường
hợp bệnh tự khỏi và hồi phục trong vòng 8-24 giờ sau khởi phát nhưng trường
hợp nặng có thể bị tụt huyết áp và gây tử vong. Bệnh nhân ngoài ra có thể bị
sốc do mất nhiều nước và chất điện giải. Khác với ngộ độc thực phẩm do vi
khuẩn thông thường không gây sốt hoặc sốt nhẹ, bệnh nhân mắc ngộ độc do
độc tố SEB của S. aureus sẽ bị sốt cao [4].
1.2.4. Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
Hiện nay người ta đã thành công trong giải trình tự gen của các chủng
tụ cầu vàng được kí hiệu: Newman, COL, UMRSA 252, MW2, MSSA476,
N315, Mu50, RF122 .v.v. [11],[17], [20],[ 12], [22]. Ví dụ: Steven và cs đã
thành công trong việc giải trình tự bộ gen dài 2809422 bp của chủng S. aureus
COL. Kết quả giải trình tự đã được đăng ký trên Genbank với mã số:
CP000046.1 cho hệ gen nhân và CP000045 cho hệ gen plasmid. Theo đó,
trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ít các cặp G - C, điều này gây ra mối
quan ngại về sự chuyển gen từ các chủng tụ cầu vàng tới các tác nhân gây
bệnh Gram dương khác [29].
Trong số các chủng S. aureus phân lập từ các mẫu thực phẩm, tỷ lệ
giống enterotoxigenic được ước tính khoảng 25% [13]. Tại Pháp, trong số 61
chủng phân lập từ pho-mát và sữa tươi có 15,9% chủng là giống
enterotoxigenic. Ở Pháp, trong 332 chủng S. aureus được phân lập từ nhiều
loại thức ăn có 57% chủng chứa các gen SEG,SEB, SEI và SEJ xuất hiện với
tần số cao hơn hẳn chủng chứa gen SEA và SEE, trước đây vốn được xem là
chiếm ưu thế [4, 27].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
đồng cao với trình tự amino acid độc tố ruột C1 cũng có 239 amino acid [16].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
16
SEB chỉ thiếu các vị trí bám của kẽm so với các siêu kháng nguyên
staphylococcal enterotoxin A, C2 và D chỉ có một vị trí bám trên phân tử
MHC nhóm II. Phân tích chi tiết vị trí bám trên TCR của các kháng nguyên
SEA, SEB và SEC sẽ chỉ ra sự khác biệt dẫn tới hiệu quả bám lên vùng Vβ
[14].
Năm 1986, Christopher và cs đã xác định thành công trình tự gen SEB
của chủng vi khuẩn S. aureus S6. Theo đó, trình tự của 1 gen SEB hoàn thiện
được tính từ codon mở đầu ATG ở vị trí nucleotide 244, sau đó là vùng khung
đọc mở gồm 798 nucleotide, và kết thúc tại codon TGA tại vị trí nucleotide
thứ 1042 [16]. Đoạn gen SEB phân lập ở các chủng từ những vùng địa lý khác
nhau đã được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu chi tiết. Trình tự gen SEB
của các chủng khác nhau như PM36 (AB479118, ATCC14458, AY518386),
COL (CP000046, AF410775) .v.v đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu
gen (NCBI) [24], [17], [32].
1.3.2. Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B
Staphylococcal enterotoxin B (SEB) là trung gian kích thích các
lympho T ở hệ miễn dịch của các vật chủ. Các độc tố liên kết trực tiếp đến
phức hợp protein (MHC) lớp II trên bề mặt tế bào đích, sau đó kích thích gia
tăng số lượng lớn các lympho T. SEB được coi là một "siêu kháng nguyên”
của vi khuẩn vì có thể tạo thành một “cầu nối” giữa MHC lớp II của các tế
bào trình diện kháng nguyên và vùng Vβ của các thụ thể tế bào T như CD 4,
CD 8; từ đó, kích thích hoạt hóa các tế bào T biểu hiện các đoạn gen Vβ mà
không cần thiết phải có một quá trình chế biến và trình diện thông thường.
