Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn


TRẦN THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG NHÂN GIỐNG
IN VITRO LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM SONIA)
VÀ GIÁ THỂ ĐƢA CÂY RA NGOÀI TỰ NHIÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
THÁI NGUYÊN, NĂM 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TRẦN THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG NHÂN GIỐNG
IN VITRO LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM SONIA)
VÀ GIÁ THỂ ĐƢA CÂY RA NGOÀI TỰ NHIÊN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN THỊ TÂM

THÁI NGUYÊN, NĂM 2012
i
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ

MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Vài nt v phân loi và đc đim của phong lan 3
1.1.1. Đc đim thc vt học ca họ lan 3
1.1.2. Đc đim thc vt học ca chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) 4
1.1.3. Đc dim thc vt học ca lan Dendrobium Sonia 4
1.2. Ứng dụng của k thuật nuôi cấy mô t bào thực vật trong công tc
nhân giố ng cây trồ ng 5
1.2.1. Cc hưng nghiên cu ng dng 5
1.2.2. Ưu thế củ a nhân giố ng in vitro 6
1.2.3. Cc phương thc nhân ging in vitro 6
1.2.4. Quy trì nh nhân giố ng in vitro 8
1.3. Mộ t số nghiên cứu nhân giố ng lan bằng k thuật nuôi cấy in vitro 9
1.3.1. Cc nghiên cu trong nưc 9
1.3.2. Cc nghiên cu ca nưc ngoài 11
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Vậ t liệ u 13
2.2. Phƣơng phá p nghiên cƣ́ u 14
2.2.1. Phương php pha môi trường và nuôi cấy 15
2.2.2. Nghiên cu môi trường nuôi cấy 16
2.2.3. Phương php ra cây 17
2.2.4. Phương php tính ton kết quả 18
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19
3.1. So snh ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy MS và Phytamax tới sự
pht sinh chồi và to protocorm lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 19
3.2. Ảnh hƣởng của cc chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm cytokinin
tới sự pht sinh chồi và to protocorm lan Hoàng Thảo (Dendrobium
Sonia) 20
iii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
iv
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần cơ bản ca môi trường MS 13
Bảng 2.2. Thành phần cơ bản ca môi trường Phytamax 14
Bảng 3.1. So snh ảnh hưởng ca môi trường MS và Phytamax ti s pht sinh chồi
và tạo protocorm ở lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 19
Bảng 3.2. Ảnh hưởng ca BAP ti s pht sinh chồi và tạo protocorm ở lan Hoàng
Thảo (Dendrobium Sonia) 22
Bảng 3.3. Ảnh hưởng ca kinetin ti s pht sinh chồi và tạo protocorm ở lan
Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 25
Bảng 3.4. Ảnh hưởng ca α-NAA ti s pht sinh rễ ở lan Hoàng Thảo
(Dendrobium Sonia) 27
Bảng 3.5. Ảnh hưởng ca IAA ti s pht sinh rễ ở lan Hoàng Thảo
(Dendrobium Sonia) 29
Bảng 3.6. Ảnh hưởng ca IBA ti s pht sinh rễ ở lan Hoàng Thảo
(Dendrobium Sonia) 31
Bảng 3.7. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và α-NAA ti s
sinh trưởng ca lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 33
Bảng 3.8. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IAA ti s
sinh trưởng ca lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 34
Bảng 3.9. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IBA ti s
sinh trưởng ca lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 37
Bảng 3.10. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và α-NAA ti
s sinh trưởng ca lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) 39
Bảng 3.11. Ảnh hưởng ca tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IAA 40


vi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

α-NAA
ABA
BAP
IAA
IBA
KC
MS
RE
VW
α-naphthaleneacetic axit
Abscisic axit
Benzylamino purine
Indol axetic axit
Indol butyric axit
Knudson C
Murashige and Skoog
Robert Ernst
Vacin and Went

