Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT


Hà Nội - 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã hướng dẫn, giúp
đỡ tận tình để tôi hoàn thành luận văn này:
Người thầy của tôi, PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Phó Viện trưởng Viện công
nghệ sinh học, trưởng phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh
học, đã hướng dẫn và hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý
báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
GS. TS. Lê Trần Bình, TS Lê Văn Sơn, TS. Phạm Bích Ngọc, CN. Nguyễn
Đình Trọng và cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật đã chỉ bảo tận tình về
chuyên môn, luôn theo sát thí nghiệm của tôi để có những lời khuyên bổ ích và kịp
thời.
Trong những năm học tập và nghiên cứu tại phòng Công nghệ tế bào thực
vật, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ, động viên chân thành của tập
thể cán bộ phòng. Các thực tập sinh luôn thân thiện, nhiệt tình, tạo nên một môi
trường nghiên cứu chủ động, hăng say. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý
báu này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến phòng Tổng hợp hữu cơ Viện Hóa học
- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phòng Sắc ký khối phổ phân giải cao -
khoa Hóa học - Đại học Khoa học tự nhiên đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành
đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo tại cơ sở viện Sinh thái
và Tài nguyên sinh vật đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời
gian học tập vừa qua.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY BÁ BỆNH 4
1.1.1. Giới thiệu và phân bố địa lý 4
1.1.2. Phân loại 4
1.1.3. Hình thái 5
1.1.4. Tác dụng dƣợc lý của cây bá bệnh 5
1.1.5. Tính cấp thiết nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây bá
bệnh 6
1.2. NUÔI CẤY SINH KHỐI RỄ TƠ - GIẢI PHÁP TẠO NGUỒN DƢỢC
PHẨM SẠCH PHỤC VỤ SỨC KHỎE CỘNG ĐỒNG 6

3.3.5. Kiểm tra các dòng rễ tơ chuyển gen 40

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.3.6. Kết quả nuôi sinh khối rễ tơ cây bá bệnh trên môi trƣờng WPM
lỏng 42
3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP CÓ TRONG DÒNG
RỄ TƠ BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG VÀ KHỐI PHỔ KẾ 42
3.4.1. Kết quả sắc ký bản mỏng 42
3.4.2. Kết quả phân tích hợp chất tự nhiên của rễ bá bệnh 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
nguồn tài nguyên này. Trƣớc tình hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu giá trị của
cây Bá Bệnh ở Việt Nam, phân tích tác dụng dƣợc lý để đƣa ra những hƣớng dẫn
chiết xuất, sử dụng phù hợp với sức khoẻ cộng đồng, cần sớm nghiên cứu áp dụng
nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu
làm thuốc.
Những năm gần đây, cùng với xu hƣớng chung trên thế giới, ở nƣớc ta
hƣớng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất các sản phẩm thứ
cấp đã bắt đầu đƣợc quan tâm đầu tƣ phát triển. Tuy nhiên quá trình nuôi cấy tạo
sinh khối tế bào thực vật nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
2

