i
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGUYỄN TH HIỀN NGHIÊN CƢ́ U TĂNG CƢỜ NG KHẢ NĂNG CHỊ U MẶ N
BẰ NG CHUYỂ N GEN CODA TRÊN MÔ HÌ NH CÂY XOAN TA
(MELIA AZEDARACH L.)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01

ii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


iii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜ I CẢ M ƠN
Để hoà n thnh luậ n văn ny, tôi xin trân trọ ng cả m ơn PGS. TS. Chu Hoà ng Hà –
Ph Vin trƣởng Vin Công ngh Sinh hc, Trƣở ng phò ng Công nghệ tế bà o thƣ̣ c vậ t –
Việ n Công nghệ Sinh họ c – Việ n Khoa hc và Công ngh Vit Nam. Đ tận tnh hƣng
dẫ n, ch bảo v gip đ tôi trong suố t quá trình thực hin và hon chnh luận văn.
Qua đây, tôi cũ ng xin bà y tỏ lò ng biế t ơn sâu sắ c tớ i tậ p thể cá n bộ phò ng
Công nghệ Tế bà o thƣ̣ c vậ t – Việ n công nghệ sinh họ c , đ nhit tnh gip đ, góp ý
v đng viên tôi trong thời gian thực tập tại phòng.
Tôi cũ ng xin đƣợ c trân trọ ng cả m ơn Ths Bù i Văn Thắ ng -Trƣờ ng Đạ i họ c
Lâm nghiệ p đ c nhiều đng gp gip tôi hoà n thà nh luậ n văn nà y.
Tôi xin cả m ơn sƣ̣ giú p đỡ và tạ o điề u kiệ n vô cù ng quý bá u củ a Ban Giá m
hiệ u, cc thy cc cô trong khoa Khoa hc Sự sng , phòng Sau đạ i họ c Trƣờ ng Đạ i
hc khoa hc – Đạ i họ c Thá i Nguyên để tôi có thể hoà n thà nh tố t khó a họ c.
Cuố i cù ng tôi xin by tỏ lòng biết ơn đến nhƣ̃ ng ngƣờ i thân trong gia đì nh và
bạn b , đồ ng nghiệ p đã tạ o điề u kiệ n , quan tâm, gip đ, chia sẻ, đng viên và
khch l tôi trong sut qu trnh hc tập , thƣ̣ c hiệ n nghiên cƣ́ u đề tà i và thƣ̣ c hiệ n
thnh công luận văn ny.
Tc giả luận văn
Nguyễ n Thị Hiề n

2.1.3. Môi trƣờ ng nuôi cấy 21
2.1.4. Thiết b - Máy móc 22
2.2. Phƣơng php nghiên cƣ́ u 22
2.2.1. Thiết kế cu trc vector chuyn gen pBI121 mang gen codA 22
2.2.2. Tạo chủng vi khun Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyể n gen 29
2.2.3. Tạo cây Xoan ta chuyn gen mang gen codA 30
Chƣơng 3 KẾT QUẢ V THẢO LUẬN 34
3.1. Kết quả nhân dòng gen codA từ vector tch dòng pBluesript II SK - codA 34

v
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.2. Kết quả thiết kế cu trc vector v tạo chủng vi khun mang vector chuyn gen 35
3.2.1. Kết quả thiết kế cu trc vector chuyn gen pBI121- codA 35
3.2.2. Kết quả biến nạp vector ti tổ hp (pBI121-codA) vào E. coli DH5α 36
3.2.3. Kết quả sng lc dòng vi khun E. coli DH5α mang vector ti tổ hp 37
3.2.4. Kết quả biến nạp vector chuyn gen (pBI121-codA) vào A. tumefaciens 39
3.2.5. Kết quả sng lc dòng A. tumefaciens mang vector chuyn gen 40
3.3. Kết quả tạo dòng Xoan ta mang cu trc gen codA 42
3.3.1. Kết quả chuyn gen v ti sinh chồi Xoan ta chuyn gen 42
3.3.2. Kết quả tạo cây chuyn gen hon chnh (ra rễ) 45
3.3.3. Kế t quả ra cây v kim tra cây chuyn gen ngoi nh lƣi 46
3.3.4. Kế t quả đá nh giá sơ b cc dòng Xoan ta chuyể n gen trên môi trƣờ ng mui . 47
KẾT LUẬN V KIẾN NGHỊ 51
TI LIU THAM KHẢO 52
PH LC 57 vi