Điều này gây ra sự sản sinh một số lượng lớn của cytokine, interleukin 2 (IL-
2), các yếu tố hoại tử khối u β (TNF-β), và các interferon. Nếu ăn thực phẩm
có SEB bệnh nhân có các triệu chứng như chán ăn, buồn nôn, nôn, và tiêu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Các chủng Staphylococcus aureus gây ngộ độc thực phẩm có trong thịt lợn
tươi.
2.2 Vật liệu nghiên cứu
- Các mẫu thịt lợn tươi lấy tại các chợ trung tâm thành phố Thái Nguyên
- Môi trường được sử dụng là những môi trường chế biến sẵn ở dạng tổng
hợp, khi dùng pha theo công thức hướng dẫn.
+ Môi trường thạch Chapman: Dùng để phân lập vi khuẩn S. aureus
+ Môi trường thạch máu: dùng để thử khả năng dung huyết của vi
khuẩn S. aureus
+ Huyết tương thỏ để thử phản ứng coagulase của vi khuẩn S. aureus.
+ Chuột bạch khỏe khối lượng tỷ lệ 18 – 20 g/con
+ Nước muối sinh lý 0,9 %: Dùng để pha loãng mẫu.
- Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: tủ lạnh, nồi hấp ướt, tủ ấm, buồng cấy
vô trùng, pipetman, ống durham, bình tam giác các loại, đĩa petri, cân, que
cấy, bông cồn, giá đựng, ống nghiệm đựng mẫu, túi nilon, cối, chày sứ và
các dụng cụ thí nghiệm khác.
- Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di
Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-
Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy
Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn quốc tế (ISO).
2.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu xét nghiệm.
Chúng tôi sử dụng phương pháp lấy mẫu được tiêu chuẩn hoá theo TCVN
[9]
- Thu thập mẫu thịt theo phương pháp ngẫu nhiên từ các quầy bán thịt ở
các chợ trong Thành phố Thái Nguyên.
- Với mẫu thịt: Lau dao bằng cồn 70
0
, sau đó dùng dao cắt lấy 100-
200gram thịt/mẫu; cho mẫu vào túi nilon vô trùng và ghi nhãn có các thông
tin cần thiết
2.4.2. Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu vi khuẩn S. aureus trong 1gam thịt
lợn tƣơi trên thạch Chapman .
Theo TCVN [10].
- Đồng nhất và pha loãng mẫu: Cân 1g thịt tươi (không lấy mỡ) nghiền
nát trong cối sứ, nghiền tiếp bằng máy xay thịt, cho vào bình tam giác bổ sung
9ml dung dịch nước muối sinh lí, được độ pha loãng 10
-1
. Ly tâm
3000vòng/phút trong 30 phút, tiếp tục pha loãng đến đậm độ không còn khả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
20
năng dương tính(10
-6
, 10
-7
).
- Cấy dàn trên thạch Chapman, mỗi độ pha loãng cấy trên 2 đĩa thạch
khác nhau, bồi dưỡng 37
C trong
24h trên môi trường Chapman cho vào ống môi trường BHI đã chế, đem môi
trường nuôi cấy trong tủ ấm 37
0
C trong 24h.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
21
Sau đó tiến hành tiêm phúc mạc chuột bạch với liều lượng 0,5ml canh
trùng/con. Theo dõi 7 ngày sau khi tiêm. Khi chuột chết, tiến hành mổ khám
bệnh tích và phân lập vi khuẩn và nuôi cấy lại trên môi trường Chapman.
Đối với chuột bạch đối chứng: Tiêm phúc mạc với liều lượng
0,5ml/con dung dịch BHI nguyên chất. Theo dõi 7 ngày nếu chuột chết, tiến
hành mổ và khám bệnh tích và nuôi cấy lại trên môi trường Chapman.
2.4.4. Phƣơng pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và
hóa dƣợc của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus .
* Nguyên lý chung
Các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ có độ mẫn cảm khác nhau đối với
kháng sinh trị liệu, biểu hiện ở sự khác nhau về đường kính (ф) vòng vô
khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh trên môi trường nuôi cấy.
