Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

NGUYỄN VĂN NAM
TÁCH DÒNG GEN cry4A, cry4B MÃ HOÁ PROTEIN
DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH TỪ CÁC CHỦNG
Baccillus thuringiensis PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT
THUỘC THÀNH PHỐ NHA TRANG
LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
THÁI NGUYÊN - 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi.
Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng
được ai công bố trong công trình nghiên cứu khác.

Thái Nguyên, ngày 18 tháng 10 năm 2012
Tác giả
Nguyễn Văn Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

i
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Đại cương về Bacillus thuringiensis 3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu Bacillus thuringiensis 3
1.1.2. Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bacillus thuringiensis 4
1.1.3. Phân biệt Bt với các loài khác trong nhóm Bacillus cereus 6
1.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 7
1.1.5. Protein tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 7
1.1.6. Đặc điểm phân loại của Bacillus thuringiensis 8
1.1.7. Đặc điểm phân loại loài phụ Bti 8
1.1.8. Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 8
1.2. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bti 15
1.2.1. Tinh thể độc của Bacillus thuringiensis var. israelensis 16
1.2.2. Cấu trúc phân tử nhân độc tố của Bti 17
1.2.3. Hoạt tính diệt côn trùng của Bti 18
1.2.4. Tác động của Bti đến các sinh vật khác 19
1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng trong nước và trên thế giới 19
1.3.1. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng trên thế giới 19
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 20
1.4. Tổng quan về côn trùng thử nghiệm 21
1.4.1. Phân loại khoa học của muỗi 21
1.4.2. Vòng đời của muỗi 23
1.4.3. Khả năng gây bệnh của muỗi 24
1.4.4. Sơ lược về côn trùng thử nghiệm: 24

3.6.1. Tách dòng gen cry4A và gen cry4B 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT
Chƣ̃ viết tắt
Chƣ̃ viết đầy đủ
1
Bp
Base pair – Cặp Base
2
Bt
Bacillus thuringiensis
3
dH
2
O
Deion water – Nước khử ion
4
DNA
Deoxyribonucleotide acid – Axit Nucleic
5
ĐC
Đối chứng
6


iv
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus 6
Bảng 1.2: Phân loại gen cry mã hóa các protein độc tố Cry diệt côn trùng 11
Bảng 1.2. Đặc điểm của một số protein độc tố Cry 13
Bảng 3.1. Thống kê số lượng chủng Bt phân lập được và hình dạng tinh thể
của chủng phân lập. 44
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus của
các chủng phân lập sau các khoảng thời gian khác nhau, ở các
nồng độ khác nhau. 46
Bảng 3.3. Kết quả khuếch đại gen độc tố thuộc nhóm cry4 của các chủng
phân lập 50
Bảng 3.5. So sánh trình tự ĐNT5.4-4B1 với các trình tự đã công bố trên
ngân hàng gen quốc tế bằng phần mềm Blast 60
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

v
DANH MỤC HÌNH
Trang

Hình 1.1. Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis 5
Hình 1.2. Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israelensis 7
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc chung của một protein độc tố Cry 9
Hình 1.4. Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng 12
Hình 1.5. Các giai đoạn phát triển của muỗi 23

