Số hóa bởi trung tâm học liệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ MINH
THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN
MÃ HÓA PROTEIN VỎ NHẰM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN KHÁNG
VIRUS GÂY BỆNH KHẢM LÁ Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu
Phạm Thanh Tùng và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện
Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành các thí
nghiệm trong luận văn.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, Khoa
Sinh-KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên; Tôi xin cảm ơn
PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh và các Thầy, Cô khoa Khoa học Sự sống,
Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi
trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn bè
và đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Tác giả

Nguyễn Thị Minh

Số hóa bởi trung tâm học liệu
iii
MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC CÁC BẢNG vi
DANH MỤC CÁC HÌNH vii

2.2.2. Phƣơng pháp tách dòng gen 28
2.2.3. Phản ứng lai ghép gen CPi với vector pENTR
TM
/D-TOPO
®
33
2.2.4. Phƣơng pháp tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi bằng kỹ
thuật Gateway 34
2.2.5. Tạo tế bào khả biến A. tumefaciens mang vector chuyển gen 36
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38
3.1. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI VÙNG GEN CPi CỦA SMV VÀ BYMV . 38
3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA
VÙNG GEN CPi CỦA SMV VÀ BYMV 39
3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp pENTR
TM
/D-TOPO
®
39
3.2.2. Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi [CPi(SMV-BYMV)]
bằng kỹ thuật Gateway 42
3.3. KẾT QUẢ TẠO VI KHUẨN A.TUMEFACIENS MANG VECTOR
CẤU TRÚC RNAi CHỨA VÙNG GEN CPi [pGW –CPi(SMV-BYMV)] . 45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
Số hóa bởi trung tâm học liệu
v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Bảng
Tên bảng
Trang
Bảng 2.1
Thành phần phản ứng PCR
28
Bảng 2.2
Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector pBT
30
Bảng 2.3
Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector
pENTR
TM
/D-TOPO
®

33
Bảng 2.4
Thành phần phản ứng LR
35

Số hóa bởi trung tâm học liệu
vii
DANH MỤC CÁC HÌNH


Sơ đồ mô tả phản ứng lai ghép đoạn gen CPi vào vector
pENTR
TM
/D-TOPO
®
tạo vector tái tổ hợp pEN-CPi
(SMV-BYMV)
41
Hình 3.4.
Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc với
cặp mồi M13-F/M13-R
42
Hình 3.5.
Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid pEN-CPi (SMV-
BYMV)
43
Hình 3.6
Sơ đồ mô tả phản ứng LR tạo vector pGW –CPi(SMV-
BYMV
45
Hình 3.7
Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens
47
Hình 3.8.
Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ
khuẩn lạc A. tumefaciens
50

Số hóa bởi trung tâm học liệu

vụ chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm lá ở cây đậu tương".
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Tạo đƣợc vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen CPi
phục vụ chuyển gen kháng bệnh khảm lá do virus SMV và BYMV ở cây
đậu tƣơng.
- Tạo đƣợc chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi chứa vùng
CPi (SMV+BYMV)
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Thu thập thông tin về gen CP của hai loài virus SMV và BYMV gây bệnh
khảm lá trên cây đậu tƣơng;
3.2. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen
CPi(SMV-BYMV) bằng kỹ thuật Gateway.
3.3. Biến nạp vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen
CPi(SMV-BYMV) vào vi khuẩn A. tumefaciens. Kiểm tra kết quả biến nạp
bằng colony-PCR. Số hóa bởi trung tâm học liệu
3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. BỆNH HẠI CÂY ĐẬU TƢƠNG
1.1.1. Cây đậu tƣơng, đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng

cây đậu tƣơng có tác dụng cải tạo đất [4].
Dựa vào thời gian sinh trƣởng, đậu tƣơng đƣợc chia thành các loại:
Chín rất sớm: Thu hoạch sau 89 – 90 ngày, chín sớm thu hoạch sau 90 –
100 ngày.
Chín trung bình: Thu hoạch sau 100 – 110 ngày, chín muộn trung bình thu
hoạch sau 110 – 120 ngày.
Chín muộn cho thu hoạch sau 130 – 140 ngày, chín rất muộn cho thu
hoạch sau 140 – 150 ngày [9].
1.1.2. Phân loại bệnh hại ở cây đậu tƣơng
Việc phân loại theo triệu chứng bệnh virus hại thực vật có ý nghĩa
quan trọng trong chẩn đoán, phòng trừ và nghiên cứu bệnh hại. Tuy nhiên, sự
phân loại bệnh chỉ có tính chất tƣơng đối vì diễn biến triệu chứng bệnh rất
phức tạp và cách phân loại còn tuỳ thuộc vào quan điểm của mỗi tác giả khác
nhau.
Bệnh khảm lá đậu tương
Khi bị bệnh lá cây có những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ,
cây chậm phát triển. Lá non ở ngọn khảm lá mạnh và biến dạng. Quả thƣờng
lép. Cây bị bệnh đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chùn lại, phát
triển chậm, quả ít và biến dạng, sần sùi, có vị đắng. Bệnh do virus SMV