nuôi cấy cần bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng vào trong môi trƣờng nuôi cấy.
Vấn đề này là một trong những trở ngại lớn do tồn dƣ của các chất điều hòa sinh
trƣởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hƣởng trực tiếp đến sản phẩm và sức
khỏe ngƣời sử dụng. Việc này hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối
từ rễ tơ. Rễ tơ là một bệnh ở thực vật đƣợc gây ra bởi quá trình tƣơng tác giữa vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes và tế bào vật chủ. Rễ tơ có khả năng sinh trƣởng
nhanh, phát triển tốt trên môi trƣờng không cần bổ sung các chất điều hòa sinh
trƣởng và có thể nuôi cấy tạo sinh khối liên tục điều này có ý nghĩa trong dây
chuyền sản xuất các hợp chất thứ cấp hay các dƣợc phẩm sinh học tái tổ hợp. Rễ tơ
có thể sản xuất một lƣợng lớn các hợp chất thứ cấp và là cơ quan biệt hóa nên rễ tơ
có sự di truyền ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền phù và mô sẹo. Xuất phát từ các
ƣu điểm trên và do hợp chất dƣợc lý quý của Bá bệnh chủ yếu thu đƣợc từ rễ, chúng
tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo sinh khối thông qua
hệ thống nuôi cấy rễ tơ của cây bá bệnh (Eurycoma longifolia)”. Công trình này
đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2. Mục đích nghiên cứu
Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc tạo sinh
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây bá bệnh
1.1.1. Giới thiệu và phân bố địa lý
Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) hay Tongkat Ali là cây thảo dƣợc
phân bố chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á. Bá bệnh là một cây thuốc đƣợc sử dụng
trong dân gian từ rất lâu, nó còn đƣợc gọi với những cái tên khác đó là: cây mật
nhân, hay cây bách bệnh. Tại Việt Nam bá bệnh có mặt trong vƣờn quốc gia Bái Tử
Long, khu Bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn- Kỳ Thƣợng, Hoành Bồ, Quảng Ninh,
một số rừng ở Tây Nguyên .
Cây Bá bệnh từ lâu đã đƣợc biết đến nhƣ là nhân sâm Malaysia, cũng nhƣ tại
nhiều nƣớc Đông Nam Á nhƣ Indonesia, Brunei, Thái lan, Cămpuchia, Lào… với
tác dụng giúp Nam giới tăng cƣờng chức năng sinh lý và sức khoẻ tình dục. Các bộ
phận của cây đƣợc sử dụng nhiều trong các bài thuốc truyền thống chữa các bệnh

cũng có tuyến. Bầu có 5 noãn, hơi dính ở gốc. Quả hạch, hình trứng dài 1 – 2cm,
rộng 0,5 – 1cm, vỏ nhẵn có rãnh dọc, khi chín quả màu đỏ sẫm chứa 1 hạt [22].
1.1.4. Tác dụng dƣợc lý của cây bá bệnh
Tác dụng dƣợc lý của cây bá bệnh đã đƣợc chứng nhận và công bố rộng rãi
với nhiều đề tài nghiên cứu khoa học trên thế giới nhƣ: Kardono, Angerhofer et al.
1991; Ang, Chan et al. 1995; Ang and Cheang 1999, 2000; Ang, Ikeda et al. 2001;
Osman, Jordan et al. 2003; Chan, Choo et al. 2004; Kuo, Damu et al. 2004;
Nurhanan, Azimahtol Hawariah et al. 2005; Farouk and Benafri 2007…. Các hợp
chất có hoạt tính sinh học đã đƣợc tìm thấy từ các bộ phận khác nhau của cây nhƣ
eurycomaoside, eurycolactone, eurycomalactone, eurycomanone, and pasakbumin-
B, cùng với các alkaloid và quassinoid [12]. Cây Bá bệnh đã đƣợc sản xuất và sử
dụng dƣới dạng thực phẩm chức năng tại nhiều nƣớc ở châu Á, Tây Âu và Hoa Kỳ.
Tác dụng dƣợc lý vƣợt trội của cây Bá bệnh là khả năng tăng cƣờng sức khoẻ
tình dục cho Nam giới, kích thích cơ thể tăng tiết hormon giới tính nam
(testosteron) một cách tự nhiên, chính là chìa khóa duy trì sự hƣng phấn và phong
độ tình dục ở nam giới thƣờng có dấu hiệu suy giảm khi bƣớc vào độ tuổi trung
niên, làm giảm sự ham muốn, chất lƣợng sinh hoạt tình dục suy yếu, xảy ra hiện
tƣợng xuất tinh sớm, … thƣờng gọi chung là yếu sinh lý hay chứng bất lực [5].
Ở Việt Nam, cây bá bệnh mới đƣợc phát hiện trong những năm gần đây nên
chƣa có nhiều nghiên cứu khoa học trong nƣớc về cây này. Tuy nhiên, các bƣớc
nghiên cứu ban đầu cho thấy cây bá bệnh của Việt Nam có tác dụng không kém, có
phần vƣợt trội so với xuất xứ từ các nƣớc khác. Vừa qua Trung tâm Nam học- bệnh
viện Việt Đức đã tiến hành nghiên cứu lâm sàng về “Tính hiệu quả và an tòan của
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
6