cc mô hnh trồng lan Hoàng Thảo lai (Dendrobium hybrids) tại miền Bắc Việt
Nam nhằm phc v nhu cầu ngày càng ln ca thị trường. Trong nhóm lan
Dendrobium thì Dendrobium Sonia (Dendrobium Gracia Lewis × Dendrobium
2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Lady Constance) là loài ch lc đ trồng nhằm mc đích cắt cành. Chính v vy, đề
tài chọn Dendrobium Sonia là vt liệu nghiên cu.
Xuất pht từ yêu cầu thc tế khch quan đó và đ góp phần pht trin ngành
nuôi trồng lan Hoàng Thảo có hiệu quả, chúng tôi tiến hành nghiên cu đề tài:
“Nghiên cứ u môi trường nhân giống in vitro lan Hoàng Thảo (Dendrobium
Sonia) và giá thể đưa cây ra ngoài tự nhiên”
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Xác định được môi trường ti ưu trong nhân ging in vitro lan Hoà ng Thảo
Dendrobium Sonia.
- Xác định được gi th thí ch hợ p đ đưa cây lan Hoàng Thảo Dendrobium
Sonia từ trong ố ng nghiệ m ra môi trườ ng t nhiên.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cu ảnh hưởng ca môi trường cơ bản MS và Phytamax đến s sinh
trưởng ca lan Hoàng Thảo
- Nghiên cứ u ảnh hưởng ca chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin
đến s pht sinh chồi và s sinh trưởng ca lan Hoàng Thảo.
- Nghiên cứ u s ảnh hưởng ca chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin
đến pht sinh rễ và tạo cây hoàn chỉnh.
- Nghiên cứ u ả nh hưở ng củ a tổ hợ p cá c chấ t kích thí ch sinh trưở n g thuộ c
nhóm auxin và nhóm cytokinin lên sự sinh trưở ng củ a lan Hoà ng Thả o.
- Nghiên cu tm ra loại gi th thích hợp nhất cho ra cây lan Hoàng Thảo (xơ
dừ a, tảo, than củ i …).
các loài Ascocentrum miniatum, Aecides multiflora và có th cao 3 - 4m như cc loài
Papilionantheteres, Archinis hoc khổng lồ như A campe, A. vanilla Thân thường
mang rễ và l. Ở nhóm đơn thân, rễ và l thường mọc theo hai chiều thẳng góc vi
nhau. Cành hoa cũng xuất hiện trên thân từ cc nch l, cành hoa thường mọc song
song vi l và thẳng góc vi rễ [9].
4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1.1.1.3. Lá lan
L ca lan là l đơn nguyên, dầy cng hay cũng có dạng mềm có gân ở giữa
nổi rõ, có loài l biến đổi thành vẩy hoc tiêu biến hoàn toàn. L mọc đơn độc hoc
xếp dày đc ở gc, hay xếp cch đều đn trên thân, c giả Hnh dạng l thay đổi
rất nhiều, từ loại l mọng nưc, nạc, dài hnh kim, hnh tr dài, tiết diện dài hay có
rãnh đến loại l hnh phiến mỏng, dài màu xanh bóng đm hay nhạt tuỳ theo vị trí
sng ca cây. Đc biệt rất hiếm loại l hnh tròn thuôn dài thành bẹ ôm lấy thân.
Phiến l trải rộng hay gấp lại theo cc gân vòng cung [9].
1.1.1.4. Hoa lan
Hoa lan thuộc hoa lưỡng tính rất hiếm gp loài đơn tính, bao hoa có dạng cnh
xếp thành hai vòng. Hoa lan có 3 cnh đài, thường có cùng màu sắc và kích thưc. Tuy
nhiên các loài lan khác nhau thì cnh đài có hnh dạng biến đổi rất khc nhau. Dạng
hnh tròn như cc ging Vanda, Ascocentrum, nhọn như Cattleya, xoắn như các loài
thuộc ging Laelia. Có khi hai l đài thấp nằm ở hai bên dính lại thành một như chi
Oncidium [1],[3].
1.1.2. Đc đim thực vậ t họ c củ a chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium)
Hoàng Thảo là những loài lan sng bm trên cây hay đ, mọc thành bi
nhiều hành giả. Cc giả hành có th phân thành cc đt như cây tre. Nhiều loài có
rãnh dọc theo giả hành. Rễ thuộc loại rễ chùm, có màu trắng và nhỏ hơn rễ ca một
s loài lan khc, rễ có khả năng ti sinh mạnh, khả năng hút nưc và dinh dưỡng tt.
Rễ lan Hoàng Thảo nhỏ, tp trung ở gc do đó cần giữ ẩm cho rễ.
Hoàng Thảo có thân dài, được tạo bởi cc đt, trên cc đt có bẹ l bao bọc,