Số hóa bởi trung tâm học liệu
5
(Soybean mosaic virus ) gây nên. Virus lan truyền do rệp, bọ trĩ làm môi giới. Sự
lan truyền cây bệnh sang cây khoẻ do rệp muội ở ngoài đồng vẫn là chủ yếu,
bệnh còn truyền qua hạt. Bọ trĩ, rệp càng nhiều tỉ lệ nhiễm bệnh càng lớn.
Bệnh gỉ sắt hại đậu tương
Lúc đầu trên lá xuất hiện những điểm nhỏ màu hơi vàng nổi gờ, sau đó
vết bệnh to dần, ở giữa màu vàng nâu xung quanh có quầng vàng hẹp, vết
bệnh mở rộng đƣờng kính tới 2 mm. Điểm gờ nhỏ là khối bào tử, thƣờng ở
mặt dƣới lá, còn mặt trên lá chỗ vết bệnh có màu vàng nâu, nhƣng cũng có

thể gây hại trên nhiều bộ phận nhƣ lá, thân, hoa, quả nhƣng chủ yếu là gây
hại trên lá. Bệnh truyền qua hạt giống và tàn dƣ của cây bị bệnh từ vụ trƣớc.
Nếu hạt giống trƣớc khi đem gieo đã có sẵn mầm bệnh thì khi gieo xuống
khoảng nửa tháng lá sẽ có đốm vàng, mép lá cong xuống phía dƣới, mặt dƣới
lá có nhiều khuẩn ty bao phủ, cây con bị lùn.
Bệnh này xuất hiện và gây hại tƣơng đối phổ biến ở các vùng, nhất là ở
những nơi có ấm độ không khí trong ruộng cao, nhiệt độ không khí thấp, trời
hơi lạnh, có sƣơng mù nhiều, tạo cho ruộng đậu ẩm thấp, vì thế bệnh thƣờng
gây hại trong vụ Đông xuân nhiều hơn.
Bệnh lở cổ rễ
Bệnh phổ biến ở nhiều nƣớc trên thế giới. Đây là bệnh chính trên cây
lúa và cây họ đậu. Mức độ nhiễm nấm Rhizoctonia solani ở khu vực nhiệt đới
là 40%. Ở nƣớc ta, bệnh gây hại ở các vùng trồng đậu đỗ thuộc đồng bằng,
trung du và miền núi. Bệnh có thể phá hoại trong suốt thời kỳ sinh trƣởng của
cây nhƣng chủ yếu vào thời kỳ cây con. Bệnh nặng làm cây con chết hàng
loạt nên còn đƣợc gọi là bệnh chết rạp cây con. Nấm gây bệnh có thể phá hại
cùng với loại nấm khác nhƣ Fusarium solani fsp. phaseoly.
Bệnh hại vào thời kỳ cây con mới mọc gây héo và chết cây con. Vết
bệnh lúc đầu chỉ là một chấm nhỏ, màu đen ở phần gốc sau đó lan nhanh bao
bọc xung quanh cổ rễ làm cổ rễ khô tóp lại, cây gục xuống và chết nhƣng thân

Số hóa bởi trung tâm học liệu
7
lá vẫn còn màu xanh. Trên vết bệnh có lớp nấm màu trắng xám. Vết bệnh thối
mục, có màu nâu đen ủng và lan nhanh khi gặp trời mƣa. Nấm Rhizoctonia
solani thuộc nhóm Mycelia sterilia. Nấm R. solani là nguyên nhân ngăn cản
sự nảy mầm và gây bệnh ở cây con. Sợi nấm kí sinh có màu vàng và khi già
chuyển dần sang màu nâu. Sợi nấm mảnh 4 – 12 µm tỷ số chiều dài trên rộng
là 5/1. Sợi nấm phân nhánh góc bên phải và có ngăn ở cuối cùng. Hạch nấm
dạng hạt dẻ màu nâu đến đen.