sản phẩm Khang Dƣợc trong điều trị mãn dục nam” do GS.TS Trần Quán Anh làm
chủ nhiệm đề tài. Kết quả nghiên cứu trên 30 bệnh nhân sau thời gian sử dụng 8
tuần bƣớc đầu cho thấy: Sản phẩm Khang Dƣợc gồm bá bệnh, Linh chi và Nhân
sâm có tác dụng đối với nam giới sau 40 tuổi: gia tăng ham muốn tình dục, nâng

Cho đến nay, rất nhiều hoạt chất nguồn gốc thực vật có giá trị kinh tế cao là
sản phẩm của sinh khối tế bào thực vật:
i) các hoạt chất dùng trong dƣợc phẩm nhƣ caffein thu đƣợc từ nuôi cấy tế
bào (Coffea arabica) [29], betalain từ mô sẹo củ cải đƣờng, berberin từ cây (Coptis
japonica) (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu đƣợc hàm lƣợng Berberin
đáng kể trong rễ, trong khi hàm lƣợng này có thể thu đƣợc sau 4 tuần nuôi cấy [32].
ii) Các chất khác nhƣ chất dùng trong thực phẩm bao gồm các chất tạo màu
(Anthocyanin, crocin), các chất tạo mùi (vani, mùi hành và mùi tỏi)
iii) Các chất khác nhƣ shikonin – chất có khả năng diệt khuẩn và Paclitaxel.
Một ví dụ điển hình về ứng dụng hệ thống bioreactor 10.000 lít trong sản xuất
reserpine (alkaloid chiết xuất từ cây Ba gác có tác dụng chữa bệnh cao huyết áp và
các bệnh rối loạn tuần hoàn máu) có thể sản xuất đƣợc 3500 kg resperin trong thời
gian 30 ngày, tƣơng đƣơng với lƣợng hàng năm cả thế thu đƣợc từ cây rễ đó.
Với nhân sâm đã có rất nhiều các nghiên cứu về tạo sinh khối sâm từ tế bào
huyền phù, mô sẹo, từ nuôi cấy rễ hay rễ tơ để thu hoạch các hoạt chất quý
(Kawaguchi, Hirotani et al. 1990; Asada, Saito et al. 1993; Yoshikawa, Asada et al.
1993; Zhao, Ding et al. 2001; Jeong, Park et al. 2002; Palazon, Mallol et al. 2003;
Liu, Ding et al. 2004; Woo, Song et al. 2004; Jeong, Park et al. 2005). Hiện nay,
một số nƣớc tiêu thụ và xuất khẩu sâm lớn nhƣ Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc
đã ứng dụng nuôi cấy sinh khối tế bào từ nhân sâm trong sản xuất các sản phẩm
chức năng hay làm thuốc bổ, thuốc phòng chống bệnh tim mạch, chống gốc tự do,
tăng cƣờng chức năng hệ thần kinh trung ƣơng, các loại mỹ phẩm [2, 23, 37, 38].
Trong khi đó, có rất ít nghiên cứu về nuôi cấy sinh khối tế bào cây bá bệnh. Gần
đây, nhóm nghiên cứu của Maziah và cs (2009) đã thành công trong nuôi cấy cảm
ứng tạo hoạt chất chống ung thƣ 9-methoxycanthin-6-one từ mô sẹo [30].
Trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm giảm hoặc mất
tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy cần thiết bổ sung các chất điều tiết sinh
trƣởng vào trong môi trƣờng nuôi cấy. Vấn đề này là một trong những trở ngại lớn
làm nản lòng các nhà nghiên cứu do tồn dƣ của các chất điều tiết sinh trƣởng trong
sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hƣởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe ngƣời sử
Hình 2. Khuẩn Agrobacterium rhizogenes
1.2.3 Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật
Khi các vi khuẩn A.rhizogenes nhiễm vào vết thƣơng của thực vật thì chúng
sẽ chuyển gen của chúng vào các tế bào thực vật tại vị trí đó. Các gen đƣợc chuyển
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
9