có khoảng 270 triệ u ngườ i mắ c bệ nh số t ré t , làm chết hàng triệu người. Hàng
triệ u mắ c bệ nh sốt xuấ t huyế t và cá c bệ nh khác.  Việt Nam, theo số liệu của
Tổ ng cụ c Thố ng kê, 9 tháng đầu năm 2012 cả nước có 51,3 nghìn trường hợp
mắ c bệ nh số t xuấ t huyế t , trong đó 42 ca tử vong , 16 nghìn trường hợ p mắ c
bệ nh số t ré t , 554 trườ ng hợ p mắ c bệ nh viêm nã o Nhậ t Bả n , trong đó 15
trườ ng hợ p tử vong (64).
Có rất nhiều biện pháp hoá học và sinh học được áp dụng để khắc phục
tình trạng trên. Tuy nhiên các biện pháp hoá học lại thường gây ra tính kháng
thuốc trên côn trùng, cứ sau một khoảng gian rất ngắn thì thuốc hoá học lại
không còn tác dụng đồng thời thuốc hoá học còn gây ảnh hưởng đến sức khỏe
cộng đồng và góp phần làm mất cân bằng sinh thái. Vì vậy, các biện pháp
sinh học được khuyến khích sử dụng. Một trong các vi sinh vật được quan
tâm và sử dụng nhiều nhất là vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Sở dĩ như vậy là
do đặc tính sinh protein tinh thể độc có khả năng diệt côn trùng gây hại như:
Côn trùng bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ cánh cứng Vi khuẩn Bacillus
thuringiensis được ứng dụng để diệt côn trùng gây hại theo phương pháp:
thuốc diệt trừ sinh học Bt.
Việc nghiên cứu các hoạt tính diệt côn trùng của các chủng Bt phân lập
ở Việt Nam đặc biệt là hoạt tính diệt muỗi, ruồi là hết sức cần thiết nhằm tìm
ra những chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ cho việc diệt
ruồi, muỗi. Protein tinh thể độc Cry4A, Cry4B là hai trong nhiều protein có
hoạt tính chống lại côn trùng bộ hai cánh. Xuất phát từ mục đích này chúng
tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách dòng gen cry4A, cry4B mã hoá 2
protein diệt côn trùng bộ hai cánh từ các chủng Bacillus thuringiensis phân
lập từ một số mẫu đất thuộc thnh phố Nha Trang”.
Mục tiêu của đề tài
- Sàng lọc các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt côn trùng

đặt tên cho loài vi khuẩn này là Bacillus sotto, tên căn bệnh tằm dâu mà
ông đang nghiên cứu.
Mười năm sau (1911), loài vi khuẩn này được nhà khoa học người
Đức là E. Berliner phân lập được từ xác ấu trùng bướm Địa Trung Hải,
Anagasta kuhniella và ông đã có những mô tả đầu tiên về loài vi khuẩn
đất, tế bào hình que, có khả năng sinh bào tử này. Đến tận năm 1915, vi
khuẩn này mới mang tên Bacillus thuringiensis do nó được phân lập tại
một nhà máy bột vùng Thuringen của Đức. Về sau chủng này bị thất lạc
và được Mattes và cộng sự phân lập lại từ A. kuhniella vào năm 1927.
Chế phẩm Bt được sử dụng lần đầu tiên là vào năm 1930 để kiểm
soát loài côn trùng hại có tên là Angasta kuehnella, một loài sâu đục thân
ở Châu Âu. Chế phẩm thương mại đầu tiên được tung ra thị trường vào
năm 1938 để diệt loài côn trùng hại mùa màng ở Pháp[7] . 4
Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố
tinh thể có bản chất protein. 1956, Angus đã chứng minh được hoạt tính
diệt sâu là do tinh thể độc tách ra từ tế bào và bào tử [16].
Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân
loại mới cho các chủng Bt và Bacillus sphaericus (Bs) bằng phương pháp
huyết thanh [11].
Năm 1977, phát hiện ra dưới loài Bacillus thuringiensis var.
israelensis tại Israel và người đầu tiên phân lập và nghiên cứu là
Goldberg và Margarit. Loài này được kiểm nghiệm là có khả năng diệt ấu
trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh [4].
Từ đó đến nay, việc phân lập, phân loại và nghiên cứu Bacillus
thuringiensis trên cả hai lĩnh vực (ứng dụng và cơ bản) không ngừng phát
triển và được tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới.
 Việt Nam, Bt đã được nghiên cứu và ứng dụng là thuốc trừ sâu

đổi hình dạng tế bào. Một đặc điểm quan trọng là trong quá trình hình
thành bào tử hầu hết các chủng Bacillus thuringiensis đều tổng hợp
protein tinh thể. Protein tinh thể ở mỗi chủng khác nhau sẽ có hình dạng,
kích thước và số lượng khác nhau, tuy nhiên chúng mang đặc điểm chung
là có khả năng gây độc đối với nhiều loài côn trùng. Khi ở trong tế bào
sinh dưỡng, tinh thể thường nằm kề với bào tử, khi tế bào tan tinh thể và
bào tử đều thoát ra ngoài. Trong môi trường lỏng Bacillus thuringiensis
có khả năng chuyển động, khả năng này có được là nhờ các lông roi
(flagellar) trên bề mặt tế bào có kích thước lớn hơn 0,9 µm [57].
B. thuringiensis được xem như là loài vi khuẩn bản địa tồn tại trong
rất nhiều môi trường khác nhau. Meadows phân chia ra 3 ổ sinh thái phổ
biến của B. thuringiensis trong môi trường tự nhiên là côn trùng, thực vật
và đất [14]. 6
1.1.3. Phân biệt Bt với các loài khác trong nhóm Bacillus cereus
Các loài thuộc nhóm B. cereus gồm B. cereus, B. thuringiensis, B.
anthracis, B. mycoides, B. Megaterium. Gần đây có phát hiện thêm 2 loài
B. weihenstephanensis và B. pseudomycoides [59]. Việc sinh ra protein
tinh thể là một đặc tính để phân biệt Bacillus thuringiensis, tuy nhiên đó
chỉ là một chỉ tiêu dùng trong mục đích phân loại.
Bảng 1.1. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus
Đặc điểm
Bc
Bt
Bmy
Ba
Bme
Nhuộm Gram


