BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KIỂM TRA MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI SINH VẬT GÂY
BỆNH TRONG THỰC PHẨM CHẾ BIẾN SẴN
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ii
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan i
Mục lục ii
Danh mục các từ viết tắt v
Danh mục các bảng vi
Danh mục các hình vii
CHƯƠNG 1 : MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu đề tài 1
1.3 Nội dung 1
1.4 Phạm vi nghiên cứu 2
CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN 3
2.1 Khái quát về ngộ độc thực phẩm 3
2.1.1 Các tác nhân gây ngộ độc 4
2.1.2 Tác hại 6
2.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm trên Thế Giới và Việt Nam 7
2.3 Giới thiệu một số vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm chế biến 9
2.3.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí 9
2.3.2 Coliforms 9
2.3.3 Escherichia coli 13
4.2 Đánh giá và thảo luận về kiểm nghiệm Coliforms 56
4.3 Đánh giá và thảo luận về kiemr nghiệm E.coli 57
4.3.1 Kiểm nghiệm theo phương pháp định tính, phương pháp MPN
và phương pháp đếm khuẩn lạc 57
4.3.2 Kiểm nghiệm theo phương pháp ELISA 58
4.3.3 Thảo luận về khả năng sinh Indol trong nghiệp pháp IMViC
phát hiện E.coli 59
iv
4.3.4 Thảo luận về thử nghiệm Merthy Red trong nghiệp pháp IMViC
phát hiện E.coli 62
4.3.5 Thảo luận về thử nghiệm Voges – Prokauer trong nghiệp pháp
IMViC phát hiện E.coli 63
4.3.6 Thảo luận về thử nghiệm citrate trong nghiệp pháp IMViC phát
hiện E.coli 65
4.4 Đánh giá và thảo luận về kiểm nghiệm tổng nấm men, nấm mốc 67
4.4.1 Quy trình phân tích định tính nấm mốc 67
4.4.2 Quy trình phân tích định lượng tổng nấm men, nấm mốc 67
CHƯƠNG 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69
5.1 Kết luận 69
5.2 Kiến nghị 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
eptone Water
TSA : Tryptone Soya Agar
VP : Voges – Proskauer
VRB : Violet Red Bile Agar
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Báo cáo thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm từ năm 2000 – 2008 8
Bảng 2.2: Tỷ lệ phần trăm vi khuẩn giảm trước và sau khi rửa của rau ngổ và
lá mơ 12
Bảng 2.3 : Chỉ tiêu Coliforms trong thực phẩm 12
Bảng 2.4 : Giới hạn cho phép Coliforms trong thực phẩm 13
Bảng 3.1: Ghi nhận kết quả thử nghiệm sinh hoá 41
hợp chứa kháng thể 50
Hình 3.12: Tổng quát quá trình phát hiện E.coli bằng phương pháp ELISA 51
Hình 4.1: Indol + và Indol - 61
Hình 4.2 : Thử nghiệm MR 63
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn
SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 1 MSSV: 0811110005
CHƯƠNG 1 : MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Trong thời đại đất nước phát triển và hội nhập như ngày nay, cuộc sống của con
người ngày càng được nâng cao và nhu cầu về ăn uống càng phải được cải thiện. Tuy
nhiên, cuộc sống của họ ngày càng bận rộn và hối hả, nên thời gian dành cho việc tự
nấu nướng cho các bữa ăn trong gia đình ngày càng hạn chế, vì thế những suất ăn
nhanh, cơm tiệm, các thức ăn chế biến sẵn là giải pháp mà rất nhiều người lựa chọn. Từ
đó cho các thực phẩm được chế biến sẵn đóng vai trò quan trọng trong xã hội, vừa đáp
ứng nhu cầu nhanh gọn vừa tiết kiệm được thời gian. Tuy nhiên, về mặt vệ sinh thì
không có gì đảm bảo được. Vì mọi người không thể kiểm soát quá trình chế biến và nếu
sản phẩm chế biến có vấn đề thực sự thì cũng không có cách nào nhận biết. Từ đó dẫn
đến một số vấn đề về sức khỏe ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình làm việc và thậm chí
còn gây tử vong, đó là hậu quả của ngộ độc thực phẩm.