Luria – Bertani
Murashige and Skoog
OD
PCR
Mật đ quang hc (Optical density)
Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase
SDS
T-DNA
TAE
Ti-Plasmid
TE
WT
Sodium doecyl sulphate
Transfer – DNA = DNA chuyn
Tris base – Acetic acid – EDTA
Tumor inducing plasmid = Plasmid gây khi u thực vật
Tris-EDTA
Cây không chuyn gen

vii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤ C BẢ NG

Hình 3.1. Hnh ảnh đin di sản phm PCR nhân gen codA từ vector tách dòng 35
Hình 3.2. Hnh ảnh đin di sản phm tinh sạch gen codA từ sản phm PCR 35
Hnh 3.3. Hnh ảnh đin di gen codA và vector pBI121-gus cắt bằng cp enzyme gii
hạn XbaI và SacI 36
Hnh 3.4. Hnh ảnh đin di sản phm thôi gel gen codA v vector pBI12 mở vòng 36
Hnh 3.5. Hnh ảnh khun lạc vi khun E. coli DH5α đƣc biến nạp plasmid tá i tổ hợ p
mc trên môi trƣờng LB bổ sung 50 mg/l kanamycin 37
Hnh 3.6. Hnh ảnh plasmid ti tổ hp tch từ vi khun E. coli 38
Hnh 3.7. Hnh ảnh đin di sản phm PCR nhân gen codA từ plasmid ti tổ hp. 39
Hnh 3.8. Hnh ảnh đin di plasmid ti tổ hp pBI121-codA cắt bằng XbaI và I. 39
Hnh 3.9. Khun lạc Agrobacterium tumefacies EHA101 biến nạp vector pBI121-codA
mc trên môi trƣờng LB bổ sung 50 mg/l kanaSacmycin, 50 mg/l rifamycin 40
Hình 3.10. Hnh ảnh đin di plasmid ti tổ hp (pBI121- codA) tch chiết từ A. tumefaciens . 41
Hình 3.11. Hnh ảnh đin di sản phm PCR nhân codA từ plasmid ti tổ hp tch từ A.
tumefaciens. 41
Hnh 3.12. Mẫ u Xoan ta lây nhiễ m trong dịch huyề n phù A. tumefacien 43
Hnh 3.13. Mẫ u Xoan ta trên môi trƣờng đồng nuôi cy CCM 43
Hnh 3.14. Mảnh l chuyn gen trên môi trƣờng SM sau 1 tun nuôi cy 43
Hnh 3.15. Đoạ n thân chuyn gen trên môi trƣờng SM sau 1 tun nuôi 43
Hnh 3.16. Chồi ti sinh từ đoạn thân chuyn gen trên môi trƣờng SM ln 1 sau 2 tun
nuôi cy 43
Hnh 3.17. Chồi ti sinh từ đoạn thân chuyn gen trên môi trƣờng SM ln 1 sau 3 tun
nuôi cy 43

ix
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hnh 3.18. Chồi ti sinh từ mảnh l chuyn gen trên môi trƣờng SM ln 1 sau 4 tun
nuôi cy 44