Phân hủy tyrosine
+
+
+/-
-
(d)

+/-
Kháng lysozyme
+
+
+
+
-
Phản ứng với lòng đỏ
trứng
+
+
+
+
-
Lên men glucose kị khí
+
+
+
+
-
Phản ứng V-P
+

c
-: 90-100% số chủng phản ứng âm tính
d
-: hầu hết các chủng phản ứng âm tính
Bc: Bacillus cereus
Bt: Bacillus thuringiensis
Bmy: Bacillus mycoides
Ba: Bacillus anthracis
Bme: Bacillus megaterium
7 Hình 1.2. Hình thái tế bào vi khuẩn
Bacillus thuringiensis var.
israelensis

1.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
B. thuringiensis không lên men sinh axit trong môi trường có chứa
đường arabinoza, xyloza, manitol, nhưng tạo axit ở môi trường có chứa
đường glucoza. Có khả năng thuỷ phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát
triển được ở môi trường có chứa 0,001% lysozyme, 7% NaCl với pH=5,7, có
phản ứng với lòng đỏ trứng gà. Không có khả năng khử amin của
phenilalamin, không sử dụng axit xitric, không khử muối sunphat [57].
B. thuringiensis có khả năng sinh trưởng, phát triển ở nhiệt độ dao động
từ 15-45
0
C, nhiệt độ tối ưu là 28-30

kháng thể [3]. Cho đến năm 1999, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết
thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của Bacillus thuringiensis [23].
1.1.7. Đặc điểm phân loại loài phụ Bti
Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) là một loài phụ của loài
vi khuẩn Bacillus thuringiensis, tạo tinh thể hình cầu và hình vuông có
khả năng diệt muỗi và ruồi (hình1.2) [20].
Theo hệ thống phân loại dựa trên cơ sở của 69 typ huyết thanh thì
Bti thuộc typ huyết thanh H14 [42].
Nếu dựa vào cấu trúc di truyền thì đặc điểm quan trọng để phân biệt
loài phụ Bti với các loài phụ khác là thành phần protein tinh thể của
chúng phải chứa các protein 135kDa, 128kDa, 78kDa, 72kDa và 27kDa
(thành phần được xác định bằng phương pháp diện di trên gen
polyacrylamid). Vì các protein này là do các gen cry4 A, B, C, D và cyt
mã hóa, vì vậy sự tồn tại các protein này trong tinh thể đồng nghĩa với
việc tồn tại các lớp gen cry4 (A, B, C, D) và gen cyt trong cấu trúc di
truyền của chúng [23].
1.1.8. Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
Kích thước hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis vào khoảng
2,4-5,7 triệu bp. Trên thế giới người ta đã mô tả được bản đồ cấu trúc gen 9 Hình 1.3. Mô hình cấu trúc chung
của một protein độc tố Cry

tự nhiên cho một số chủng Bacillus thuringiensis [21]. Hầu hết các chủng
Bacillus thuringiensis phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài nhiễm
sắc thể (NST), các nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không

