S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn Bộ giáo dục đào tạo
Viện khoa học và công nghệ Việt Nam
VIệN SINH THáI Và TàI NGUYÊN SINH VậT
o0o Nguyễn Hùng Thanh
Nghiên cứu xác định tần số alen, tần số kiểu gen của gen
mã hóa
S1
-casein có liên quan đến chất l-ợng sữa ở một
số giống dê nuôi tại Việt Nam.
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30 Nguyễn Hùng Thanh Luận án thạc sỹ khoá 12
2
S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn Lời cảm ơn
cú th hon thnh lun vn ny, trc tiờn, tụi mun by t lng bit
n sõu sc ti Ch nhim ti TS. Nguyn Anh - Phũng Sinh hc t bo
sinh sn Vin Cụng ngh Sinh hc - Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam
ó nh hng nghiờn cu, trc tip hng dn v ch bo tn tỡnh cho tụi
trong sut thi gian nghiờn cu.
Tụi cng mong mun c gi li cm n chõn thnh nht ti Ban lónh
o v cỏn b Vin Cụng ngh Sinh hc - Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit
Nam ó to iu kin thun li v trang thit b v c s vt cht giỳp tụi
hon thnh nghiờn cu ny.
NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12
1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỞ ĐẦU
Chƣơng 1 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1
1.6.1. Phân tích protein 20
1.6.1.1. Điện di điểm đẳng điện (IEF) 20
1.6.1.2. Điện di mao quản (CZE) 21
1.6.1.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) 23
1.6.2. Phân tích ADN 24
1.6.2.1. AS-PCR 24
1.6.2.2. PCR-RFLP 25
1.6.2.3. Realtime-PCR 26
1.7. NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN CSN1S1 CỦA DÊ 26
1.7.1. Đặc điểm di truyền của gen CSN1S1 của dê 27
1.7.2. Ứng dụng của các nghiên cứu đa hình di truyền gen CSN1S1của dê 29
Chƣơng 2 34
NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12
2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 34
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu 34
2.1.1.1. Dê Alpine 34
2.1.1.2. Dê Saanen 36
2.1.2. Mẫu nghiên cứu 37
2.1.3. Các hóa chất và bộ kit 38
2.1.4. Dụng cụ và trang thiết bị 38
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39
2.2.1. Xác định kiểu gen các cá thể 39
2.2.1.1. Tách chiết ADN tổng số 39
2.2.1.2. Thiết kế mồi và thực hiện phản ứng AS - PCR phân biệt alen E và alen non-E
40
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
AE
Elution buffer
AFLP
Amplified Fragment Length Polymorphism PCR
AL
Lysis Buffer
AS-PCR
Allele specific polymerase chain reaction
(PCR đặc hiệu alen)
ATL
Tissue Lysis Buffer
AW
Wash buffer
CZE
Capillary zone electrophoresis
(Điện di mao quản)
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic acid
Gen CSN1S1
Gen mã hóa alpha-S1-casein
IEF
Isoelectric focusing
(Điện di điểm đẳng điện)
KCal
KiloCalo
KJ
DANH MỤC BẢNG
Chƣơng 1
Bảng 1.1. So sánh thành phần sữa dê, sữa bò, sữa ngƣời
11
Bảng 1.2. Thành phần amino acid của các loại sữa
13
Bảng 1.3. Giá trị phần trăm diện tích pic so với phân đoạn casein tổng
số của các kiểu gen đã đƣợc xác định trƣớc
25
Bảng 1.4. Giá trị phần trăm diện tích pic so với phân đoạn casein tổng
số của các kiểu gen đã đƣợc xác định trƣớc
25
Bảng 1.5. Thuộc tính của sữa của các kiểu gen và quá trình chế biến