hại ở các bộ phận của cây nhƣ lá, thân, cành, quả và hạt. Giai đoạn cây con
vết bệnh là các vết đốm màu nâu ƣớt, hơi lõm trên lá mầm và phát triển xuống
thân, lá mầm bị bệnh thƣờng rụng sớm. Bệnh nặng thƣờng gây chết cây con.
Vết bệnh trên lá thƣờng biểu hiện các vết chết hoại có màu nâu đỏ trên gân
lá, gây thối gân. Bệnh có thể gây hại trên phiến lá là các vết bệnh hình bầu
dục, màu nâu, hơi lõm, xung quanh có viền nâu đỏ, trên bề mặt vết bệnh có
các chấm đen nhỏ là các đĩa cành của nấm gây bệnh. Lá bị bệnh thƣờng quăn
lại dễ bị rụng. Trên thân cành, cuống lá và vỏ quả vết bệnh có màu nâu, vết
bệnh thƣờng bị bao phủ bởi các đĩa cành có màu nâu. Hạt nhiễm bệnh thƣờng
nhỏ, nhăn nheo, trên bề mặt hạt có các vết xám, sau chuyển sang màu nâu
hoặc nâu đen. Cây bệnh phát triển kém, nếu nhiễm ở giai đoạn sớm cây đậu
không có khả năng phát triển quả. Một số cây bệnh trên thân và hạt có thể
không mang triệu chứng nhƣng nấm nhiễm hệ thống ở bên trong. Bệnh hại do
nấm Colletotrichum truncatum, bộ Melanconiales, lớp Nấm Bất toàn. Tản
nấm hầu nhƣ không xuất hiện, nếu có thƣờng rất mỏng màu sáng hoặc trắng
hồng. Sợi nấm đa bào, không màu. Đĩa cành mọc đơn lẻ hoặc tập trung thành
từng đám. Lông bám trên đĩa cành màu nâu hoặc màu đen, thƣờng dài hơn
cụm bào tử phân sinh. Bào tử phân sinh tập trung thành cụm, có màu trắng,
trắng đục hoặc vàng nhạt đến vàng da cam. Bào tử phân sinh không màu, thon
dài hơi cong và nhọn ở hai đầu, kích thƣớc 15 – 27 x 2 – 5 µm. Lông của đĩa

Số hóa bởi trung tâm học liệu
9
cành màu nâu hoặc màu đen, có từ 0 – 9 ngăn ngang, kích thƣớc 50 – 468 x 2
– 7 µm. Nấm gây bệnh có thể nhiễm hệ thống và biểu hiện triệu chứng sau
khi cây đã thuần thục. Sợi nấm có thể tồn tại trong nội nhũ và phôi hạt. Bào tử
nấm nảy mầm hình thành 1- 2 ống mầm ngắn, từ đó sinh ra các giác bám xâm
nhập qua biểu bì của cây. Gặp điều kiện thuận lợi nhiệt độ 20 – 25
0
C, có giọt

(3mm) lúc đầu ngậm nƣớc trong giọt dầu, vàng nhạt, về sau chuyển sang màu
nâu đen, vết bệnh có góc cạnh, không đều đặn. Nhiều vết bệnh liền nhau, chi
chít trên phiến lá. Khi ẩm ƣớt từ vi khuẩn có thể tiết ra màng dịch vi khuẩn.
Bệnh có thể hiện trên thân và quả. Vi khuẩn gây bệnh có dạng hình gậy, kích
thƣớc từ 1,2 - 1,5 x 2,3 – 3 µm có lông roi ở một đầu, có vỏ nhờn, gram âm,
chịu axit kém. Khuẩn lạc của vi khuẩn có màu trắng xám, nhẵn bóng. Vi
khuẩn có khả năng phân giải sữa, tạo NH3, có khả năng rất yếu hoặc không
tạo ra khí indol, không khử nitrat, không phân giải gelatin. Nhiệt độ thích hợp
cho vi khuẩn sinh trƣởng phát triển là 24 - 26
0
C, nhiệt độ tối đa là 35
0
C và tối
thiểu là 2
0
C. Nhiệt độ làm cho vi khuẩn chết là 48 - 49
0
C trong 10 phút. bệnh
đốm góc do vi khuẩn Pseudomonas glycinea.
Nguồn bệnh của hai loài vi khuẩn gây bệnh đốm lá đậu tƣơng tồn tại chủ
yếu trên hạt giống, trên tàn dƣ cây bệnh. Vi khuẩn không truyền qua đất vì nó
rất nhanh bị chết ở trong đất khi tàn dƣ đã mục. Bệnh đốm lá vi khuẩn phát
sinh phát triển thuận lợi trong điều kiện thời tiết nóng ẩm. Nhiệt độ thích hợp
nhất để bệnh phát triển 26 -30
0
C. Bệnh phát sinh gây hại ở tất cả các thời vụ
trồng đậu tƣơng, mức độ nhiễm bệnh ở mỗi thời vụ có khác nhau. Vụ đậu
tƣơng xuân và hè thu, bệnh thƣờng phát sinh gây hại nặng. Còn ở vụ đậu
tƣơng đông thì bệnh thƣờng phát sinh gây hại nhẹ hơn. Hầu hết các giống đậu
tƣơng đang gieo trồng ngoài sản xuất đều có thể nhiễm bệnh, bệnh có xu thế