loi cây đƣc s dng nhƣ l mt loại cây mô hình cho các nghiên cứu trên thế gii
l cây dƣơng (Populus sp.). Tuy nhiên, hạn chế duy nht của loi cây ny đ l kh
sinh trƣởng trong điều kin khí hậu của Vit Nam. Vì vậy, vic tìm kiếm mt loài
cây dễ thích ứng và phổ biến đ làm cây mô hình cho các nghiên cứu theo hƣng
quan tâm trên đi tƣng cây lâm nghip trở nên cn thiết. Cây Xoan ta đƣc đnh
giá là mt trong những cây trồng quan trng trong chiến lƣc phát trin lâm nghip
ở nƣc ta. Hơn nữa, những kết quả nghiên cứu bƣc đu trong vic xây dựng
phƣơng php chuyn gen ở đi tƣng cây xoan ta là rt có trin vng [3], [4], [8],
[9], [23], [36], [37], cho phép các nhà khoa hc có th tiến hành các nghiên cứu cải
thin ging, đc bit là nâng cao tính chng chu của loài cây này và có th s dng
nhƣ mt mô hình cho các loài cây lâm nghip đc hữu của Vit Nam.
Những tc đng bt li từ môi trƣờng nhƣ: hạn hán, ngập mn, ngập úng,
nhit đ cực đoan đ tc đng mạnh mẽ đến sự sinh trƣởng và phát trin của các
loài cây trồng. Cũng nhƣ cc loài sinh vật khác, khi gp cc điều kin bt li từ môi
trƣờng, thực vật có khả năng sinh ra cc cơ chế thch nghi khc nhau đ có th tồn
tại, sinh trƣởng và phát trin bnh thƣờng. Cơ chế thƣờng gp nht khi cây gp các
điều kin bt li về nƣc đ l tăng cƣờng khả năng duy tr sức căng của các mô, tế
bào thông qua vic tăng cƣờng tổng hp các cht nhƣ cc loại đƣờng tan, các loại
acid amin,… đ tăng p sut thm thu. Glycine betaine và proline là hai trong s
những cht trao đổi đƣc quan tâm do sự tích lũy hm lƣng cao các hp cht này
khi cây gp cc điều kin bt li từ môi trƣờng, đc bit là những yếu t liên quan
đến áp sut thm thu ni bào.
Ở mt s loài thực vật bậc cao, glycine betaine đƣc tổng hp thông qua mt
chuỗi gồm hai phản ứng từ choline đƣc chuyn hóa thành betaine aldehyde nhờ

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên xúc tác bởi choline monooxygenase và từ betain aldehyde đƣc chuyn hóa thành

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3. Nội dung nghiên cƣ́ u
- Nhân dòng gen codA từ vector tách dòng pBluesript II SK và thiết kế cu
trúc mang gen codA đƣc điều khin bởi promoter 35S.
- Nghiên cứu tạo cây Xoan ta chuyn gen mang cu trúc gen codA;
- Trồ ng, chăm só c cây chuyể n gen ngoà i nhà lƣớ i v k im tra sự có mt của
gen codA ở các dòng cây Xoan ta chuyn gen;
- Đnh gi khả năng chu mn, sinh trƣởng và phát trin của các dòng cây
Xoan ta chuyn gen bằng phƣơng php nhiễm mn nhân tạo.
4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Chƣơng 1
TỔ NG QUAN TÀ I LIỆ U
1.1. Giới thiệu về cây Xoan ta (Melia azedarach L.)
1.1.1. Nguồn gốc và phân bố của cây Xoan ta
Cây Xoan ta có tên khoa hc (Melia azedarach L.) thuc h Xoan
(Meliaceae) hay còn gi là h Dái ngựa, b Bồ hòn (Sapindales), ngành Ngc lan
(Magnoliophyta). H Xoan có khoảng 50 chi và 550 loài, phân b khắp miền nhit
đi; mt chi (Toona) phát trin ti tận vùng ôn đi phía Bắc của Trung Quc và về
phía Nam ti Đông nam Australia, mt chi khác gn nhƣ phân b hu hết ở các
vùng phía Bắc [1].
Ở Vit Nam, cây Xoan ta đƣc gây trồng thành rừng hoc phân b ở hu hết
các tnh từ Bắc đến Nam, trên nƣơng rẫy cũ hoc ven sông mt s tnh vùng Tây