* Mục đích
Tìm hiểu tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh sẽ giúp ích
rất nhiều cho phương hướng điều trị, lựa chọn kháng sinh đặc hiệu, góp phần
đánh giá thực trạng tính kháng thuốc của vi khuẩn.
* Tiến hành:
- Chuẩn bị môi trường: Sử dụng đĩa petri ф = 9cm, đáy bằng, thạch
Muller Hinton, 25ml/đĩa để nuôi cấy vi khuẩn kiểm tra.
- Dịch nuôi cấy vi khuẩn pha loãng bằng PBS, đậm độ ≈ 10
8
vi
- Bổ sung 5 μl protease K vào mỗi mẫu, đem lắc ở 37
o
C trong 90 phút
- Bổ sung 60 μl SDS 20%, ủ ở 65
o
C trong 120 phút, có đảo trộn.
- Bổ sung 600 μl CI (Chloroform isoamylalcohol), spin down, ly tâm
12000v/p trong 15 phút ở 4
o
C, sau đó thu pha trên ra ống eppendorf mới.
- Lặp lại bước trên
- Kết tủa DNA bằng 350 μl Isopropanol ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ.
- Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 4
o
C, thu tủa.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
23
- Rửa tủa bằng 500 μl Ethanol 70%, ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở
4
o
C, thu cặn.
- Để khô tự nhiên, sau đó bổ sung 25 μl nước khử ion.
2.4.6. Phƣơng pháp PCR
Nguyên lý:
Kỹ thuật tổng hợp DNA nhân tạo cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ
bản của sao chép DNA trong tế bào vi sinh vật như: Đoạn DNA cần được mở
xoắn thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi xuôi, ngược, cần nguyên liệu và
điều kiện môi trường thích hợp và DNA polymerase. Tuy nhiên kỹ thuật PCR
có khác là dùng nhiệt độ cao (95
0,25
DNA
2
Tổng thể tích
25
Phản ứng PCR được thực hiện với chu trình nhiệt như sau: Hình 2.1. Chu trình phản ứng PCR
2.4.7. Phƣơng pháp tinh sạch DNA từ gel agarose
Nguyên lý:
Phương pháp này được áp dụng để tinh sạch đoạn DNA quan tâm từ
bản điện di trên gel agarose. Trong phương pháp này phân tử DNA quan tâm
sẽ được giữ lại trên cột tinh sạch có bản chất là các hạt sepharose, sau đó sử
dụng đệm để thu lại các phân tử DNA này. Thông qua phương pháp này mẫu
DNA sẽ đủ tinh sạch để tiến hành các phản ứng khác
Tiến hành:
- Cắt vùng gel chứa đoạn DNA quan tâm trên bản điện di.
95
o
C
95
o
= 1: 3.
- Ủ hỗn hợp ở 60
o
C trong 10 phút và cứ 2 phút thì đảo nhẹ 1 lần cho
đến khi gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết DNA và ly tâm 13000 v/p
trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Tiếp tục bổ sung đệm rửa 500µl WB (Washing Buffer), ly tâm 13000
v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm thêm 1 lần nữa trong
vòng 1 phút để loại đệm WB.
- Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5ml. Bổ sung 25 µl nước khử ion khử
trùng, để ở nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm 13000 v/p trong 1 phút để thu
DNA.
2.4.8. Phƣơng pháp đọc trình tự DNA trên máy đọc tự động và phân tích
kết quả bằng phần mềm chuyên dụng.
Trình tự nucleotid của gen SEB được xác định bằng phương pháp xác
định trình tự gen tự động trên máy ABI PRISM
R
3100 Avant Genetic
Analyzer. Tại phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về Công nghệ gen - Viện
Công nghệ Sinh học.
+Phân tích kết quả:
- Kiểm tra kết quả thu được bằng phần mềm máy tính BioEdit 7.0.
- Khai thác dữ liệu từ genbank để so sánh.
- Xử lý và phân tích các trình tự đoạn gen seb có kích thước khoảng 336
bp của vi khuẩn S. arerus bằng chương trình phân tích chuỗi BioEdit.
2.4.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Copyright: Tài liệu đại học ©