Vấn đề kiểm soát mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng được quan tâm
nhiều hơn. Đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm không phải là một việc dễ dàng
mà cần phải có đủ khả năng chuyên môn về lý thuyết cũng như thực hành. Để góp phần
đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm cũng như đưa ra những khuyến cáo cho
mọi người, tôi tiến hành thực hiện khóa luận “Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn
SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 3 MSSV: 0811110005
CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN
2.1 Khái quát về ngộ độc thực phẩm
Hiện nay có rất nhiều vụ ngộ độc hay các bệnh gây ra do thực phẩm, mặc dù có
các luật về an toàn vệ sinh thực phẩm đã được ban hành và ngày càng chặt chẻ và được
sự quan tâm của công đồng.
Cho đến nay vẫn còn có những cách hiểu và phân biệt không thống nhất về khái
niệm các bệnh gây ra do thực phẩm hay ngộ độc thực phẩm. Song để phân biệt hai vấn
đề này thông thường dựa vào các khái niệm như sau:
- Ngộ độc thực phẩm là các biểu hiện bệnh xuất hiện sau khi tiêu thụ thực phẩm
có chứa số lượng lớn vi sinh vật, chúng nhân lên nhanh trong quá trình chế biến hay
bảo quản. Các vi sinh vật có thể hiện diện một số lượng rất ít ban đầu trong thực phẩm
hay nhiễm vào do sự tiếp xúc trong quá trình chế biến.
- Các bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm do tiêu thụ những thức ăn chứa các vi sinh
vật hay sản phẩm của chúng, không phụ thuộc vào số lượng nhiều hay ít, do đó không
phụ thuộc vào sự chế biến hay bảo quản.
- Xương, tóc …
- Vật lạ gỗ, kim loại, đá sạn…
- Chất phóng xạ
- Các mảnh thuỷ tinh
Và các vật lạ khác lẫn vào thực phẩm cũng gây nguy hại đáng kể như gãy răng,
hóc xương, tổn thương niêm mạc dạ dày, miệng…
2.1.1.2 Các tác nhân hoá học
Các chất ô nhiễm trong công nghiệp và môi trường như: các dioxin, các chất
phóng xạ, các kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, asen, cadimi…)
Các chất hoá học sử dụng trong nông nghiệp: thuốc bảo vệ thực vật, động vật,
thuốc thú y, chất tăng trưởng, phân bón, thuốc trừ giun sán và chất hun khói.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn
SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 5 MSSV: 0811110005
Các chất phụ gia sử dụng không đúng qui định: các chất tạo màu, tạo mùi, tạo
ngọt, tăng độ kết dính, ổn định, chất bảo quản, chất chống ôxy hóa, chất tẩy rửa… và
các hợp chất không mong muốn trong vật liệu bao gói, chứa đựng thực phẩm.
Các chất độc hại tạo ra trong quá trình chế biến thịt hun khói, dầu mỡ bị cháy
khét, các hợp chất tạo ra do phản ứng hóa học trong thực phẩm, sự sản sinh độc tố
trong quá trình bảo quản, dự trữ bị nhiễm nấm mốc (độc tố vi nấm) hay biến chất ôi
hỏng.
Các độc tố tự nhiên có sẵn trong thực phẩm như mầm khoai tây, sắn, đậu mèo,
măng, nấm độc, cá nóc, cá cóc…
Các chất gây dị ứng trong một số hải sản, nhộng tôm…
2.1.1.3 Các tác nhân sinh học
Vi khuẩn có ở mọi nơi xung quanh chúng ta. Phân nước thải, rác bụi, thực phẩm
tươi sống là ổ chứa của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Mặt khác, trong không khí và
ngay ở trên cơ thể người (đặc biệt là ở bàn tay), ở miệng, ở đường hô hấp, đường tiêu
hóa, bộ phận sinh dục, tiết niệu cũng có rất nhiều loaị vi khuẩn. Thức ăn chín để ở nhiệt
lý.