bạc màu, khô hạn hoc ng nƣc đều không thích hp vi cây Xoan ta. Cây Xoan ta
có h rễ ngang khá phát trin, thƣờng ăn nông v lan rng, rễ cc ăn sâu. Xoan ta
thƣờng phân cành sm, khả năng đâm chồi mạnh nên có th li dng tái sinh chồi
đƣc [1].
1.1.3. Giá trị sử dụng
Xoan ta là loài cây thân gỗ ln, đa tc dng, cây Xoan ta có th đƣc trồng
rừng đ ly gỗ ln hay trồng đ che bóng và phòng h. Gỗ xoan ta thuc nhóm V,
có lõi màu hồng hay nâu nhạt, giác xám trắng, gỗ nhẹ mềm. Gỗ Xoan sau khi ngâm
khá bền, khó b mi mt, cho nên thƣờng đƣc dùng trong xây dựng, đng đồ gia
dng, trang trí ni tht v điêu khắc,… Ngoi ra, l v rễ còn có th s dng làm
phân xanh, thuc sát trùng, hạt có th ép ly du đ chữa mt s bnh, than củi xoan
cho nhit lƣng cao. Loi cây ny cũng c cht theraupic và mt s hp cht
limonoids [1], [16], [17].

6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1.1.4. Tình hình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến giống Xoan ta
Cây Xoan ta l loi cây đa tc dng, c gi tr cao. Trên thế gii v ở Vit
Nam đ c nhiều công trnh nghiên cứu về đc đim lâm sinh hc, công dng của
chng đi vi con ngƣời v môi trƣờng sinh thi. Tuy nhiên, cc nghiên cứu ứng
dng công ngh sinh hc đ cải tiến cht lƣng ging Xoan ta lại chƣa đƣc quan
tâm nhiều. Đ c mt s công trnh trong v ngoi nƣc nghiên cứu về ti sinh
Xoan ta [2], [4], [8], [9], [31], [32], [35], [39], [40]. Tuy nhiên, cc nghiên cứu ny
mi ch tập trung vo vic xây dựng qui trình tái sinh in vitro phc v bảo tồn, nhân
ging vô tnh, chn lc biến d soma v phc v chuyn gen. S lƣng công trnh
công b về chuyn gen cải thin ging Xoan ta còn t. Trên thế gii mi ch c duy
nht mt công trnh công b về chuyn gen GFP vào cây Xoan ta, ở Vit Nam c 5
công trnh công b về chuyn gen vo cây Xoan ta: Chuyn gen gus v bar [8];

Hin nay, các nghiên cứu về cơ chế chng chu cc điều kin bt li từ môi
trƣờng (mn, hạn, lạnh, nhit đ cao, ) ở thực vật đang đƣc tập trung vo hƣng
nghiên cứu lm tăng cƣờng các cht giúp bảo v áp sut thm thu của tế bào khỏi
sự mt cân bằng nƣc gây chết. Sự tăng cƣờng các cht điều chnh áp sut thm
thu đƣc phát hin trong nhiều trƣờng hp môi trƣờng bt li nhƣ hạn hán, mui
mn và lạnh giá. Khả năng điều chnh áp sut thm thu là mt đc tính rt quan
trng của tế bào khi b mt nƣc do lạnh, mui hoc hạn. Những thực vật sng trong
môi trƣờng thiếu nƣc b mt cân bằng về áp sut thm thu trong tế bo đòi hỏi phải
có khả năng chng chu lại điều kin khắc nghit đ [12], [13], [30], [33], [34].
Mt trong những phƣơng thức của thực vật chng lại sự mt cân bằng áp
sut thm thu đ l dựa trên sự thay đổi trong chuyn hóa tế bào cht dẫn đến sự
xut hin v tch lũy cc cht hòa tan, protein, hoc cc amino acid đc hiu [10].
Hin tƣng này xảy ra rt nhanh khi b mt nƣc. Sự tch lũy các cht này không
làm ảnh hƣởng đến hoạt đng bnh thƣờng của các enzyme ni bo. Ngƣc lại, sự
tch lũy lƣng ln các cht hòa tan trong tế bào sẽ điều chnh áp sut thm thu
bằng tc đng tổng th mà chúng có khả năng giữ và ly nƣc vào tế bào. Ngoài ra,
chúng có th thay thế v tr nƣc nơi xảy ra các phản ứng ha sinh, tƣơng tc vi
lipid hoc protein trong mng, ngăn chn sự phá hủy màng tế bào và các phức h
protein. Về mt hóa hc, chng thƣờng là những phân t trung hòa về đin, có kích
thƣc rt nhỏ, đng vai trò quan trng giúp các phân t protein và màng tế bào