phân sinh củ a cây . Theo cá c công trì nh thí nghiệ m củ a Amato (1977), chỉ có đỉnh
sinh trưở ng củ a chồ i mớ i đả m bả o s ổn định về di truyền, tiế p đế n là mô phân sinh
vớ i kí ch thướ c nhỏ , kế t hợ p vớ i xử lý nhiệ t để là m sạ ch bệ nh là nguyên liệ u tố t cho
nhân giố ng.
Kỹ thut nhân nhanh được ng dng nhằm phc v cho cc mc đích chính
như: duy trì và nhân nhanh cá c kiể u gen quý hiế m , làm vt liệu cho công tc chọn
6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

giố ng; duy trì và nhân nhanh cá c cá thể đầ u dò ng để cung cấ p hạ t giố ng cho cá c loạ i
cây trồ ng khá c nhau như cây lương thự c có củ , cây rau, cây cả nh ; nhân nhanh ở
điề u kiệ n vô trù ng cá ch ly tá i nhiễ m kế t hợ p vớ i việ c là m sạ ch bệ nh virut , rút ngắn
thờ i gian đưa cá c cây lai và cá c cây tự nhiên có đặ c điể m tố t ; bảo quản tt tp đoàn
giố ng vô tí nh về cá c loà i cây giao phấ n trong ngân hà ng gen [2], [16].
1.2.2. Ƣu thế củ a nhân giố ng in vitro
Hệ s nhân cao , rút ngắn thời gian đưa ging vào sản xuất . Từ mộ t cây trong
vòng 1-2 năm có thể tạ o thà nh hà ng triệ u cây . Nhân đượ c số lượ ng cây lớ n trong
mộ t diệ n tí ch nhỏ , trong 1m
2
có th đ 18000 cây [16], [18].
Làm sạch bệnh cây trồng và cch ly chúng vi nguồn bệnh , v vy đả m bả o
giố ng sạ ch bệ nh ; thuậ n tiệ n trong vậ n chuyể n và bả o quả n (cây giố ng giữ ở 4
0
C
trong hà ng thá ng vẫ n cho tỷ lệ số ng 95%). Đồng thời, có th sản xuất quanh năm
mà không phụ thuộ c và o mù a vụ , có tiềm năng công nghiệp ho cao [18].
1.2.3. Cc phƣơng thức nhân giống in vitro
1.2.3.1. Nuôi cấ y mô phân sinh hoặ c đỉnh sinh trưở ng
Theo Lê Trầ n Bì nh (1997), mô phân sinh nuôi cấ y là mẫ u vậ t nuôi cấ y đượ c
tch từ đỉnh sinh trưởng có kích thưc trong vòng 0,1mm tí nh từ chó p củ a chó p