0
C, mặc dù nhiều giống đậu tƣơng không thể hiện rõ rệt triệu chứng
ở bất kể nhiệt độ [30].

Số hóa bởi trung tâm học liệu
12
Đây là một trong những bệnh quan trọng nhất ở nhiều nơi trên thế giới.
Mức độ của bệnh tùy thuộc vào giống và khí hậu. Năng suất có thể giảm trên
25%. Bệnh đƣợc ghi nhận đầu tiên ở Mỹ vào những năm đầu của thập niên
1900. Bệnh hiện diện ở khắp các vùng trồng đậu tƣơng trên thế giới. Khi bệnh
xuất hiện sớm sẽ dẫn đến thất thu nặng.
Ở những vùng sản xuất đậu tƣơng chính của miền Bắc Hoa Kỳ , nguồn
lây bệnh SMV có nguồn gốc từ hạt bị nhiễm SMV. Lây lan thứ cấp có thể xảy
ra trong và giữa các vùng trồng đậu tƣơng thông qua các hoạt động của hơn
30 loài rệp khác nhau, chúng có thể nhiễm và lan truyền SMV [30].
Ở ĐBSCL, từ vụ đông xuân 79-80, bệnh tỏ ra khá phổ biến. Bệnh có thể
xuất hiện khá sớm (vào 4 tuần sau khi gieo) và gây thiệt hại nặng ở những
ruộng không đƣợc trị bệnh kịp lúc.
Nhiễm SMV có thể dẫn đến thiệt hại năng suất nghiêm trọng do dị dạng
hoa , làm giảm lớp vỏ , giảm bớt số lƣợng và trọng lƣợng của hạt, và những
cây nhiễm bệnh sớm thƣờng dẫn tới tổn thất lớn hơn. Chất lƣợng hạt giảm
cũng là một kết quả của sự biễn đổi màu hạt do SMV gây ra (hạt đậu bị nhiễm
bệnh có các vết màu nâu đỏ hoặc những vết lốm đốm trên vỏ hạt ). Những vết
lốm đốm này làm giảm hiệu quả kinh tế của hạt đậu tƣơng vì chúng sẽ bị loại
ra khi đƣợc đƣa vào sử dụng [30].
Lá bị mất màu, loang lổ giống nhƣ tấm khảm. Lá nhỏ lại, phát triển
không đều, bìa lá cong xuống làm lá biến dạng. Phiến lá bị xếp nếp nhăn
nhúm, có màu loang lổ xanh nhạt và xanh đậm và thƣờng dày hơn lá bình
thƣờng. Dọc gân lá, mô tế bào nổi rộp lên những mụn màu xanh đậm. Triệu
chứng bệnh trên lá trông gần giống triệu chứng bệnh đậu tƣơng bị ngộ độc