Biểu hiện của tác hại do thực phẩm nhiễm bẩn:
- Nhiễm độc tiềm ẩn: là sự nhiễm các chất độc hại dưới ngưỡng có thể gây ra các triệu
chứng cấp tính, bán cấp tính; có thể bị nhiễm liên tục hoặc không liên tục; có thể sau
một thời gian không biết trước sẽ có: ung thư, các rối loạn chức năng không rõ nguyên
nhân, vô sinh
- Bệnh mạn tính: là bệnh mắc phải, có biểu hiện phát bệnh lặp lại thường xuyên hoặc
theo chu kỳ; có thể do di chứng của ngộ độc cấp hoặc do hậu quả của nhiễm độc tiềm
ẩn tới liều gây bệnh; có thể trở thành bệnh khó chữa hoặc không chữa khỏi.
- Bệnh bán cấp tính (ngộ độc thức ăn): các rối loạn tiêu hóa hoặc thần kinh nhẹ, hoặc
các triệu chứng cấp tính, có thể tự chữa khỏi hoặc tự khỏi.
- Bệnh cấp tính (ngộ độc thức ăn): các triệu chứng trước đây tương đối điển hình và
bệnh nhân cần đến sự can thiệp của bác sĩ.
+ Biểu hiện rối loạn tiêu hóa: nôn, ỉa chảy (gồm cả ỉa ra máu), đau bụng.
+ Biểu hiện rối loạn thần kinh: rối loạn cảm giác, nhức đầu, mệt lả, hôn mê, liệt chi.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn
SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 7 MSSV: 0811110005
+ Các rối loạn chức năng khác: thay đổi huyết áp, bí tiểu
- Thời gian lành bệnh (đến khi hết triệu chứng nhưng bệnh nhân chưa thể sinh hoạt và
làm việc một các bình thường).
+ Với người mắc bệnh bán cấp và cấp tính : 02 ngày – 01 tháng
+ Với người mắc bệnh mạn tính: không khỏi hẳn và thỉnh thoảng tái phát.
- Thời gian phục hồi sức khỏe (đã có thể sinh hoat và làm việc một cách bình thường):
tuỳ theo nguyên nhân, tình trạng sức khỏe và độ tuổi, thường là:
+ Với người bình thường bị mắc bệnh bán cấp và cấp tính: 01 – 04 tuần với người lớn
và trẻ độ tuổi học đường: 01 tháng đến vài tháng với trẻ dưới 7 tuổi và người già.
+ Với người mắc bệnh mạn tính bị tái phát: 01 – 02 tuần trong trường hợp bệnh tái phát
có thể chữa được; không xác định được trong trừơng hợp đã thành bệnh nặng.
thức ăn đường phố ngày càng phát triển. Các dịch vụ này thuận tiện cho người tiêu
dùng nhưng cũng tiềm ẩn nhiều nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm.
Thống kê tình hình ngộ độc trong những năm gần đây cho thấy số vụ và mức độ
ngày càng gia tăng. Cụ thể tình hình từ năm 2000-2008 trên địa bàn cả nước ( bảng 2.1)
Bảng 2.1 Báo cáo thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm từ năm 2000 – 2008
Kết quả điều tra
Năm
Vụ ngộ độc (vụ) Số mắc (người) Chết (người)
2000 213 4.233 59
2001 245 3.901 63
2002 218 4.9641 71
2003 238 6.428 37
2004 145 3.584 41
2005 144 4.304 53
2006 165 7.135 57
2007 247 7.329 55
2008 205 7.828 61
Trung bình/năm 202,2 ( 247-144) 5.525,1 (7.828 – 3.584)
55,2 (71 – 31)
Tổng cộng 1.820 49.726 497
(Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, bộ Y tế)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn
SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 9 MSSV: 0811110005
2.3 Giới thiệu một số vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm chế biến
2.3.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí
2.3.1.1 Định nghĩa
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn
SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 10 MSSV: 0811110005
Đầu thập niên 1900 ( Cabelli, 1977), ông cho rằng sự vắng mặt của Coliforms như
là dấu hiệu cho thấy không xuất hiện bệnh do vi khuẩn gây nên, và sau khi sản xuất khí
đốt với việc giới thiệu ống Durham ( Durham năm 1983) thì khái niệm về vi khuẩn
Coliforms và các vi khuẩn khác dạng coli được sử dụng ở nước Anh năm 1901.
