B GIÁO DO
I HC M TP. H CHÍ MINH


BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

 tài:
TNG LÊN MEN
VI KHUN NI SINH Bacillus sp. T3
NHM NÂNG CAO HOT TÍNH KHÁNG
NM Corynespora cassiicola

KHOA CÔNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGHÀNH: VI SINH  SINH HC PHÂN T

GVHD : ThS. NGUY
SVTH : NGUYN THÀNH TRUNG
MSSV : 1053010856
KHÓA : 2010  2014

Tp. H Chí Minh, tháng 5 nm 2014
LI C
  tài này, ngoài s c gng ca bn thân còn có s ng
dn ca thy cô, anh ch và s  ca bn bè.
u tiên, em xin chân thành ct c các thy cô Khoa Công ngh Sinh
Hi Hc M Tp. H t cho em nhng kin thc
nn tng nht, em xin cy Nguyt Linh và thy
luôn bên cng, truyt kinh nghing viên em
 tài.
Con c, co mu kin tt
nh con hoàn thành vic hc ca mình.

1.3.1 Lch s phát hin nm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei
12
1.3.2 Phân loi hc 12
1.3.3 m hình thái 12
1.3.4 m sinh lý 13
1.3.5 Kh n ti 14
1.3.6 Kh  14
1.3.7 ng xâm nhp và kh nh ca nm Corynespora
cassiicola 15
1.4 TNG QUAN V Bacillus 15
1.4.1 Phân loi 15
1.4.2  17
1.4.3 ng 17

SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG ii

1.4.4 ng dng ca Bacillus 19
1.4.5 Cht chuyn hóa kháng nm ca Bacillus 20
1.5 QUY HOCH THC NGHIM 22
1.5.1 ch thc nghim 22
1.5.2 m quy hoch thc nghim 22
1.5.3 ng ca quy hoch thc nghim 23
1.5.4 Thí nghim sàng lc 24
1.5.5 T 26
1.5.6 Phn mm quy hoch thc nghim Minitab 16 30
 VT LIU 37
2.1 THM NGHIÊN CU 38
2.2 VT LIU NGHIÊN CU 38
2.2.1 Chng vi sinh vt nghiên cu 38
2.2.2 Chng nm Corynespora cassiicola th nghim 38

610
và m t bào 57
3.3.2 ng kính vòng kháng nm 58
3.3.3 Sàng lc các yu t ng 61
3.3.4 Xnh yu t ng chính theo ma trn Plackett  Burman 68
3.3.5 Thí nghim khu 73
3.3.6 Thí nghim tìm khong tc 75
3.3.7 Thí nghing b mt theo thit k thí nghim Box  Behnken
77
3.4 KHO SÁT HOT TÍNH CHT KHÁNG NM THEO THI GIAN 84
3.5 SO SÁNH KH T NM Corynespora cassiicola CA MÔI
NG TNG NB 85
 KT LUN VÀ KIN NGH 91
TÀI LIU THAM KHO 93
PH LC 102

SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG iv

DANH MC CH VIT TT
ANOVA Oneway analysis of variance
C. cassiicola Corynespora cassiicola
CFU Colony forming unit
Cs. Cng s
NA Nutrent Agar

Bng 3.11. Giá tr các bin s trong thí nghim Plackett  Burman tìm yu t nh
n hot tính kháng nm chng Bacillus sp. T3 68
Bng 3.12. Thit k thí nghim Plackett  Burman và kt qu thí nghim vi các
m ca các yu t 69
Bng 3.13. B trí thí nghim khu cho 4 yu t ng chính 73
Bng 3.14. Tc chuyc chng Bacillus sp. T3 75
Bng 3.15. Kt qu ng kính vòng kháng nc sau khi thc hin p
pháp leo dc chng Bacillus sp. T3 76
Bng 3.16. Giá tr tng m trong thit k thí nghim Box  Behnken 77
Bng 3.17. B trí và kt qu thí nghim Box  Behnken chng Bacillus sp. T3 78
Bng 3.18ng kính vòng kháng nm theo thi gian chng Bacillus sp. T3 84
Bng 3.19. Kt qu th nghim phun dch lc c ch nm Corynespora cassiicola
chng vi khun Bacillus sp. T3 nuôi cng NB 86

SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG vi

Bng 3.20. Kt qu th nghim phun dch lc c ch nm Corynespora cassiicola
chng vi khun Bacillus sp. T3 nuôi cng t 88
Bng 3.21. Tóm tt kt qu nghiên cu 90

SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG vii

DANH MC BI
Bi n tính gia OD
610
và m t bào Bacillus sp.
T3 58
Bi ng theo thi gian chng Bacillus sp. T3 59
Bi 3.3. ng kính vòng kháng nm theo thi gian chng Bacillus sp. T3 60
Bi 3.4. Kt qu các nguo sát 62