trưở ng là bộ phậ n dễ nuôi cấ y thà nh công , cc bộ phn còn lại ca cơ th thc vt
đều có th thc hiện cho việ c nhân giố ng in vitro đượ c. Cc bộ phn đó là : đoạ n
thân ở cá c đố i tượ ng như ở thuố c lá , cam, chanh, ; mảnh l ở thuc l, cà chua, bắ p
cải ; cuố ng lá ở Nacissus; cc bộ phn ca hoa như súp lơ , lúa m và nhnh củ ở
hành tỏi [2].
1.2.3.3. Nhân giố ng qua giai đoạ n mô sẹ o
Trong khuôn khổ củ a mụ c đích nhân giố ng vô tí nh , nế u tá i sinh đượ c cây hoà n
chỉnh trc tiếp từ mẫu vt ban đầu th không những nhanh chóng thu được cây mà
cũng kh đồ ng đề u về mặ t di truyề n . Tuy nhiên, trong nhiề u trườ ng hợ p mô nuôi
cấ y không tá i sinh ngay mà phá t triể n thà nh khố i mô sẹ o . Tế bà o mô sẹ o khi cấ y
chuyể n nhiề u lầ n sẽ không ổ n đị nh về mặ t di truyề n . Do đó , nhấ t thiế t phả i sử dụ ng
mô sẹ o v ừa pht sinh (mô sẹ o sơ cấ p ) th mi thu được cây ti sinh đồng nhất . V
vậ y, ngườ i ta chỉ tiế n hà nh nhân giố ng qua giai đoạ n mô sẹ o đố i vớ i nhữ ng đố i
tượ ng khó tá i sinh cây trự c tiế p. Thông qua giai đoạ n mô sẹo có th thu được những
cây sạ ch virus [2].
8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1.2.4. Quy trì nh nhân giố ng in vitro
1.2.4.1. Chuẩ n bị cây là m vậ t liệ u gố c
V trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang nhữ ng đặ c tí nh và tí nh trạ ng củ a
cây mẹ ban đầ u nên trong giai đ oạn này cần chọn lọc cây mẹ cẩn thn , cây mẹ
thườ ng là cây có nhiề u đặ c tí nh ưu việ t , khoẻ, có gi trị kinh tế cao. Sau đó , chọn cơ
quan để lấ y mẫ u thườ ng là mô non , đoạ n thân có chồ i ngủ , l non hoc hoa non
Mô chọ n đ nuôi cấy thường là mô có khả năng ti sinh cao trong môi trường nuôi
cấ y sạ ch bệ nh , giữ đượ c cá c đặ c tí nh sinh họ c quý củ a cây mẹ , ít nguy cơ biến dị .
Tuỳ theo điều kiện, giai đoạ n nà y có thể ké o dà i 3-6 thng [16].
1.2.4.2. Thiế t lậ p hệ thố ng cấ y vô trù ng
Là giai đoạn chuyn mẫu vt từ ngoài vào môi trường nuôi cấy đ tạo nguyên
liệ u sạ ch bệ nh cho nhân giố ng, giai đoạ n nà y đượ c tiế n hà nh theo cá c bướ c:

đị nh đả m bả o cho sinh trưở ng , pht trin bnh thường ngoài t nhiên , ngườ i ta mớ i
tiế n hà nh giai đoạ n tiế p theo là đưa cây ra ngoà i môi trườ ng tự nhiên [16].
1.2.4.5. Chuyể n cây ra đấ t trồ ng
Đây là giai đoạ n đầ u cây đượ c chuyể n từ điề u kiệ n vô trù ng trong ố ng nghiệ m
ra ngoà i môi trườ ng tự nhiên . Giai đoạ n nà y quyế t đị nh khả năng ứ ng dụ ng củ a quy
trnh nhân ging in vitro. Đa số cá c loà i cây trồ ng chỉ sau khi chồ i đã ra rễ tạ o thà nh
cây hoà n chỉ nh vớ i kích thướ c nhấ t đị nh mớ i đượ c huấ n luyệ n và chuyể n ra ngoà i
vườ n ươm. Cây nuôi cấ y in vitro đượ c sinh trưở ng và phá t triể n trong nhữ ng điề u
kiệ n tố i ưu về nhiệ t độ , độ ẩ m, pH, dinh dưỡ ng V vy, trướ c khi đưa ra trồ ng ,
ngườ i ta cầ n huấ n luyệ n cây để thí ch nghi vớ i điề u kiệ n tự nhiên . Qu trnh thích
nghi vớ i điề u kiệ n bên ngoà i củ a cây ở giai đoạ n đầ u yêu cầ u cầ n đượ c chăm só c
đặ c biệ t. V vy, cây đượ c chuyể n từ môi trườ ng từ bã o hoà hơi nướ c sang vườ n
ươm vớ i nhữ ng điề u kiệ n khó khăn hơn , nên vườ n ươm cầ n phả i đá p ứ n g cá c yêu
cầ u: che cây non bằ ng nilon và có hệ thố ng phun sương cung cấ p độ ẩ m và là m má t
cây; gi th trồng cây có th là đất mùn , hoặ c cá c hỗ n hợ p nhân tạ o không chứ a đấ t ,
mùn cưa và bọt bin Giai đoạ n nà y đò i hỏ i 4-16 tuầ n [16].
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN BẰNG KỸ THUẬT NUÔI
CẤY IN VITRO
1.3.1. Cc nghiên cứu trong nƣớc
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Ngày nay phương php nuôi cấy mô tế bào thc vt không chỉ được s dng
trong nghiên cứ u mà cò n đượ c á p dụ ng rộ ng rã i vào thc tiễn chọn ging, không chỉ
ở cây ngũ cc mà còn ở cây rau, cây ăn quả , và đc biệt là hoa cây cảnh.
Nuôi cấy mô và tế bào thc vt phc v nhân ging cây trồng đã trin khai
trên 20 năm ở nưc ta. Nhân ging thương mại quy mô ln đã đạt được ở một s
cây trồng như nhân nhanh chui, nhân nhanh khoai tây sạch bệnh, nhân nhanh cc
ging mía nhp nội… Quy trnh công nghệ nhân nhanh ging chui và ging mía đã
được Bộ Nông nghiệp và Pht trin Nông thôn công nhn và p dng đ chuyn gen