Năm 1908 Bergey và Deehan xác định có 256 loài khác nhau của vi khuẩn
Coliforms.
Năm 1909 Macconkey công nhận 128 loài khác nhau của vi khuẩn Coliforms.
Đến đầu thập niên 1920, sự khác biệt của các dạng vi khuẩn Coli được đem ra sản
xuất indole, hóa lỏng gelatin, lên men đường sucrose và Voges – Proskauer nhằm xác
định sự ô nhiễm faecal (Hendricks 1978).
Năm 1938 Parr có những phát minh lên đến đỉnh điểm trong thử nghiệm IMViC
(Indole, Methyl đỏ, Voges-Proskauer và muối của acid Citric). Việc thử nghiệm cho
thấy sự khác biệt của các dạng vi khuẩn Coliform phân, các dạng vi khuẩn trong đất và
trung gian, và nó được sử dụng cho đến ngày hôm nay.
2.3.2.3 Đặc điểm
Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, có phản ứng oxidase
âm tính và thể hiện hoạt tính của β – galactosidase. Vi khuẩn này có khả năng phát triển
trên môi trường có muối mật, hoặc các chất hoạt tính bề mặt khác có tính ức chế tương
tự, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37
o
C trong 24 – 48 giờ.
Coliforms gồm bốn chi trong họ Enterrobacteriaceae: Escherichia coli,
Klebsiella, Citrobacter và Enterobacter (Metcalf và Eddy,1991). Chúng thường có mặt
trong đường ruột động vật có vú. ( ví dụ: Escherichia coli phổ biến trong đất trên cơ thể
người).
Chúng bao gồm vi khuẩn lên men lactose như Escherichia cloacae, Citrobacter
freundii ( hình 2.1) có thể tìm thấy trong phân và ngoài môi trường ( nước giàu chất
SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 12 MSSV: 0811110005
Bảng 2.2: Tỷ lệ phần trăm vi khuẩn giảm trước và sau khi rửa của rau ngổ và lá
mơ
[10]
Loại rau và vi
khuẩn
Trước khi rửa Sau khi rửa Giảm
Rau ngổ
Tổng số vi khuẩn
Coliforms
3.300.000
89.000
37.000
2.300
99%
97%
Lá mơ
Tổng số vi khuẩn
Coliforms
190.000
24.000
160.000
4.800
[10]
Thực phẩm
Giới hạn cho phép CFU/g hay CFU/ml
thực phẩm
Sản phẩm từ thịt: pate, xúc xích… 50
Sản phẩm chế biến: tôm, cá, mực… 10
Thủy sản khô sơ chế: cá khô 10
2
Trứng 10
2
Sản phẩm từ trứng 10
Sữa 10
Sản phẩm từ ngũ cốc, xử lý nhiệt trước
khi dùng ( bột, miếng, mì), dùng trực
10
3Nước giải khát không cồn 10
Nước khoáng đóng chai 0
2.3.3 Escherichia coli
2.3.3.1 Định nghĩa
Escherichia coli (thường được viết tắt là E. coli)
là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong
đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và
động vật có vú). Vi khuẩn này cần thiết trong quá trình
Kích thước trung bình (0,5µ x 1-3µ) hai đầu tròn. Một số dòng có lông bám (pili).
2.3.3.4 Phân loại
Hiện nay các nhà khoa học tìm ra được 5 nhóm E.coli khác nhau.