Hình 3.1. Hình thái nhum Gram vi khun Bacillus sp. T3 56
Hình 3.2. Hình thái khun lc vi khun Bacillus sp. ng NA 56
Hình 3.3. Kt qu th kh ng ging khuch tán chng Bacillus sp. T3
57
Hình 3.4. Kt qu giá tr ta các yu t ng chính 83

SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG 1

T V

c tho mc, sn phm công ngh sinh hng chuyn gen kháng
nhn hoc gim bt thit hi do bnh ht bin pháp
tt, có nhiu trin v
Vi nhóm vi sinh vc s dng trong bin pháp sinh hc, thì Bacillus là
mt trong nhng nhóm vi khun c nghiên c ã có nhiu tài liu chng
minh Bacillus có kh m soát sinh hi vi nm bnh trên cây tr
kim soát nm Aspergillus flavus  u phng (
Kong và cs., 2010), kim soát
Fusarium solani gây bnh trên cây cà chua (Ebtsam và cs., 2009), kim soát nm
Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae (Zhao và cs., 2013). Chi Bacillus có nhiu loài
có li, có kh o ra nhiu hp cht sinh hcht kháng

SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG 3
nm và kháng khun, các enzym ngoi bào, các chng thc vt
và các cht hong b mt. (Bottone và cs., 2003)
Chng Bacillus sp. c cung cp bi phòng thí nghim Công ngh Vi
sinh  i Hc M Tp. H c ch
in vitroCorynespora cassiicola. Kt qu ng hot
tính c ch nm Corynespora cassiicola i vi chng vi khun ni sinh
Bacillus sp. T3 và tiêu dic nm Corynespora cassiicola  n nguyên
cht ca dch nuôi cy (không có kh c lng mi sau khi x
lý vi dch nuôi cy vi khun) (Nguycs., 2013). Trong nghiên cu
này, chúng tôi tp trung chính vào nghiên cu  ng t   ng vi
khun ni sinh Bacillus sp. T3 nhm nâng cao hot tính kháng nm Corynespora
cassiicola.
T  tài nghiên cTng lên
men chng vi khun ni sinh Bacillus sp. T3 nhm nâng cao hot tính nm
Corynespora cassiicola
Mc tiêu:
T    ng lên men chng vi khun ni sinh Bacillus sp. T3

SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG 5
1.1 O SU Hevea brasiliensis muell. arg
1.1.1 Phân loi hc
             Euphorbiaceae,
Moraceae, Apocynaceae, Aslepiadaceae, Compositae
            Hevea brasiliensis
HeveaEuphorbiaceae 
.  Trí, 2004)
1.1.2 Ngun gc
  Nam
 (Souza và cs., 2013)

.  Trí, 2004)
1.1.3 c m thc vt hc
Cây cao su thuc loi thân g, to, cao.  nh cao t
20 m n 30 m. Cu to ca thân cao su có phn quan trng là v 
phn sn sinh ra nha m quyt sng m. Lá cao su mc
cách, có ba lá chét nh cung dài, có hình bu dn, mt nhn gân song
i vi cây cao su thì lá có vai trò rt quan trng, ng trc tin sn
ng m. V n sinh thái cây cao su phát trin tt  
hi nhi trung bình 25
o
L m chc hn
nhii v cht,  c trng t Bc
n Nam. (Nguyn Hu Trí, 2004)
1.1.4 Vai trò và tình hình sn xut
                
  
 lâm  công ngh 



Corynespora cassiicola 


ích. (Han và cs., 2005; Klich và cs., 1994)

SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG 7
n nay vic nghiên cu ch ph tr bnh rng lá trên cây cao
su vc quan tâm  c c. 
Corynespora cassiicola 
Bacillus sp. T9 và Bacillus 


1.2 ESPORA TRÊN CÂY CAO SU
1.2.1 Phân b
Bnh rng lá Corynespora do tác nhân là nm Corynespora cassiicola, có tác
hi ln tc trng cao su trong khu vnh xut hin
lu trên cây cao su tp theo lt ghi
nhn ti         
1988. Bnh gây thit hi
nng nht ti nh b và trng li trên 5.000 ha. Ti Malaysia,
Thái Lan và Indonesia nhiu ngàn ha cao su b hi nng làm ng ln sn
t toàn b , 2009)
Bnh xut hin ti Vii nng cho các

trên din rng  mt s tnh mi, Tây Nguyên và min Trung, tp
trung trên dòng vô tính cao su RRIV4, hin chim ding khá ln  c
nhn và ti
1.2.2 Triu chng bnh trên cây cao su
1.2.2.1 

hin trên phin lá.
Trên chi, các chi xanh d nhim bm b
tn công và gây hi c ch Vt bnh có th phát trin 20 cm
gây cht cht c
cs., 2010)
1.2.3 Tác hi bnh rng lá Corynespora trên cây cao su
1.2.3.1 Sri Lanka
Dòng vô tính  