pho mát
34
Bảng 1.6. Chỉ số cảm quan của pho mát
34
Chƣơng 3
Bảng 3.1. Kiểu gen các cá thể dê nghiên cứu
54
Bảng 3.2. Thành phần kiểu gen của nhóm cá thể dê Alpine nghiên cứu
56
Bảng 3.3. Kiểu gen của các cá thể dê Alpine nghiên cứu
57
Bảng 3.4. Thành phần kiểu gen của nhóm cá thể dê Saanen nghiên cứu
DANH MỤC HÌNH
Chƣơng 1
Hình 1.1. Điện di đồ SDS-PAGE của casein sữa
9
Hình 1.2. Cấu tạo một micelle casein
10
Hình 1.3. Điện di điểm đẳng điện với gradient pH 2,5-5,0 và 4,0-6,5 các
mẫu sữa
23
Hình 1.4. Hình ảnh điện di mao quản của các mẫu sữa
24
Hình 1.5. Sắc ký đồ RP-HPLC của các mẫu casein đã đƣợc phân tích
trƣớc đó bằng IEF và PCR
26
Hình 1.6. Đồ thị tín hiệu huỳnh quang và nhiệt độ của phản ứng
Realtime-PCR
28
Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc gen CSN1S1 của dê và bò, gen CSN1S1 dài
17,5 kb, bao gồm 19 exon
29
Hình 1.8. Sơ đồ quá trình đột biến tạo thành các alen CSN1S1
Chƣơng 3
Hình 3.1. Điện di đồ ADN tổng số tách từ mẫu máu dê
51
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR của cá thể có kiểu gen A*A*, A*E
và EE
52
Hình 3.3. Điện di đồ các cá thể có alen non-E
53
Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm PCR cắt bằng enzyme XmnI.
54
Hình 3.5. Tần số các kiểu gen của nhóm cá thể dê Alpine
56
Hình 3.6. Tần số các kiểu gen của nhóm cá thể dê Alpine
59
Hình 3.7. Tần số alen của nhóm cá thể dê Alpine nghiên cứu
61
Hình 3.8. Tần số alen nhóm cá thể dê Saanen nghiên cứu
62
Hình 3.9. Biểu đồ tần số alen của 2 giống dê nghiên cứu
63
Hình 3.9. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng protein trong sữa của các kiểu
gen
64
Hình 3.11. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng casein trong sữa của các kiểu
gen
66
Hình 3.12. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng lipid trong sữa của các kiểu gen
thành phƣơng pháp chọn lọc nhanh, chính xác với hiệu quả cao bên cạnh các
phƣơng pháp chọn lọc truyền thống [5]. Phƣơng pháp này cho phép xác định
chính xác và sớm kiểu gen của các locus gen mã hoá protein sữa ở các cá thể
dê không phụ thuộc lứa tuổi và giới tính.
Trong số bốn loại casein sữa dê (α
S1
-, α
S2
-, β- và κ-casein) thì α
S1
-
casein là đa hình nhất. Alen A có tác dụng đáng kể lên hàm lƣợng protein,
hàm lƣợng casein, hàm lƣợng lipid và các đặc tính sản xuất khi so sánh với
alen E và F [78]. Sản lƣợng pho mát của kiểu gen AA cao hơn 15% kiểu gen
FF và có mùi thơm dễ chịu hơn [65] [67]. Do đó, vì mục đích kinh tế, sự ảnh
hƣởng của hiện tƣợng đa hình của locut CSN1S1 đã đƣợc điều tra nghiên
cứu, tần số alen đã đƣợc xác định ở một vài quốc gia. [59]
Trên cơ sở của hàm lƣợng α
S1
-casein trong sữa, biến dị của gen
CSN1S1 có thể phân thành 4 nhóm: alen mạnh, alen trung bình, alen yếu và
alen vô hiệu [10]. Các nhóm alen này có thể phân biệt bằng nhiều phƣơng
pháp khác nhau: AS-PCR, PCR-RFLP, Realtime-PCR, điện di điểm đẳng
điện (IEF), điện di mao quản (CZE), sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-
HPLC), phổ hồng ngoại gần; trong đó AS-PCR, PCR-RFLP là những phƣơng
pháp đƣợc ứng dụng rộng rãi nhất.
NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12
2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
- Châu Đại Dƣơng: 1 triệu con, chiếm 0,2%
Nhƣ vậy châu Á là nơi chăn nuôi dê khá phát triển, đặc biệt lại tập
trung chủ yếu ở những nƣớc đang phát triển (90% trong tổng số dê trên thế
giới và chăn nuôi chủ yếu ở khu vực gia đình với qui mô đàn nhỏ, tập trung ở
những vùng khô cằn, nông dân nghèo).
NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12
2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Chăn nuôi dê ở những nƣớc phát triển có quy mô đàn lớn hơn và chăn
nuôi dê theo phƣơng thức thâm canh với mục đích lấy sữa và làm pho mát
mang lại hiệu quả kinh tế cao.
Ấn Độ là nƣớc có ngành chăn nuôi dê rất phát triển. Tổng đàn dê Ấn
Độ năm 1992 là 117 triệu con, từ năm 1989 đến năm 1992 tăng hàng năm là
3,29% tƣơng đƣơng 1,55 triệu con. Ấn Độ có trên 20 giống dê, hàng năm sản
xuất ra hơn một triệu tấn lông.
Chăn nuôi dê ở Pháp: tổng đàn dê của Pháp có 900.000 con, chủ yếu là
nuôi dê lấy sữa. Toàn bộ sữa dê đƣợc làm thành pho mát ở gia đình hoặc ở
trang trại.
Chăn nuôi dê ở Trung Quốc: tổng số lƣợng dê sữa cả nƣớc có 3,2 triệu
con, hàng năm sản xuất ra 529.000 tấn sữa. Từ năm 1978 Chính phủ bắt đầu
quan tâm và tốc độ phát triển đã ngày càng nhanh chóng. Hiện nay Trung
Quốc có 12 trại dê sữa giống. Giống Ximong Saanen là giống dê phổ biến ở
Trung Quốc. Ở trại giống trƣờng Đại học Nông nghiệp Tây Bắc, sản lƣợng
sữa của dê là 800 kg/con/chu kỳ; ở trại Xixia tỉnh Shangdong là 750
kg/con/chu kỳ. Trung Quốc đã sử dụng dê Ximong, Saanen lai với dê địa
phƣơng. Con lai năng suất sữa đã tăng lên 80-100% ở thế hệ thứ nhất, thế hệ
thứ hai lên đến 200%, đạt 300kg sữa/chu kỳ, thời gian vắt sữa là 7-8 tháng. Ở
một số nơi thế hệ 3, 4 đạt đƣợc 500-600 kg/chu kỳ tiết sữa. Hiện nay, Trung
nuôi dê và tổ chức chuyển giao kỹ thuật xây dựng ngành chăn nuôi dê ở Việt
Nam. Từ đó đến nay ngành chăn nuôi dê đặc biệt là chăn nuôi dê sữa ở Việt
Nam đã bắt đầu đƣợc khởi sắc. Chăn nuôi dê đã góp một phần vào việc
chuyển đổi cơ cấu cây trồng vật nuôi trong hệ thống nông trại bền vững ở gia
NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12
4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
đình đặc biệt là vùng trung du đồi núi dân nghèo nƣớc ta. Tuy nhiên đây là
một ngành chăn nuôi rất mới mẻ ở nƣớc ta, vì vậy để tạo cho nghề chăn nuôi
dê phát triển một cách mạnh mẽ, tận dụng hết đƣợc tiềm năng sẵn có của
nƣớc nhà, cần thiết phải có sự quan tâm một cách thích đáng trong việc đầu tƣ
cơ sở vật chất kỹ thuật, trong nghiên cứu, trong việc xây dựng mô hình đặc
biệt là việc đào tạo chuyển giao kỹ thuật thích hợp về chăn nuôi dê cho các
cán bộ kỹ thuật cũng nhƣ cho ngƣời dân chăn nuôi con gia súc này [4].
1.2. ĐẶC ĐIỂM SỮA DÊ
1.2.1. Thành phần protein
Sữa có chứa hàng trăm loại protein nhƣng hầu hết trong số này chỉ
chiếm một lƣợng rất nhỏ. Protein có thể đƣợc phân loại theo nhiều cách dựa
vào tính chất hóa học hay vật lý, và chức năng sinh học của chúng. Thông
thƣờng, ngƣời ta phân loại protein sữa thành casein, whey protein và các
protein hàm lƣợng thấp. Protein nằm ở bề mặt của giọt chất béo và các
enzyme thì thuộc vào nhóm protein hàm lƣợng thấp.