sung saccharose 20g/l, agar 8,0g/l, nưc dừa 15% và NAA 1,0mg/l là thích hợp cho
tạo rễ ca chồi in vitro [13].
Nghiên cu môi trường nhân ging in vitro ging lan Dendrobium
fimbriatum Hook. (Lan Hoàng Thảo Long nhãn), Nguyễn Thị Sơn (2011) đã khẳng
định môi trường thích hợp cho nảy mầm và pht sinh protocorm ca hạt là môi
trường MS, bổ sung nưc dừa 100ml/l, saccharose 10g/l, agar 6,0g/l; Môi trường
nhân nhanh protocorm tt nhất là môi trường Knud, bổ sung nưc dừa 100ml/l,
saccharose 10g/l, khoai tây 60g/l, agar 6,0g/l; Môi trường MS, bổ sung nưc dừa
100ml/l, saccharose 20g/l, chui chín 60g/l, agar 6,0g/l là thích hợp nhất cho nhân
nhanh chồi in vitro; Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là môi trường RE, bổ sung
saccharose 10g/l, than hoạt tính 1,0g/l, agar 6,0g/l [14].
Nguyễn Quang Thạch và cộng s (2003) đã tiến hành nghiên cu xây dng
quy trnh nhân ging và nuôi trồng phong lan Phalaenopsis (lan Hồ Điệp). Ging
lan Hồ Điệp được kh trùng bằng HgCl
2
, sau đó được cấy lên môi trường nhân
nhanh. Kết quả đã đưa ra được quy trnh nhân ging và nuôi trồng lan Hồ Điệp [15].
1.3.2. Các nghiên cứu của nƣớc ngoài
Wang (1997) đã nghiên cu s nở hoa ca ging lan Dendrobium candidum
được tạo ra bằng phương php nuôi cấy in vitro. Kết quả cho thấy, việc bổ sung
spermidine, BAP, hoc s kết hợp ca NAA và BAP môi trường nuôi cấy có th
tăng khả năng tạo protocorm và chồi hoa trong vòng 3-6 thng vi tần s 31,6% -
45,8%. Tần s nở hoa tăng lên 82,8% trưc khi bổ sung ABA vào môi trường nuôi
cấy, sau đó chuyn protocorm vào môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP [37].
Xu, Liu và cộng s (2001) nghiên cu môi trường nuôi cấy in vitro ging lan
Dendrobium chrysotoxum và kết lun: phôi Dendrobium chrysotoxum có th nảy
mầm được trong điều kiện có hoc không có nh sng. Da trên môi trường MS, bổ
sung NAA 0,5mg/l, BAP 1mg/l cho hiệu quả nảy mầm cao [34].
12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn


13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Vật liệu thực vật
Giố ng lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) do phò ng Công nghệ tế bà o thự c
vậ t - Việ n Di truyề n Nông nghiệ p cung cấ p.
2.1.2. Hóa chất và thit bị
* Hóa chất
Cc chất kích thích sinh trưởng, đường saccharose, agar, than hoạt tính, nưc
dừa, khoai tây.
Nuôi cấy được tiến hành trên nền môi trường MS và môi trường Phytamax.
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản ca môi trường MS
STT
Thành phần
Nồng độ (mg/l)
MS1
1
CaCl
2
440
MS2
2
KH
2
PO
4
170

.4H
2
O
22,3
9
ZnSO
4
.7H
2
O
8,6
10
CoCl
2
.5H
2
O
0,025
11
CuSO
4
.5H
2
O
0,025
12
Na
2
MoO
4