8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên chng lại sự biến tnh dƣi tc đng của cc điều kin bt li phi sinh hc (abiotic
stress) [5], [24].
Cht bảo v áp sut thm thu hay các cht hòa tan tƣơng thch thuc các
nhóm cht sau đây:
(1). Glycine betaine (là dẫn xut methyl ha nhm nitơ của amino acid);
Mui tích t ở các lá già, lá già cun lại, héo và chết dn mang theo lƣng mui nht
đnh. Những cây lúa chu mn ch còn lại những l non c hm lƣng mui t hơn [5].
Môi trƣờng sng c đ mn cao sẽ làm ức chế sự hp th nƣc vào trong ni
bo, thay đổi khả năng đng mở của khí khổng v lm thay đổi khả năng hp th CO
2

vào tế bào lá cây, gây tổn thƣơng mô tế bào thực vật. Những thay đổi trong trao đổi
cht thƣờng dẫn đến sự gia tăng mt s cht liên quan đến điều chnh áp sut thm thu
nôi bo nhƣ glycine betain, proline, ectoine hoc pylol, Tuy nhiên, thông thƣờng sự
điều chnh này ch đòi hỏi tăng cƣờng của mt trong những enzyme trong con đƣờng
tổng hp hoc chuyn hóa các cht đ [5].
Trong các vùng b nhiễm mn kéo dài (ven bin), những cây có khả năng chu
mn thích nghi vi môi trƣờng sng đều có những thay đổi sâu sắc trong trao đổi cht
cũng nhƣ c cc cơ chế chng chu thích hp [5]. Các biến đổi đ thƣờng đi theo cc
hƣng sau:
(1) Loại bỏ các dạng oxy hoạt hóa – ROS (reactive oxygen species) sinh ra
trong điều kin mn.
(2) Tăng cƣờng các cht điều chnh áp sut thm thu.
(3) Kim soát sự hp th ion Na
+
, K
+
, Ca
2+
và hp th nƣc.
(4) Sinh tổng hp mt s protein có khả năng chng chu mn.
1.2.1.1. Loại bỏ các dạng oxy hoạt hóa – ROS sinh ra trong điều kiện mặn
Trong trƣờng sng b nhiễm mn, tế bào thực vật b mt nƣc và tạo ra nhiều


làm ngắt đoạn chuỗi peptide, thay đổi đin tích. Các protein mt đi chức năng sinh
hc và cui cùng chúng b các protease nhận biết và phân hủy. Ngoài ra, ROS còn tác
đng gây tổn thƣơng phân t DNA. ROS lm đi biến DNA nhƣ mt đoạn hoc
những hiu ứng di truyền bt li khác. ROS có th tc đng lên các gc glycosyl hoc
gc base ở những v trí mẫm cảm trên phân t DNA. ROS tc đng lên lc lạp và h
quang hp bằng cách làm giảm cƣờng đ phiên mã và dch mã của RUBISCO.
Khi nồng đ ozon cao, tế bào thực vật sẽ đng kh khổng đ ozon không xâm
nhập thêm vo mô l, đồng thời hoạt hóa các h thng chng oxy hóa. Chúng hoạt
hóa tổng hp ethylene v tch lũy salicylic acid, cc cht này có vai trò hoạt hóa h
thng bảo v của tế bào. H thng bảo v tế bào nhằm loại bỏ ROS đƣc thực hin
nhờ các cht chng oxy hóa tồn tại trong các bào quan. Các cht này gồm các enzyme
(catalase, superoxide dismutase, ascorbate peroxidase, monodehydroascorbate reductase,
glutathione reductase, ) và các hp cht chng oxy hóa không có bản cht enzyme
(ascorbate, glutathione dạng kh, α-tocopherol và carotenoid).
1.2.1.2. Tăng cường các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu.
Sự tăng cƣờng tch lũy cc cht điều chnh áp sut thm thu đƣc phát hin
thy ở nhiều loài thực vật khi sng trong môi trƣờng bt li nhƣ mn, hạn, lạnh giá.
Nếu nồng đ mui bên ngoi môi trƣờng ngoại bào cao, môi trƣờng sẽ giữ lại nƣc
v nƣc sẽ không đƣc hp th vào bên trong ni bào, ngây ra khan hiếm nƣc
trong tế bào. Đ thích ứng tế bào thực vật tăng cƣờng tổng hp v tch lũy cc cht
điều chnh áp sut thm thu nhƣ proline, các loại đƣờng tan (glucose,
fructose, ), Các cht ny thƣờng có 2 chức năng: Sự tch lũy cc cht này trong
tế bào sẽ điều chnh áp sut thm thu bằng tc đng tổng th mà chúng có khả
năng giữ và ly nƣc vào tế bào hoc ngăn chn sự xâm nhập của ion Na
+
. Ngoài ra,
chúng có th thay thế v tr nƣc nơi xảy ra các phản ứng ha sinh, tƣơng tc vi
lipid hoc protein trong màng nhằm bảo v màng tế bào cht không b phá hủy và
bảo v các phức protein.