òng vô tính
              

òng vô tínhh: RRIC 103,
RRIC 104, RRIM 600, 725, Tjir 1, IAN 873 FX 25 và
           và RRIC 133.
(Jayasuriya và Thennakoon
1.2.3.2 
Dch bnh l1996, nguy him nht trên dòng vô tính RRII
105 chim gn 80% dic. Bnh gây gim sng m n
50%  vùng b hi nng. Hi trà trên 10. hn ch
dch bnh và áp dng  nhu kin thun li cho bnh xut hin.
n
sau: RRII 105, RRII 118, RRII 300, PR 107, PR 255, PR 261, PB 86, PB217,
PB235, PB255, PB 260, PB 311. (Jayasinghe, 

SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG 10
1.2.3.3 Indonesia
Vào thp niên 80, 1200 ha cao su b nhim bnh nng và phi cht b 400 ha,
thit hi khong 200 triu Rupiah. 70% dic b bnh gây hi
 m khác nhau. Nhiu dòng vô tính cao sn phi loi b: IAN 873, mt s PR

Xut hin vào tháng 8 1999 ti RRIV, gây hi cho dòng vô tính: RRIC
103, RRIC 104, LH 88/372. Cu9, hin din tng Nai, Du
Tii nng trên din tích gn 200
ha ti công ty Lc Ninh  các la tui ca cây cao su. Gây bnh trên lá non, già và
c chi. Hu qu, gây rng lá hàng lot làm ng lng và sn
ng. a các dòng vô tính RRIC 103, RRIC 104, LH 88/372
phi tiêu hu. Tip theo nhiu din tích cao su trng bng dòng vô tính RRIC 104
phi trng li. T n nay, bnh có s i v triu ch
tích ly  i bùng phát.
n g
RRIV4. Nhiu dòng vô tính nhim bnh  m 
 ., 2010)
1.2.4 Cách phòng tr
Do gây hng t n
n khai thác, nên dòng vô tính cao su kháng bnh. Tránh
trng các dòng vô tính cao su mn cm: RRIC 103, RRIC 104, RRIV 3, RRIV 4
Ghép tán bng các dòng vô tính cao su kháng bnh.
Áp dng 1 trong nhng công thc: (1) hexaconazole (5% a.i) n 0,2 
0,3%; (2) Hn hp carbendazim (50% a.i) 0,1  0,15% + hexaconazole (5% a.i)
0,1  0,15% (phi trn theo t l 1:1); (3) Thuc phi trn sn gc carbendazim và
gc hexaconazole n ng thuc gc (0,2  0,3%). Pha phi
hp vi cht bám dính BDNH 2000 n 
  Cn chú ý phun mi lá là
m xâm nhp vi chu k 7  10 ngày/ln.
 o m nhng cây b cht tán và cây b bnh nng. (Phan Thành



mng mc nhiu  các t bào tn cùng ca bào t (Chee, 1988). Phan Thành
n s bin thiên v c và hình dng c

SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG 13
phân lp t lá cao su b nhim bnh ngoài t nhiên và nuôi cy trên môi
ng Potato Dextrose Agar (PDA). Chiu rng trung bình c và
cung bào t l  phân lp
t ng dài, thon và có ng nuôi c
ng.

Hình 1.5. Khun lc nm Corynespora cassiicola ng PDA

Hình 1.6Corynespora cassiicolach
lactophenol
1.3.4 c m sinh lý
Corynespora cassiicola phát trin và hình thành bào t tng
Potato Sucrose Agar (PSA) (Sarma và cs., 1970). Onesirosan và cs. 
thu kin tt nht cho s phát trin ca C. cassiicola là 28ºC.  32 
36ºC nm phát trin chm và khun l
(1995), C. cassiicola phân lp t cây cao su ny mng PSA
nhiu kin nhit

SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG 14
 thích hp nht cho nm phát trin là 28ºC. Chee (1988) cho rng C. cassiicola


SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG 15
ca chúng li n là nguyên nhân mà bnh lan truyn
chm gia các khu vc cách xa nhau. (Mushrif, 2006)
1.3.7 Con ng xâm nhp và kh  gây bnh ca nm
Corynespora cassiicola
C. cassiicola 
cellulose Trong quá trình
CC toxin
, 

 

Ngoài cây cao su, nm còn là ký sinh ca trên 150 loi cây trng thuc nhiu
h c thuc nhiu vùng khí hu t nhii và có
kh i trên tt c các b phn ca cây t n rn nm
t cây cao su gây hc li. 
1.4 Bacillus
1.4.1 Phân loi
Theo khóa phân loi ca Bergey, Bacillus c phân lo
: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lp: Bacilli
B: Bacillales
H: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Chi Bacillus là mt chi ln (có nh chính xác và nhiu
c phân long, thuc h Bacillaceae. H này
chia làm 5 chi, gm: Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina,
Desulfotomaculum. a h này là s hình thành ni bào t