S
ố hóa bởi Trung tâm Học liệu ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
HOÀNG THỊ XOAN
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmDREB2 PHÂN
LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƢƠNG Glycine max (L.) Merrill LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2013 S
ố hóa bởi Trung tâm Học liệu

i

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ
nguồn gốc.
Tác giả

Hoàng Thị Xoan


MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan
i
Lời cảm ơn
ii
Mục lục
iii
Những chữ viết tắt trong luận văn
v
Danh mục các bảng trong luận văn
vi
Danh mục các hình trong luận văn
vii
MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu 3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG 4
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và vị trí cây đậu tƣơng 4
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng 5
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và ở Việt Nam 7
1.2. GEN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 9
1.2.1. Hạn và tác động hạn đến sinh trƣởng phát triển của thực vật 9
1.2.2. Đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng 11
1.2.3. Một số gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tƣơng 13
1.2.3.1. Nhóm gen chức năng liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn của cây
đậu tƣơng 13
1.2.3.2. Nhóm gen điều khiển quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn 16

3.2.1. Tách chiết DNA từ lá non hạt đậu tƣơng 39
3.2.2. Kết quả nhân gen GmDREB2 bằng kỹ thuật PCR 40
3.2.3. Kết quả tách dòng và giải trình tự gen GmDREB2 41
3.2.4. So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB2 của ba giống đậu
tƣơng BS, BG, HG1 và các trình tự đã công bố 43

S
ố hóa bởi Trung tâm Học liệu

v
3.2.5. So sánh trình tự amino acid của protein DREB2 của ba giống đậu
tƣơng BS, BG, HG1 và các trình tự đã công bố 45
3.3 PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ
TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA GEN DREB2 Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG 45
3.3.1. Sự đa dạng của các giống đậu tƣơng trên cơ sở phân tích trình tự
nucleotide của gen DREB2 45
3.3.2. Phân tích sự đa dạng trong trình tự amino acid của DREB2 48
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 S
ố hóa bởi Trung tâm Học liệu

vi
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABA
Abscisis acid


S
ố hóa bởi Trung tâm Học liệu

vii
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng
Tên bảng
Trang
Bảng 1.1
Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ 2005- 2011
8
Bảng 2.1
Nguồn gốc các giống đậu tƣơng nghiên cứu
25
Bảng 2.2
Danh mục các thiết bị đã sử dụng
27
Bảng 2.3
Trình tự cặp mồi nhân gen DREB2
30
Bảng 2.4
Thành phần phản ứng PCR
31
Bảng 2.5
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
31
Bảng 2.6

Trang
Hình 1.1
Sơ đồ mô tả gen và vùng mã hóa của gen GmDREB2 ở
đậu tƣơng
23
Hình 1.2
Sơ đồ mô tả protein GmDREB2 ở đậu tƣơng
23
Hình 1.3
Trình tự amino acid của vùng AP2 của protein DREB2 ở
đậu tƣơng
23
Hình 2.1
Hình ảnh hạt các giống đậu tƣơng nghiên cứu
26
Hình 2.2
Sơ đồ vector tách dòng pBT
33
Hình 3.1
Hình ảnh cây đậu tƣơng non của 7 giống đậu tƣơng hạn
trƣớc khi gây hạn
36
Hình 3.2
Hình ảnh cây đậu tƣơng non của 7 giống đậu tƣơng sau 7
ngày hạn
37
Hình 3.3
Hình ảnh điện di DNA tổng số của 4 giống HG1, BG,
HG4 và BS
39

Biểu đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền của 11
giống đậu tƣơng dựa trên mức độ tƣơng đồng của trình
tự gen GmDREB2
47
Hình 3.11
Biểu đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền của 11
giống đậu tƣơng dựa trên mức độ tƣơng đồng của trình
tự amino acid của protein DREB2
49

1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill ) là loại cây trồng thuộc họ đậu,
không chỉ có vai trò quan trọng về mặt kinh tế và dinh dƣỡng mà còn có vai
trò quan trọng trong việc cải tạo đất. Trong hạt đậu tƣơng có hàm lƣợng dinh
dƣỡng cao, chứa 35% - 52% protein, 18% - 25% lipit, 10% – 15% glucid và
nhiều loại amino acid không thay thế nhƣ: leucin, isoleucin, lysin, metionin,
phenylalanin, tryptophan, valin. Ngoài ra, trong hạt đậu tƣơng còn chứa nhiều
vitamin (B1, B2, A, D, E, K…) là thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao, rất
cần thiết cho cơ thể ngƣời và động vật. Đặc biệt, protein của đậu tƣơng đƣợc
coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lƣợng đáng kể các
amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể, dễ tiêu hoá và không có các
thành phần tạo cholesterol. Lipit của đậu tƣơng chứa tỉ lệ lớn các axit béo
chƣa no, có hệ số đồng hoá lớn (98%), chỉ số iot cao (120-137). Sử dụng
protein và lipit của hạt đậu tƣơng còn có tác dụng chữa một số bệnh nhƣ: đái

“Nghiên cứu đặc điểm của gen GmDREB2 phân lập từ cây đậu tƣơng
[Glycine max (L.) Merrill]”.