phân loại mới hoàn thiện hơn. Trong khóa phân loại này đã đổi tên một số
protein và thay đổi cách viết tên độc tố và tên gen mã hóa các độc tố đó [27].
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển Bacillus thuringiensis có khả
năng sinh ra 3 loại độc tố diệt côn trùng chính là Cry (crystal -endotoxin),
Cyt (Cytolysin) và Vip (Vegetative Insecticidal Protein). Dựa vào tính tương
đồng của trình tự axit amin của các họ độc tố này lại được chia thành các lớp
khác nhau, cách viết tên độc tố với các bậc cấu trúc đầy đủ được quy ước như
sau; họ độc tố (Cry, Cyt, Vip), số đếm (1,2,3 ), ký tự viết hoa (A, B ), ký tự
viết thường (a, b ), số đếm (1,2,3 ), ví dụ như độc tố Cry25Aa1. Tỷ lệ axit
amin tương đồng để phân chia các lớp độc tố như sau; lớp 1 (Cry1, Cry2 ) có độ
tương đồng dưới 45%, lớp 2 từ 45%-78%, lớp 3 từ 78%-95%, lớp 4 dưới 99%
[20,39]=17,28,47. Ngoài 3 họ độc tố trên Bacillus thuringiensis còn sinh ra một
số độc tố khác như hemolysin, enterotoxin, chitinase, phospholipase [29].
1.1.8.3. Độc tố Cry
Gen cry mã hóa cho các độc tố Cry khác nhau. Đây là gen độc tố quan
trọng nhất của vi khuẩn Bt, tính đặc hiệu diệt côn trùng là do các protein độc
mà nó tạo ra. Năm 2005, người ta đã phát hiện được gen cry khác nhau thuộc
về 47 nhóm ( từ cry1-cry47). Nhưng tính đến năm 2012, thì người ta đã phát
hiện được hơn 607 gen cry khác nhau thuộc về 70 nhóm ( từ cry1 - cry70).
Mỗi nhóm gen lại có những đặc điểm và đặc tính khác nhau [10]. 11

Bảng 1.2: Phân loại gen cry mã hóa các protein độc tố Cry diệt côn trùng

Gen
Hình dạng
tinh thể
Trọng lượng phân

Đa dạng
35 - 129
Đa dạng
a. Cấu trúc chung
Cấu trúc của protein tinh thể đã được làm sáng tỏ nhờ kỹ thuật nghiên
cứu tinh thể bằng tia X với nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc Cry3A và Cry1Aa,
sau đó được mở rộng cho các độc tố khác. Các protein tinh thể có cấu trúc
chung gồm 3 vùng (Domain) (Hình 1.3). Thứ tự các vùng được tính từ đầu N
đến đầu C của chuỗi polipeptid [19, 36].
Vùng 1 có chứa một bó gồm 7 chuỗi xoắn  đối song song (
antiparallel) trong đó chuỗi số 5 được bao bọc bởi các chuỗi còn lại, vùng này
mang đầu N [46].
Vùng 2 có chứa ba tấm  đối song song tạo thành một dạng hình học
topo điển hình gọi là “Greek key”, sắp xếp này cũng được gọi là cuộn lăng
kính  (-prism fold) [54]. Vùng 2 được xem là quyết định tính đặc hiệu liên
quan đến việc gắn độc tố vào màng, cơ chế gắn cho vùng 2 là phức tạp. Các
số liệu đã chỉ ra một sự giống nhau giữa các móc gắn thụ thể của vùng 2 với
các epitop đã biết như là vị trí liên kết kháng nguyên - kháng thể. 12
Vùng 3 có chứa hai cuộn xoắn, các tấm  đối song song tạo thành một
kẹp  (-sandwich) hình học topo gọi là “jelly roll”. Vùng 3 cũng tham gia
vào việc gắn thụ thể [46].
b. Cơ chế tác động
Cơ chế hoạt động của protein Cry của Bacillus thuringiensis liên quan
đến sự hòa tan của tinh thể trong ruột giữa côn trùng, quá trình phân giải
protein của tiền độc tố nhờ protease ruột giữa, sự gắn kết của độc tố Cry với
các thụ thể ruột giữa, sự gắn độc tố vào màng để tạo ra các lỗ hoặc kênh ion
(Hình 4). Tinh thể bao gồm các tiền độc tố, để tiền độc tố trở nên hoạt động