Enteroaggregative (EAggE.C)
Enterohemorrhagic (E HEC)
Enteroinrasire (EIEC)
Enteropathogenic (EPEC)
Enterotoxigenic (ETEC)
2.3.3.5 Đặc điểm nuôi cấy
E.coli là trực khuẩn hiếu khí tùy nghi, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5-40
0
C,
nhiệt độ thích hợp là 37
0
C trong 24 giờ, pH thích hợp là 7,3 - 7,4 nhưng có thể phát
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn
SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 15 MSSV: 0811110005
triển ở pH từ 5,5 – 8. Vi khuẩn E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy
thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản.
- Trên môi trường nước thịt: sau thời gian nuôi cấy ở 37
0
C trong 24 giờ nuôi cấy,
vi khuẩn E.coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng
xuống đáy, đôi khi hình thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trường, môi
trường có mùi hôi
- Trên môi trường thạch thường: ủ ở 37
0
C trong 24 giờ vi khuẩn phát triển hình
khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S ( Smooth), màu vàng chanh.
2.3.3.6 Đặc tính sinh hóa
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn
SVTH: ĐỖ NGỌC CƯỜNG 16 MSSV: 0811110005
Nhiệt độ thích hợp là 37 - 38
0
C, pH: 7,2 – 7,4. Khuẩn lạc thay đổi theo môi trường
nuôi cấy: trong môi trường NA: khuẩn lạc tròn, ẩm ướt, mặt láng, có nếp nhăn. Trong
môi trường EMB: khuẩn lạc có màu thâm tím hoặc đen. Môi trường MacConkey:
khuẩn lạc màu đỏ mận chín.
Đặc tính lên men các loại đường. E.coli gồm những trực khuẩn di động hoặc
không di động, có khả năng lên men sinh hơi các loại đường Glucoza, Fructoza,
Galactoza, Lactoza, Maniton, Mannit, Levuloza, Xyloza. Lên men không chắc chắn với
các loại đường Dulciton, Sacaroza, Lactose trong khi đó vi khuẩn Salmonella thì không
có đặc tính này, đây là đặc tính quan trọng để phân biệt vi khuẩn E.coli và Salmonella.
2.3.3.7 Đặc điểm kháng nguyên và độc tố
E.coli gồm 4 loại kháng nguyên : O (kháng nguyên thân), H (kháng nguyên tiêu
mao),K ( kháng nguyên màng tế bào), F .
- Kháng nguyên O ( kháng nguyên thân) là kháng nguyên của thành tế bào. Cấu tạo
bởi lipopoly saccharit. Đặt tính kháng nguyên O như sau:
Chịu được nhiệt không bị hủy khi đun nóng 100
0
C trong 2 giờ.
Kháng cồn không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%.
Bị hủy bởi focmol 5%.
Có tính độc, chỉ cần 1/20mg đủ giết chết chuột trong 24 giờ.
- Kháng nguyên H (kháng nguyên tiên mao). Được cấu tạo bởi protein và có các tính
chất sau:
tố bám dính thay đổi theo điều kiện môi trường và khả năng biến dị của từng serotyp.
Chính yếu tố bám dính và độc tố tạo nên quá trình sinh bệnh của E.coli.
E.coli là vi khuẩn môi trường, nơi nào cũng có. Bình thường, vi khuẩn không gây
tác hại trên ký chủ (103 CFU/g phân). Khi mật số tăng lên cao (106- 109CFU/g phân)
thì nó sẽ trở nên gây bệnh.
Tính bám dính: Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể heo chủ yếu qua đường miệng. Ở
dạ dày, nếu pH không quá acid, E.coli sẽ sinh sôi phát triển thuận lợi hơn. Khi đến ruột,
E.coli sẽ chống lại cơ chế rửa trôi bằng tính bám dính vào niêm mạc ruột và tác động
lên nhung mao ruột.
Copyright: Tài liệu đại học ©