2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định đƣợc sự khác nhau về khả năng chịu hạn của một số giống
đậu tƣơng địa phƣơng;
Xác định đƣợc điểm sai khác về trình tự gen GmDREB2 phân lập từ
một số giống đậu tƣơng địa phƣơng.
Đánh giá đƣợc sự đa dạng của một số giống đậu tƣơng dựa trên trình tự
gen GmDREB2 và trình tự amino acid suy diễn.
3

3. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của một số giống đậu tƣơng địa phƣơng
nghiên cứu.
- Thu thập thông tin về gen DREB2 ở cây đậu tƣơng và thiết kế cặp mồi cho
PCR nhân gen.
- Nhân gen DREB2 từ hệ gen của giống đậu tƣơng địa phƣơng bằng kỹ thuật
PCR với cặp mồi đã thiết kế. Tách dòng và xác định trình tự gen DREB2.
- So sánh trình tự gen DREB2 của một số giống đậu tƣơng địa phƣơng với
trình tự gen đã công bố.
- Phân tích hệ số tƣơng đồng di truyền và hệ số sai khác về trình tự gen
DREB2 và trình tự amino acid suy diễn. Thiết lập sơ đồ hình cây giữa các
giống đậu tƣơng dựa trên trình tự gen DREB2 và trình tự amino acid suy diễn.

Nga, sang Đông Nam Á và Nam Á qua con đƣờng tơ lụa. Ở Việt Nam đậu
tƣơng đƣợc trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh trung du, miền núi phía Bắc
và miền Đông Nam Bộ [3], [6], [8].
Cây đậu tƣơng là loại cây quan trọng bậc nhất trong các cây họ Ðậu.
Để có vị trí nhƣ vậy là nhờ đậu tƣơng có những đặc tính ƣu việt hơn những
giống đậu khác, đó là: Hàm lƣợng protein và lipit cao: protein (35% - 52%),
lipit từ (18% - 25%), glucid (10% -15%), chứa nhiều loại vitamin , là nguồn
năng lƣợng quan trọng cho con ngƣời và vật nuôi. Các sản phẩm rất quen
thuộc của đậu tƣơng nhƣ đậu phụ, tƣơng, dầu ăn có vai trò hết sức quan
trọng trong đời sống hàng ngày của con ngƣời. Gần đây các nhà khoa học đã
nghiên cứu và phát hiện đậu tƣơng có vai trò chữa và điều trị bệnh nan y nhƣ 5

ung thƣ, tim mạch Đậu tƣơng còn có thể giải quyết một phần vấn đề hết sức
cấp thiết hiện nay trên thế giới là năng lƣợng từ các sản phẩm của nó. Ngoài
ra đậu tƣơng là cây họ đậu nên có tác dụng cải tạo đất thông qua việc cố định
đạm của vi khuẩn trên các nốt sần ở rễ, góp phần làm giảm lƣợng phân hóa
học bón xuống đất, khắc phục sự thoái hóa đất và ô nhiễm môi trƣờng [3], [6].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng
Cây đậu tƣơng là cây trồng cạn ngắn ngày, gồm các bộ phận chính: rễ,
thân, lá, hoa, quả, hạt.
Đậu tƣơng là cây hai lá mầm có rễ cọc, gồm rễ cái và rễ bên. Khi hạt
nảy mầm, phôi phát triển thành rễ cái. Rễ tập trung ở tầng đất mặt 30 – 40 cm,
ăn lan khoảng 20– 40 cm. Trên rễ có nhiều nốt sần, những nốt sần này đƣợc
ví nhƣ nhà máy sản xuất đạm. Trên nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium
japonicum có khả năng cố định đạm của không khí tạo thành đạm dễ tiêu. Nốt
sần có phẩm chất tốt thì to, có màu hồng. Số lƣợng và trọng lƣợng nốt sần có
liên quan trực tiếp đến sinh trƣởng và năng suất cây đậu tƣơng.