(Dƣới loài Bacillus thuringiensis sinh
độc tố)
Cry1Aa

Lưỡng
tháp
133
kurstaki, sotto, aizawai, entomocidus,
thuringiensis, alesti
Cry1Ab
131
kurstaki, aizawai, entomocidus,
thuringiensis, alesti, darmstadiensis,
tolworthi
Cry 1Ac
133
kurstaki, kenyae
Cry 1B
138
kurstaki, aizawai, entomocidus
Cry 1C
135
aizawai, entomocidus
Cry 1D
133
aizawai, entomocidus, darmstadiensis,
galleriae

israelensis, morrisoni
Cry 4B
128
Cry 4C
Cầu
78
Cry 4D
72 14
- Nhóm Cry1: Gồm 139 protein thuộc các nhóm độc tố Cry1A-Cry1L,
có khối lượng khoảng 130kDa, tích lũy thể vùi dạng hình tháp và thường chỉ
có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ cánh vảy. Gen đầu tiên mã hóa cho
protein nhóm này được Schnepf và cộng sự phát hiện trong Bt. kurstaki từ chế
phẩm Dipel [56].
- Nhóm Cry2: Gồm 21 protein độc tố thuộc nhóm Cry2A. Các protein
nhóm này có khối lượng khoảng 70kDa, có hoạt tính với cả hai loài thuộc bộ
cánh vảy và bộ hai cánh [56].
- Nhóm Cry3: Nhóm này gồm 17 protein thuộc các nhóm Cry3A-
Cry3C, có khối lượng khoảng 73kDa, có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ
cánh cứng [56].
- Nhóm Cry4: Gồm 8 protein thuộc nhóm Cry4A-Cry4B tích lũy cả hai
loại tinh thể có khối lượng khoảng 70kDa và 130kDa. Nhóm này có hoạt tính
với các loài thuộc bộ hai cánh. Những protein này cùng với protein 27kDa do
nhóm cyt1A tổng hợp ra một phức hợp tinh thể tròn [56].
1.1.8.4. Độc tố cyt
Cũng có bản chất là protein và hình thành thể vùi như độc tố Cry,
nhưng tính tương đồng của trình tự axit amin giữa độc tố Cyt và độc tố Cry
hầu như không đáng kể. Độc tố Cyt đầu tiên được Waalwijk phát hiện là

Thời kì đầu khi mới phát hiện ra dưới loài Bti, việc nghiên cứu và ứng
dụng Bti chỉ giới hạn trong lãnh thổ nước Đức, người Đức đã dùng chế phẩm
Bti để kiểm soát ấu trùng muỗi Culex pipiens và Aedes vexans. Chế phẩm này
có tên là Culex
đ
-Bti và nó được sử dụng kết hợp với chủng Bacillus sphaericu
(Becker, 1997)[14].
Sang thập kỉ 80, Bti được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi ở nhiều
nước trên thế giới, đặc biệt là ở các nước nhiệt đới. Vào thời gian này, người
ta đã sử dụng chế phẩm Bti cho việc kiểm soát loài ruồi và muỗi ở 11 quốc 16
gia Tây Phi và đã thu về những kết quả ngoài mong đợi (Hougard et al.,
1997).  Brazil, chế phẩm Bti cũng được sử dụng để thay thế cho thuốc trừ
sâu hóa học (Mardini et al., 1999).  Trung Quốc, Bti đã chứng tỏ vai trò của
mình trong việc giảm dịch bệnh sốt rét (Becker, 1997) [14].
Chế phẩm Bti có tác dụng tốt trong môi trường nước sạch, nước không
tù đọng hoặc nước có nồng độ muỗi thấp. Các chế phẩm này được tổ chức y
tế thế giới (W.H.O) khuyến cáo sử dụng để diệt trừ các vectơ truyền bệnh: sốt
rét, sốt xuất huyết, viên não Nhật Bản là những bệnh thường xuất hiện thành
dịch lớn do muỗi lây truyền ở các nước nhiệt đới.
1.2.1. Tinh thể độc của Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti)
Tinh thể độc của Bti có dạng hình cầu (trứng) có kích thước khoảng
0,71,2 m có hoạt lực đặc hiệu với côn trùng bộ 2 cánh (Diptera). Người ta
đã xác định thành phần protein của Bti bằng phương pháp điện di trên gel
polyacrylamid (PAGE) theo đó tinh thể độc của Bti bao gồm các protein có
trọng lượng phân tử là 135 kDa, 128 kDa, 78 kDa, 72 kDa và 27 kDa do các
gen cryIV A, B, C, D và cyt mã hoá [22]. Các độc tố này có cấu trúc và phổ
diệt côn trùng khác nhau [28, 49].