lƣơng phân t nhỏ qua màng. Các cht vận chuyn đ bao gồm cc bơm, cc cht
mang và các kênh vận chuyn. Cc bơm l cc enzyme dạng ATPase vận chuyn
các proton H
+
và Na
+
qua màng tế bo, thƣờng chuyn đƣc 10
2
phân t/giây. Cht
mang là các protein hoc phức h protein thƣờng chuyn đƣc 10
3
phân t/giây.
Các kênh vận chuyn nƣc và các cht ion K
+
, Ca
+
và anion thành dòng, thƣờng
chuyn đƣc 10
8
phân t/giây.
1.2.1.4. Sinh tổng hợp một số protein có khả năng chống chịu mặn.
Khi gp cc điều kin cực đoan, mt s gen liên quan đến tính chng chu
thƣờng đƣc biu hin vi tc đ nhanh đ tổng hp các protein/enzyme có khả
năng chng chu mn nhƣ P5CS, protein LEA, Protein COR, Speroxide
dismutase,
Ở cây Arabidopsis, các gen phản ứng vi điều kin lạnh chiếm từ khoảng 4 -
20% genome. Protein COR đƣc cảm ứng bởi điều kin lạnh thông qua yếu t
CRT/DRE trên promoter. Yếu t phiên m CBF1 điều khin sự biu hin của mt
loạt các gen chu lạnh nhƣ cor 6.6, cor 15a, cor 47, cor 78. Còn CBF3 tăng cƣờng
biu hin các gen chu lạnh liên quan đến sự điều chnh áp sut thm thu nhƣ tăng

Glycine betaine xut hin nhƣ mt yếu t quyết đnh ti khả năng chng chu
điều kin bt li ở thực vật. Cht này là cht có hiu quả ln, liên quan mật thiết
đến khả năng sinh trƣởng của cây trồng trong điều kin môi trƣờng nhiễm mn,hạn
hán, lạnh giá và nhit đ cao. Sự tch lũy của glycine betaine trong tế bào làm giảm
hoàn cảnh bt li. Sự tổng hp v tch lũy glycine betaine trong tế bào có hiu quả
hơn cc hp cht tƣơng thch khác trong quá trình làm ổn đnh cu trúc bậc bn của
enzyme và các phức h protein, cũng nhƣ trạng thái ổn đnh của màng sinh cht
trong điều kin nồng đ mui cao hay ở nhit đ cực đoan [22], [24].

13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Ở nồng đ cao, glycine betaine không gây cản trở chức năng của tế bào cht
mà có tác dng đảm bảo tính ổn đnh cu trúc và chức năng của cc đại phân t. Mức
đ tch lũy glycine betaine tƣơng quan vi khả năng chng chu điều kin bt li.
Glycine betaine đƣc tch lũy chủ yếu trong lc lạp, đng vai trò quan trng trong điều
chnh và duy tr mng thylacoid do đ duy tr hiu quả quang hp [15], [26], [29].
Trong nhiều loài cây trồng, sự tch lũy tự nhiên của glycine betaine đủ đ cải
thin tc đng tiêu cực của tình trạng mt nƣc gây ra bởi những vn đề môi trƣờng
khác nhau. Bên cạnh đ, mt s loài cây trồng nhƣ: la, thuc lá, Arabidopsis…
trong tự nhiên không tổng hp glycine betaine trong điều kin stress (điều kin môi
trƣờng cực đoan) hoc không stress. Các ứng dng của glycine betaine ngoại sinh
có th giúp giảm thiu tc đng tiêu cực của môi trƣờng bên ngoài. Glycine betaine
ngoại sinh có th thâm nhập qua l v đƣc vận chuyn đến cc cơ quan nơi n sẽ
góp phn tăng cƣờng khả năng chu đựng stress. Tuy nhiên, phƣơng php ny cho
hiu quả không cao. Ứng dng công ngh chuyn gen thực vật, các nhà khoa hc đ
tạo ra nhiều ging cây trồng có khả năng chng chu cc điều kin bt li của môi
trƣờng bằng cách chuyn các gen codA giúp cây tự tổng hp v tch lũy glycine
betaine [19].


