1
Trường ĐH Nông Lâm Huế
Khoa Sinh học
CÁC PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU SINH HỌC
PHÂN TỬ
Lớp: Nuôi Trồng Thủy Sản 46
Sinh viên thực hiện:
1. Cung Đình Đạt
2. Nguyễn Lương Mãn
3. Nguyễn Quốc Đạt A
4. Hoàng Văn Đại
5. Phạm Thị Hoài
6. Đỗ Viết Bi
7. Diệp Thị Vinh
2
Nội dung:
Khái niệm chung về sinh học phân tử
Phương pháp tách chiết acide nucleic
Phương pháp tách chiết ARN
Phương pháp điện di
Phương pháp ly tâm
Mẫu dò và các phương pháp đánh dấu
Phương pháp lai phân tử
Phương pháp sắc ký
Kỹ thuật Western blot
Phương pháp PCR
3
1
Khái niệm chung về sinh học phân tử
1. Định nghĩa:

tìm hiểu
liên hệ và tương tác
giữa các phân tử DNA,
RNA, quá trình tổng
hợp protein cũng như
tìm hiểu cơ chế điều
hòa những mối tương
tác này
4
1
Phương pháp tách chiết acide nucleic
Bước 1: Phá bỏ tế bào và màng nhân
Dùng máy nghiền tế bào trong hỗn hợp chất tẩy
cùng với enzyme protease. Kết quả là giải phóng
ADN ở trạng thái tự do vào môi trường
Bước 1: Phá bỏ tế bào và màng nhân
Dùng máy nghiền tế bào trong hỗn hợp chất tẩy
cùng với enzyme protease. Kết quả là giải phóng
ADN ở trạng thái tự do vào môi trường
Bước 3: kết tủa acide nucleic
Trong môi trường có nồng độ muối và ethanol cao ở nhiệt
độ thấp thì acide nucleic bị kết tủa. Dùng máy ly tâm để
thu nhận acide nucleic và làm tinh sạch chúng
Bước 2: Loại bỏ tạp chất
Mẫu được lắc mạnh trong hỗn hợp phenol và
chioroform. Sau đó dùng máy ly tâm tách protein
ra khỏi hỗn hợp.
5
Quy vtrinhf tách chiết ADN
MẪU

Quy trình tách chiết ARN
Mẫu
Cố định mẫu bằng N2 lỏng
Mẫu mất hoạt tính ezyme
Nghiền với hỗn hợp chất tẩy
Lọc
Dịch Bã ( bỏ đi)
Phenol-chlorofrom
Ly tâm 3000g/10’
Dịch Tủa( bỏ đi)
cho vào ngâm trong dd
ancol 96o + axetat Na 1 M
ở 24oC, trong 24 giờ
Ly tâm 3000g/10’
Tủa ARN Dịch( bỏ đi)
8
Từ ARN thu được được nói trên, tiếp tục tách thành các loại ARN khác nhau
như sau:
Tủa ARN
NaCl 0,3%
Sắc ký cột oligo-T-celluase
mARN hấp thụ trên cột
rARN + Tarn không được hấp thụ
Phản hấp thụ
alcol96oC , ở 20oC, trong 2
giờ
mARN Kết tủa
Ly tâm 3000g/10’
Tủa
Dịch( bỏ đi)

11
Điện di trên gel polyarylamide
-
Điện di theo phương thẳng đứng.
Điện di theo phương thẳng đứng.
-
Độ phân giải cao.
Độ phân giải cao.
-
Phương pháp phát hiện : DNA – phóng xạ tự ghi xanh
Phương pháp phát hiện : DNA – phóng xạ tự ghi xanh
methylene , ethydium bromide, protein xanh coomassie,
methylene , ethydium bromide, protein xanh coomassie,
nhuộm nitrate bạc.
nhuộm nitrate bạc.
-
ứng dụng: tinh sạch các oligonucleotit tổng hợp, xác định
ứng dụng: tinh sạch các oligonucleotit tổng hợp, xác định
trình tự DNA, tách các trình tự DNA có kích thước gần bằng
trình tự DNA, tách các trình tự DNA có kích thước gần bằng
nhau, SDS-page ( phân tách protein).
nhau, SDS-page ( phân tách protein).
Độ nhạy của phương pháp nhuộm trên gel polyacrylamide biến tính
6%. Kích thước mỗi giếng là 5mm
2
.
12
PHƯƠNG PHÁP LY TÂM
4
- Ly tâm phân đoạn bằng CsCl là phương pháp đang được sử dụng

đột ngột thì sự bắt cặp không diễn ra.
6.2 Đặc điểm của lai phan tử:
- Đặc hiệu tuyệt đối: là sự bắt cặp chỉ xãy ra giữa 2 mạch có
trình tự hoàn toàn bổ sung nhau.
- Các trình tự bổ sung có thể là AND hoặc ARN dẫn đến sự
hình thành các phân tử AND-AND,ARN-ARN hoặc lai AND-
ARN.
6.3 Các yếu tố ảnh hưởng:
- Các yếu tố ảnh hưởng: Nồng độ AND và thời gian phản
ứng, nhiệt độ, độ dài phân tử, lực ion trong môi trường….
17
Southern
blot
Southern
blot
Lai trong
pha rắn
Lai trong
pha rắn
Lai trong
pha lỏng
Lai trong
pha lỏng
Northern
blot
Northern
blot
Dot và slot
blot
Dot và slot

-
Đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ.
-
Đánh dấu bằng phương pháp hóa học.
21
7.2 Các phương pháp đánh dấu.
7.2.1 Phương pháp Nick - translation
Nguyên tắc: sử dụng AND ase I để cắt phân tử AND ở
những vị trí khác nhau để tạo ra những lỗ thũng phân
bố ngẫu nhiên trên cả 2 mạch. Kết quả là tạo ra phân tử
AND được đánh dấu trên suốt chiều đà phân tử.
7.2.2 Phương pháp Random priming ( thiết lập mồi ngẫu
nhiên)
Mô tả phương pháp: Mẫu dò được gây biến tính bằng
nhiệt độ cao, sau đó làm lạnh đột ngột. Sau đó thêm vào
phản ứng 1 hỗn hợp các oligonucleotide nhân tạo.
Kết quả: mạch mới được tổng hợp cũng trở thành mạch
được đánh dấu.
7.2.3 phương pháp đánh dấu các oligonucleitide
Các oligonucleotide được tổng hợp dưới dạng mạch
đơn, sau đó được đánh dấu ở dầu 5’ nhờ ezyme T4-
polynucleotide kinase với sự có mặt của một nucleotide
đánh dấu.
22
Kỹ thuật Western blot
8
- Kỹ thuật SDS-PAGE
-Là kỹ thuật điện di trên polyacrylamide gel với
sự có mặt của SDS.
-Cho phép phân tách các phân tử protein có

cộng sự phát minh năm 1985. Đây là phương pháp tạo
dòng in vitro không cần sự có mặt của tế bào.
-Mục đích phương pháp: Để nhân DNA nhiều lần trong ống
nghiệm.
-Để thực hiện được phương pháp này cần có:
- Phân tử DNA cần nhân lên.
- Hai DNA mồi (primers), mỗi mồi gồm khoảng 20 đôi base,
hai mồi này gắn ở hai đầu của phân tử DNA cần nhân lên:
mồi ngược và mồi xuôi.
- 4 loại nucleotid (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
- Taq polymerase: enzym polymerase có tính chịu nhiệt
độ cao, enzym này được tách chiết từ loài vi khuẩn
Thermus aquaticus .