14
lan truyền do rệp làm môi giới và sự lan truyền từ cây bệnh sang cây khoẻ do
rệp ở ngoài đồng vẫn là chủ yếu.
Soybean mosaic virus (SMV) thuộc Chi Potyvirus, Họ Potyviridae, là
một trong những loại virus gây bệnh quan trọng nhất ở cây đậu tƣơng
(Glycine max [L.] Merr). và bệnh khảm lá đậu tƣơng do SMV gây ra gặp ở
hầu hết các quốc gia trên thế giới. SMV có thể gây ra thiệt hại đáng kể về sản
lƣợng, làm suy giảm năng suất đậu tƣơng tới 40% khi các cây bị nhiễm hoặc
trƣớc khi ra hoa [17] và 91% hạt đậu có vết lốm đốm; ở một số trƣờng hợp có
thể gây thiệt hại lên tới 94% tổng sản lƣợng. Sau khi nhiễm SMV, đậu tƣơng
sẽ giảm năng suất và chất lƣợng hạt [17]. Họ Potyviridae có số lƣợng lớn nhất
trong số các loại virus thực vật đƣợc biết đến [24].
Hệ gen của SMV gồm các gen mã hóa cho 3066 amino acid, gồm 10
chuỗi polypeptid: P1 proteinase (P1), Helper component proteinase (HC-
pro), Protein P3 (P3), 6 kDa protein 1(6K1), Cytoplasmic inclusion protein
(CI), 6 kDa protein 2 (6K2), Viral genome-linked protein (VPg), Nuclear
inclusion protein A (NIa), Nuclear inclusion protein B (NIb), Capsid
protein (CP) (Hình 1.2).
Hệ gen của BYMV gồm các gen mã hóa 3056 amino acid, và cũng gồm
10 chuỗi polypeptid giống nhƣ hệ gen của SMV.
Hình 1.2: Sơ đồ các gen trong hệ gen của SMV
Số hóa bởi trung tâm học liệu
15
Won-Seok Lim và đtg (2003) đã phân tích trình tự nucleotide hoàn

do hai residues (18-20) và có sự giống nhau rõ rệt về trình tự. Khu vực protein
nhân cũng diễn ra sự đồng nhất trong cả hai trình tự (65%) và độ dài (214 –
217 residues).
Trình tự CP của bốn dòng SMV đã đƣợc xác định rõ. Đó là các SMV -
VA, -N, -G2, và G7. Hạt potyvirus đƣợc tạo thành từ khoảng 2000 tiểu đơn vị
CP sắp xếp theo hình xoắn ốc xung quanh một bản sao đơn của virus RNA
(Shukla et al, 1994). Mỗi nucleocapsid dài khoảng 3.3 nm với 7-8 tiểu đơn vị
CP mỗi vòng xoắn. Ƣớc tính có 6 nucleotide liên kết với mỗi tiểu đơn vị CP.
Những nghiên cứu cho thấy các gen CP có thể dễ dàng phân ly thành
các tiểu đơn vị cấu thành trong môi trƣờng có nồng độ muối cao hoặc độ pH
nhỏ hơn 6 hoặc lớn hơn 9. Bằng cách điều chỉnh các nhân tố này, các tiểu đơn
vị CP dễ dàng hình thành các hạt xoắn khúc dài mà không cần đến RNA .
Các tiểu đơn vị lần đầu tổ hợp tạo thành những vòng xoắn xếp chồng lên
nhau, mỗi vòng dài khoảng 40 nm sau đó sẽ tổ hợp thêm tạo thành các hạt
mảnh có đƣờng kính 11 nm và độ dài khác nhau , có thể dài đến vài micromet
(McDonald và Bancroft , 1977; Shukla et al, 1994). Ngoài ra, virus có thể
hình thành trực tiếp từ các monomers của tổ hợp lắp ráp nhỏ, các hạt kiểu
stacked-ring tách rời bởi RNA xung quang trƣớc khi tổ hợp lại.
1.3. KỸ THUẬT RNAi VÀ ỨNG DỤNG TẠO CÂY CHUYỂN GEN
KHÁNG VIRUS
Các loại bệnh virus là một trong những nguyên nhân chính ảnh hƣởng đến
năng suất, chất lƣợng, do vậy hạn chế sự tăng trƣởng về diện tích và sản
lƣợng. Cho đến nay chƣa có một loại thuốc bảo vệ thực vật nào có khả năng
chống lại bệnh do virus gây ra, có nhiều biện pháp khác nhau đang đƣợc sử

Số hóa bởi trung tâm học liệu
17
dụng để kiểm soát bệnh virus trên cây trồng tuy vậy mỗi biện pháp đều có
những hạn chế nhất định. RNAi (RNA interference) đƣợc xem là một trong
những kỹ thuật đem lại nhiều kết quả khả quan và bắt đầu đƣợc ứng dụng