từ A.rhizogenes vào trong bộ gen của tế bào thực vật đƣợc gọi tên là T-DNA
(transfer DNA). T-DNA sau khi chuyển vào thì sẽ đƣợc gắn ổn định vào bộ gen của
thực vật. Tuy các gen mã hóa T-DNA có nguồn gốc từ vi khuẩn nhƣng nó có mang
các trình tự điều tiết ở Eukaryote nên có thể biểu hiện đƣợc trong tế bào thực vật.
Vùng T-DNA này nằm trong một plasmid lớn của A. rhizogenes và plasmid này
đƣợc đặt tên là Ri- plasmid (root inducing plasmid) do A.rhizogenes có khả năng
cảm ứng tạo rễ bất định [27].
Ri-plasmid đƣợc chia thành 2 nhóm chính là agropine and mannopine, vi
khuẩn A. rhizogenes chứa Ri-plasmid thuộc loại agropine đƣợc sử dụng chủ yếu
cho quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo rễ tơ. Ri-plasmid
đƣợc chia thành nhiều vùng nhƣ vùng gây độc (gọi tắt là vùng vir), vùng chuyển
gene (T-DNA), vùng ori, vùng phiên mã Chỉ có đoạn T-DNA của plasmid mới
đƣợc chuyển vào bộ gen của thực vật và việc chuyển gen này thông qua sự hỗ trợ
bởi các đoạn gen trong vùng vir của Ri-plasmid. Vùng vir chiếm khoảng 35 kb
trong Ri-plasmid và mã hóa sáu locus phiên mã (vir A, B, C, D, E, G), có chức
năng quan trọng trong quá trình chuyển gen [37]. Sự phiên mã của vùng vir đƣợc
cảm ứng với nhiều hợp chất thuộc nhóm phenol, điển hình là acetosyringone - hợp
chất liên quan đƣợc xác định là có vai trò làm tăng tần số của quá trình chuyển gen
thông qua Agrobacterium ở nhiều loài thực vật. Nhiều loại đƣờng cũng đóng vai
trò nhƣ chất bổ trợ hoạt động cho acetosyringone để cảm ứng sự biểu hiện của gene
vir ở mức độ cao.

đó tế bào thực vật sẽ làm nhiệm vụ biểu hiện các gene rol và gen aux (tổng hợp ra
IAA) làm tăng khả năng tạo các lông rễ một cách mạnh mẽ ngay tại vị trí bị tổn
thƣơng ở mô thực vật đó. Số lƣợng các lông rễ đƣợc tạo ra khá nhiều, phát triển
thành một hệ thống lông rễ, hay còn gọi là hệ thống rễ tơ.
Tại Hàn Quốc, một số công ty đang sản xuất rễ tơ nhân sâm với bioreactor có
dung tích 10.000 đến 20.000 lít. Sản phẩm này đƣợc làm nguyên liệu cho các dạng
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
11