19
Myo-inositol
100
(Nguồn: Lê Trần Bnh, 1997) [2].

14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 2.2. Thành phần cơ bản ca môi trường Phytamax
STT
Thành phần
Nồng độ (mg/l)
1
Peptone
2000
2
Mes
1000
P1
3
CaCl
2
166
P2
4
KH
2
PO
4
85,5

.4H
2
O
8,45
11
ZnSO
4
.7H
2
O
5,3
12
CoCl
2
.5H
2
O
0,0125
13
CuSO
4
.5H
2
O
0,0125
14
Na
2
MoO
4

(Nguồn: Lê Trần Bnh, 1997) [2].
* Dụng cụ
Bnh tam gic, pipet, cc thy tinh định mc.
Bông, giấy làm nút, giấy thấm.
Bình tam giác 250ml.
Bộ đồ cấy gồm: dao cấy, que cấy, đĩa cấy…
Buồng cấy vô trùng (Biological Safety Cabinets) ca hãng Nuarie, Mỹ.
Nồi kh trùng (Auto Clace) ca hãng ToMy, Nht bản.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Quy trnh nghiên cu được tóm tắt theo sơ đồ sau: 15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn


 Khi nưc gần sôi (50-70
0
C) th đổ agar khuấy đều cho tan, sau đó cho
đường và than hoạt tính vào khuấy tan hết.
 Bổ sung dung dịch hóa chất đã chuẩn bị ở cc thy tinh khi nưc sôi.
 Định lượng hỗn hợp dung dịch trên bằng nưc cất cho đ 1 lít.
 Chuẩn độ pH ca hỗn hợp dung dịch trong khoảng 5,5 – 5,8.
 Chia đều hỗn hợp dung dịch nuôi cấy cho cc bnh tam gic, mỗi bnh
50ml môi trường. Sau đó nút bông và làm nắp bằng giấy, đy kín.
 Kh trùng trong nồi kh trùng ở nhiệt độ 120
0
C, p suất 1-1,2atm, trong
thời gian 20 phút. Trong qu trnh lấy môi trường ra khỏi nồi hấp th lắc nhẹ bnh
tam gic cha môi trường nuôi cấy đ than hoạt tính tan đều trong môi trường. Sau
khi hấp kh trùng xong đ môi trường 2-3 ngày th bắt đầu s dng.
2.2.1.2. Phương pháp nuôi cấy
Trưc khi tiến hành nuôi cấy, cần kh trùng box cấy bằng đèn UV trong thời
gian 30-60 phút, kh trùng bộ cấy bằng cch đt trên ngọn la đèn cồn, sau đó đ
nguội,
Cm chồi lan được lấy từ bnh ging ra, tch thành từng cm nhỏ đường
kính 0,5-1cm, cc cm chồi này được cấy bằng que cấy vào môi trường nhân ging.
B trí thí nghiệm vi cc công thc môi trường tùy từng mc đích nghiên cu. Bnh
nuôi cấy được đt trong nhà nuôi cấy vi cường độ nh sng 2000lux, thời gian
chiếu sng 10/24 giờ, nhiệt độ 25-27
0
C.
2.2.2. Nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy
Đ tm ra môi trường nuôi cấy ti ưu cho nhân nhanh và tạo rễ lan
Dendrobium Sonia, chúng tôi b trí cc thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy.
Đầu tiên, chúng tôi tiến hành nghiên cu s ảnh hưởng ca môi trường MS

đưa cây trồng ngoài t nhiên bằng cch đ cc bnh cây ra nơi có nh sng khuếch
tán 2-3 ngày trưc khi đưa cây ra khỏi bnh.
Khả năng sng ca cây khi chuyn từ trong ng nghiệm ra vườn ươm quyết
định hiệu quả kinh tế ca phương php nhân ging in vitro. Do đó, một quy trnh ra
cây đạt hiu quả cao có ý nghĩa rất ln.
2.2.3.1. Đưa cây ra ngoài môi trường
Cc bnh cây được mở nút, cho nưc vào ngâm 10-15 phút, sau đó lắc nhẹ
cho thạch rời ra khỏi cây, dùng panh nhẹ nhàng gắp cây ra khỏi bnh, c gắng đ
cây được nguyên vẹn không bị dp nt.
Ngâm cây trong chu nưc sạch, sau đó ra dưi vòi nưc chảy cho hết
thạch bm vào bộ rễ ca cây.