Đặc điểm về sinh thái học của đậu tƣơng
Nhiệt độ: Ở giai đoạn nẩy mầm nhiệt độ thích hợp 24 – 30
0
C, ở giai
đoạn cây con nhiệt độ từ 24 – 30
0
C, ở giai đoạn ra hoa kết trái 24 – 34
0
C và
giai đoạn chín: 20 – 25
0
C. Cây đậu tƣơng cần lƣợng mƣa tối thiểu phải đạt từ
400 mm, tốt nhất là 700 mm. Ở mỗi giai đoạn cây đậu tƣơng có nhu cầu khác
nhau về độ ẩm. Giai đoạn nẩy mầm thích hợp với độ ẩm khoảng 75 – 80%,
đến giai đoạn cây con nhu cầu về độ ẩm giảm 50 – 60% song lại tăng mạnh
ở giai đoạn ra hoa kết quả 70 – 80% và thấp nhất ở giai đoạn chín: 35 – 50 %.
Đa số các giống đậu tƣơng trồng hiện nay đều có phản ứng quang chu kỳ
ngày ngắn. Đậu tƣơng có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau: đất đỏ, đất 7

xám, đất phù sa, đất giồng cát. Nhƣng để trồng đậu tƣơng có hiệu quả phải
trồng trên đất có thành phần cơ giới nhẹ, pH từ 5 – 8 [3], [4], [6].
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và ở Việt Nam
Cây đậu tƣơng đƣợc xem là một loại cây trồng chiến lƣợc của nhiều
quốc gia, với vị trí thứ tƣ, sau lúa, ngô và lúa mỳ.
Đậu tƣơng có khả năng thích ứng khá rộng nên đƣợc trồng khắp các
châu lục, đặc biệt là châu Mỹ (75,68%) và châu Á (21,27%).
Trong những năm gần đây, do kết quả của việc ứng dụng những tiến bộ

đề ra cho năm 2010 là 325.000 tấn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông
thôn do chi phí sản xuất tăng và năng suất đậu tƣơng của nƣớc ta chƣa cao.
Theo số liệu thống kê chính thức của chính phủ, đậu tƣơng đƣợc trồng
ở 28 tỉnh trên khắp cả nƣớc, trong đó 70% ở miền bắc và 30% ở miền nam.
Khoảng 65% đậu tƣơng nƣớc ta đƣợc trồng ở vùng cao, những nơi đất không
cần màu mỡ; và 35% đƣợc trồng ở những vùng đất thấp ở khu vực đồng bằng
sông Hồng. Đậu tƣơng đƣợc trồng ở nhiều địa phƣơng trên khắp cả nƣớc vào
từng thời điểm khác nhau nên có cả vụ xuân, vụ hè và vụ đông.
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ 2005- 2011

2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
Diện tích canh
tác (nghìn ha)
204,1
185,6
190,1
192,1
146,2
197,8
215*
Sản lƣợng
(tấn/ha)
1,43
1,39

khác nhau.
Trong những năm gần đây, cùng với việc nghiên cứu các công nghệ
sinh học và các loại đậu tƣơng cao sản mới để tìm ra giống cho năng suất cao
với chi phí sản xuất thấp, các nhà chọn giống Việt Nam còn quan tâm nghiên
cứu các giống đậu tƣơng địa phƣơng có năng suất thấp nhƣng lại có chất
lƣợng hạt cao và có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi
trƣờng nhƣ: nóng, lạnh, mặn, phèn, hạn
1.2. GEN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG
1.2.1. Hạn và tác động hạn đến sinh trƣởng phát triển của thực vật
Hạn là tình trạng mất nƣớc ở cây nguyên nhân có thể do nhiều lý do: nhƣ
sự thiếu nƣớc trong môi trƣờng hay do nhiệt độ thấp, đốt nóng, độ mặn cao.
Hạn cũng nhƣ các yếu tố ngoại cảnh khác khi tác động lên cơ thể gây ra các
phản ứng của cơ thể, tuỳ theo từng loài từng giống mà mức độ phản ứng của cơ
thể cũng nhƣ thiệt hại do khô hạn gây ra là khác nhau: một số bị chết, một số bị
thƣơng, một số khác bị ảnh hƣởng còn lại một số không bị ảnh hƣởng 10

Khô hạn có thể phân ra làm hai trƣờng hợp sau:
(i) Hiện tƣợng khô xảy ra khi mất một phần nƣớc trong các cơ quan ở giai
đoạn nhất định trong chu kỳ sống ở thực vật (hạt, hạt phấn, bào tử). Hiện
tƣợng này không làm ảnh hƣởng đến tế bào, mô của cây. Đây là quá trình
biến đổi trạng thái trong tế bào có sự điều khiển của hệ thống thông tin di
truyền. Trong giai đoạn hình thành hạt nếu tế bào mất nƣớc khả năng chịu hạn
tăng lên. Khả năng này đạt cực đại ở thời kỳ hạt chín và có chiều hƣóng giảm
dần khi hạt nảy mầm. Hạt khô còn có khả năng chống chịu với hàng loạt điều
kiện ngoại cảnh bất lợi khác nhƣ nhiệt độ, gió.
(ii) Hạn do tác động của môi trƣờng chịu tác động bên ngoài rất lớn, gây ảnh
hƣởng đến đời sống của cây, có thể gây huỷ hoại cây cối và gây mất mùa.

Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tƣơng nói riêng là cây có nhu cầu về
nƣớc cao hơn các loại cây khác là do trong hạt và cây đậu tƣơng có h
–
50%, trong khi đó ngô chỉ là 30%, lúa là 26% [6].
Khi nghiên cứu về các đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng về phƣơng
diện sinh l
đến đặc điểm hóa keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi
chất. Tính chịu hạn của cây đậu tƣơng mang tính đa gen. Chúng thể hiện ở
nhiều khía cạnh khác nhau nhƣ: sự phát triển mạnh của bộ rễ, tính chín sớm
tƣơng đối, cũng nhƣ bản chất di truyền của từng giống có khả năng sử dụng
nƣớc tiết kiệm trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây. Căn cứ vào
đặc điểm này đậu tƣơng chia làm 2 nhóm:
- Nhóm chịu đƣợc sự mất nƣớc trong từng giai đoạn phát triển của cây.
- Nhóm chịu đƣợc sự thiếu nƣớc trong tất cả các giai đoạn phát triển của cây.
,
còn ở những giai đoạn nhƣ ra hoa
. 12

Cây đậu tƣơng thuộc nhóm cây chịu hạn kém. Các cây họ đậu nói
chung, cây đậu tƣơng nói riêng do có hàm lƣợng protein và lipid trong hạt cao
nên nhu cầu về nƣớc nhìn chung cao hơn các loại cây khác. Để tổng hợp 1 kg
chất khô cần 500- 530 kg nƣớc. Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nƣớc
của đậu tƣơng cũng khá cao, khoảng 50%, trong khi đó ở ngô là 30%, ở lúa là
26% [6].
Đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng liên quan chặt chẽ đến đặc điểm
hoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất. Tính chịu
hạn của cây đậu tƣơng mang tính đa gen. Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh

năng chống hạn của cây. Khi hiện tƣợng mất nƣớc xảy ra, gen LEA phiên mã
tổng hợp một số lƣợng lớn mRNA trong hạt chín và bị phân giải hết trong quá
trình nảy mầm. Mức độ phiên mã của gen LEA đƣợc điều khiển bởi acid
abcisic (ABA) và độ mất nƣớc của tế bào, áp suất thẩm thấu trong tế bào.
Protein LEA đƣợc chú ý trong điều kiện thực vật bị stress do thiếu
nƣớc [11], [13]. Nhiều gen LEA đã đƣợc nghiên cứu, phân lập, xác định chức
năng. Đặc điểm nổi bật của nhóm LEA là: giàu acid amin ƣa nƣớc, không
chứa cystein và tryptophan, có vùng xoắn α và có khả năng chịu nhiệt. Chúng
thay thế vị trí nƣớc trong tế bào và thực hiện các chức năng khác nhau nhƣ: cô
lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy protein biến tính và điều chỉnh
áp suất thẩm thấu. Sự biểu hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại
phân tử của nó cho thấy nó có vai trò trong bảo vệ cây trồng chống chịu sự
mất nƣớc [12]. Protein LEA đƣợc tạo ra hàng loạt trong giai đoạn muộn của
quá trình hình thành phôi.
LEA đƣợc chia thành 6 nhóm: nhóm 2- D19, nhóm 2- D11 (còn gọi là
dehydrin), nhóm 3- D7, nhóm 4- D113, nhóm 5- D29, nhóm 6- D95. Khi điều 14

kiện mất nƣớc xảy ra, LEA đƣợc tổng hợp với số lƣợng lớn, trong đó
dehydrin có thể chiếm tới 1% tổng số protein hòa tan của hạt. Ngày nay,
ngƣời ta đã phân lập đƣợc 30 gen khác nhau thuộc thành viên của nhóm gen
dehydrin ở các cây trồng khác nhau. Gen mã hóa protein dehydrin ở đậu
tƣơng đã đƣợc nghiên cứu tại một số phòng thí nghiệm trên thế giới và tới nay
đã có một số trình tự gen dehydrin đậu tƣơng và một số thực vật khác đƣợc
công bố trên ngân hàng trình tự gen quốc tế.
HSP (Heat Shock Protein) và môi giới phân tử (Chaperons)
HSP có mặt hầu hết ở các loài thực vật nhƣ: lúa mì, lúa mach, ngô,
đậu… chiếm khoảng 1% protein tổng số trong lá và có hầu hết ở các loài thực