Hình 1.4. Chu trnh sinh tổng hp GB ở vi khun E.coli
1.2.3.3. Sinh tổng hợp glycine betain ở vi khuẩn Arthrobacter globiformis và
Arthrobacter panescens
Ngƣc lại, con đƣờng sinh tổng hp GB ở mt s vi khun nhƣ Arthrobacter
globiformis và Arthrobacter panescens, ch đƣc xúc tác bởi choline oxydase

15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên (COD). Kết quả là từ tiền cht choline chuyn hóa thành sản phm trực tiếp là
glycine betaine không thông qua hp cht trung gian [19] theo sơ đồ sau:

Hình 1.5. Chu trình sinh tổng hp GB ở vi khun Arthrobacter globiformis
1.2.4. Nguồn gốc và đc điểm của gen codA
Quá trình sinh tổng hp glycine betaine đƣc tìm thy ở nhiều sinh vật khác
nhau: vi khun, đng vật và thực vật hạt kín. Tuy nhiên, gen codA ch đƣc tìm
thy và phân lập trong h gen của vi khun Arthrobacter globiformis và
Arthrobacter panescens. Vi khun Arthrobacter thuc nhóm vi khun gram dƣơng
sng trong đt. Khi môi trƣờng đt nhiễm mn, vi khun này s dng gen codA nhƣ
mt vũ kh li hại đ bảo v giúp chúng sng sót [19].
Gen codA c kch thƣc phân t là 1.641 bp, mã hóa cho choline oxidase có
kch thƣc phân t 547 amino acid, trng lƣng 60kDa. Choline oxidase là mt
enzyme chìa khóa giữ vai trò quan trng đi vi quá trình sinh tổng hp glycine
betaine ở Arthrobacter. Choline oxidase c khả năng xc tc phản ứng oxi hóa 4
electron của choline đ tạo ra sản phm trực tiếp là glycine betaine mà không qua
các hp cht trung gian. Enzyme ny c  nghĩa quan trng bởi v khi tch lũy hm
lƣng cao glycine betaine trong tế bào giúp cho tế bào chng lại sự kh nƣc và
hin tƣng co nguyên sinh trong điều kin môi trƣờng bt li [38].

đƣa ra giả thuyết rằng trong tế bào cht chứa lƣng cơ cht l choline cao hơn trong
lc lạp, do đ, đây c th là v trí tổng hp choline trong tế bào [25], [42]. Khi các
nhà khoa hc tiếp tc kim tra cây Arabidopsis thaliana chuyn gen codA trong các
điều kin bt li khc nhƣ: nhit đ thp, nhit đ cao, khô hạn th thu đƣc kết quả
tƣơng tự. Nghĩa l, cây chuyn gen codA có khả năng chng chu đƣc cc điều
kin bt li từ môi trƣờng: mn, lạnh, hạn và nhit đ cao [19].
Ngoài ra, không dừng lại ở cây mô hình A. thaliana, nhiều tác giả đ nghiên cứu
chuyn gen codA vào mt s loài cây trồng nhƣ: cây hồng Nhật bản (Diospyros kaki),
cây cải bẹ, cây cà chua, cây bạch đn, cây ngô, cây đậu tƣơng, cây thuc lá, [19], [44].
Các kết quả thu đƣc đều chứng minh rằng vic tăng tch lũy glycine betaine giúp cây

Trích đoạn Tạo cây Xoan ta chuyển gen mang gen codA

---