thực phẩm chức năng và thực phẩm khác nhau trên thị trƣờng. Đã có rất nhiều
nghiên cứu thành công trong tạo các hoạt chất từ nuôi cấy sinh khối rễ tơ [3, 4].
Hình ảnh một số rễ tơ đƣợc nuôi cấy trong các môi trƣờng lỏng và môi trƣờng
đặc: Hình 4. Các hệ rễ tơ đƣợc nuôi cây
1. Rễ tơ Beta vulgaris phát triển trên môi trƣờng agar
2. Rễ tơ của cây đậu phộng (Arachis hypogaea)
3. Rễ tơ G. glabra nuôi trong môi trƣờng lỏng
4. Nuôi cấy rễ tơ G.glabra bằng hệ thống bioreactor (a); thu hoạch
sinh khối rễ sau 30 ngày nuôi cấy (b,c)
Điểm đặc trƣng nổi bật của hệ thống rễ tơ là chúng có khả năng phát triển
nhanh và ổn định trên môi trƣờng nuôi cấy không cần bổ sung chất điều hòa sinh
trƣởng thực vật (CĐHSTTV). Với sự chuyển gene của A. rhizogenes vào tế bào,
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
12

rễ tơ có khả năng tổng hợp ra nhiều loại hợp chất tự nhiên với hiệu suất cao mà các
tế bào không phân hóa và các rễ bất định không chuyển gen không tổng hợp đƣợc
hay tổng hợp với hàm lƣợng không đáng kể. Rễ tơ đƣợc xem nhƣ là một nguồn

13

Bảng 1: Sản xuất hợp chất thứ cấp bằng kỹ thuật nuôi cấy mô rễ tơ từ một số loài
cây thuốc
Họ thực vật
Cây thuốc
Hợp chất
chính
Tác dụng
Araliaceae
Panax ginseng
Các
ginsenosid
Bổ, tăng lực, chống
stress
Apocynaceae
Rauwolfia
micrantha
Ajmalicin,
Ajmalin
Hạ huyết áp
Asteraceae
Saussurea
medusa
Jaceosidin
Kháng ung thƣ
Cucurbitaceae
Gynostemma
pentaphyllum
Gypenosid

Giảm đau
Solanaceae
Solanum
chrysotrichum
Saponin
Kháng virus
Verbenaceae
Gmelina
arborea
Verbascosid
Phòng chống bệnh đau
bao tử, sốt và bệnh ngoài
da
1.3. Các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị DNA vào việc định danh loài
Trong nghiên cứu này, việc thu thập các nguồn mẫu bá bệnh ngoài tự nhiên
làm nguyên liệu cho nuôi cấy là một đòi hỏi cần thiết. Tuy nhiên, nguồn nguyên
liệu ngoài tự nhiên nếu chỉ dựa vào hình thái và kinh nghiệm dân gian đôi khi dễ
nhầm lẫn với những đối tƣợng cây có hình thái tƣơng tự tại sống cùng một khu vực.
Điều này có ảnh hƣởng không nhỏ đến nghiên cứu. Do đó việc định danh các mẫu
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
14

cây ngoài tự nhiên bằng phƣơng pháp sinh học phân tử sẽ mang ý nghĩa rất quan
trọng.
Trong vài thập kỷ gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của các phƣơng pháp và
kỹ thuật sinh học phân tử đã tạo ra các công cụ hữu hiệu cho nghiên cứu sự sống ở
mức độ phân tử. Các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh chóng đƣợc ứng dụng
trong nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học, định dạng loài, tạo ra các lĩnh vực
khoa học mới nhƣ tiến hóa phân tử, di truyền bảo tồn loài. Đặc biệt, đối với lĩnh vực
phân loại học, việc sử dụng các DNA chỉ thị để định danh loài đang đƣợc các nhà

Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài
thực vật gặp nhiều khó khăn. Hệ gen ty thể ở thực vật thƣờng quá bảo thủ nên
không đƣợc dùng cho chỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang nhiều đặc
điểm mong muốn đối với chỉ thị DNA nhƣ ở hệ gen ty thể ở động vật [47]. Ở hệ
gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal Transcribed
Spacer) cũng đƣợc sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên cứu. Trong vòng
5 năm qua, nhiều vùng gen đã đƣợc nghiên cứu và đề xuất là chỉ thị DNA cho thực
vật, tuy nhiên chƣa có chỉ thị DNA nào đƣợc đa phần các nhà phân loại học thực vật
hoàn toàn chấp nhận [44,47]. Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một
quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để định
danh loài đối với thực vật và hệ gen lục lạp là nơi chứa các vùng DNA chỉ thị tiềm
năng, trong đó một số vùng DNA lục lạp đã đƣợc nhiều nhà nghiên cứu đề xuất là
chỉ thị DNA .
1.4. Phƣơng pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS)
Phƣơng pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phƣơng pháp nghiên cứu
các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lƣợng phân tử của chất đó dựa trên
sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trƣờng hoặc
từ trƣờng nhất định. Tỉ số giữa khối lƣợng và điện tích (m/z) có ảnh hƣởng rất lớn
đối với chuyển động này của ion. Nếu biết đƣợc điện tích của ion thì ta dễ dàng xác
định đƣợc khối lƣợng của ion đó [45].
Nhƣ vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trƣớc tiên nó phải
đƣợc chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó đƣợc ion hoá bằng các phƣơng pháp
thích hợp. Các ion tạo thành đƣợc đƣa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của
máy khối phổ. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà ngƣời ta chọn kiểu
quét ion dƣơng (+) hoặc âm (-). Kiểu quét ion dƣơng thƣờng cho nhiều thông tin
hơn về ion nghiên cứu nên đƣợc dùng phổ biến hơn.Tuy nhiên, sự phát triển của kỹ
thuật hiện nay cũng đã cho phép tích hợp hai kiểu quét này thành một nhằm tạo điều
kiện thuận lợi nhất cho các nhà nghiên cứu, tuy nhiên thƣờng độ nhạy không cao
bằng từng kiểu quét riêng lẻ.Trong rất nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc
ký lỏng ghép khối phổ phải đối mặt với rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải

ion hóa, bộ phận phân tích khối, detector và máy tính ghi nhậ xử lý, lƣu trữ kết quả
và điều khiển hệ thống. Tùy theo từng kỹ thuật phối khổ mà cấu và nguyên lý hoạt
động của từng bộ phận có thể khác nhau.

Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
17
Hình 5. Máy phổ khối lƣợng
Hình 6. Sơ đồ máy khối phổ
Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà
18

CHƢƠNG II. VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
- Thực vật: Giống cây Bá bệnh (mẫu hạt) lấy từ vƣờn Quốc gia Bái Tử Long, khu
Bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn - Kỳ Thƣợng, Hoành Bồ, Quảng Ninh.
- Chủng A. rhizogenes ATTC 15834 do Viện Dƣợc học và Sinh học phân tử, trƣờng
Đại học Heidelberg cung cấp
2.2. Dụng cụ - hóa chất
- Box cấy vô trùng, các loại thiết bị trong phòng nuôi cấy vô trùng ( giấy thấm, pank
dao kéo,ống ly tâm, ống cooling ) tủ tối, tủ 37
0
C.
- Dụng cụ nghiên cứu và máy móc thiết bị của Phòng Công nghệ tế bào thực vật -
Viện Công nghệ sinh học

o
C/30‟‟; 50-54
o
C;
72
o
C/50‟‟); 72
o
C/10‟. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch sử dụng bộ kit AccuPrep Gel
Purification Kit theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Sản phẩm PCR đã tinh sạch đƣợc xác định trình tự bằng máy phân tích trình
tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer theo nguyên lí của Sanger
với bộ kit BigDye Terminator v. 3.2 Cycle Sequencing (Macrogen Inc. Hàn Quốc).
Trình tự DNA đã giải đƣợc xử lý và phân tích bằng phần mềm BioEdit và DNAstar.

Đoạn
gen
nhân
bản
Trình tự mồi
Ký hiệu
mồi
Kích
thƣớc
đoạn
gen
Tm
rbcL

ATGTCACCACAAACAGAAAC