1.2.1.1. Whey protein
Whey protein là tên gọi thông dụng để chỉ các protein huyết thanh của
sữa, tuy nhiên theo chuyên ngành nó chỉ bao gồm các protein trong whey thu
đƣợc qua quá trình sản xuất pho mát. Nếu casein đƣợc tách ra khỏi sữa gầy
bằng cách bổ sung acid khoáng thì một nhóm protein vẫn còn lại trong dung
dịch sữa và đƣợc gọi là protein huyết thanh sữa. Chúng tƣơng tự nhƣ các
Hình 1.1. Điện di đồ SDS-PAGE của casein sữa [8]
Điều này khiến casein dễ dàng tạo chuỗi polymer có chứa một vài loại
casein giống hay khác nhau. Do có nhiều nhóm phosphat và những nhóm kỵ
nƣớc trong phân tử casein, các phân tử polyme đƣợc hình thành từ casein rất
đặc biệt và bền. Những phân tử này đƣợc cấu tạo từ hàng trăm và hàng nghìn
những phân tử đơn lẻ và hình thành nên dung dịch keo, tạo nên màu trắng của
sữa. Những phức chất này đƣợc gọi là các micelle casein. Hình 1.2 cho thấy
các micelle casein bao gồm một phức hợp các dƣới-micelle, có đƣờng kính từ
10 đến 15 nm. Một micelle với kích thƣớc trung bình có tới 400 đến 500
dƣới-micelle và có thể có kích thƣớc lớn tới 0,4 µm.
NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12
7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 1.2. Cấu tạo một micelle casein. Chú thích: A: dưới-micelle; B: chuỗi bề
mặt; C: Canxi phosphat ; D: κ-casein; E: nhóm phosphat
Canxi photphat và tƣơng tác kỵ nƣớc giữa các dƣới-micelle đảm bảo
cho tính bền vững của cấu trúc micelle casein. Phần ƣa nƣớc của κ-casein có
chứa nhóm carbohydrate, nhóm này đính ở bên ngoài của các micelle phức
hợp (B trong Hình 1.2), tạo nên một “lớp tóc”, nhƣng quan trọng hơn là
chúng giúp các micelle bền vững, chống lại sự kết tụ.
Casein và các nhóm carbonhydrate của nó rõ ràng rất quan trọng trong
sản xuất pho mát. Đƣợc sử dụng trong công đoạn đầu tiên của quá trình sản
xuất pho mát, men dịch vị loại bỏ carbonhydrate của casein ra khỏi bề mặt
của micelle. Do đó các micelle sẽ mất đi khả năng hòa tan và liên kết với
nhau để tạo thành sữa đông.
KCal
69
61
70
KJ
288
257
291
Protein
3,56
3,29
1,20
Casein tổng số
2,11
2,70
0,40
Nguyễn Hùng Thanh Luận án thạc sỹ khoá 12
9
S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn
S1
-casein (% casein tng s)
5,6
38,0
S2
-casein (% casein tng s)
0,20
Canxi (mg)
134
119
32
St (mg)
0,05
0,05
0,03
Magie (mg)
14
13
3
Photpho (mg)
111
93
14
Kali (mg)
204
152
51
Natri (mg)
50
49
17
Km (mg)
0,30
0,38
0,17
Vitamin B1 (àg)
58
Vitamin D (àg)
0,11
0,03
0,04
NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Vitamin E (mg)
0,03
0,09
0,34
Vitamin C (mg)
1
1
4
Cholesterol (mg)
12
15
20
Bảng 1.2. Thành phần amino acid của các loại sữa [32]
Sữa dê
Sữa bò
Sữa ngƣời
Protein tổng số (g/l)
28–32
16
Tyrosine
38
53
46
Threonine
49
51
44
Tryptophan
–
14
17
Valine
61
68
51
Amino acid thay thế (mg/g protein)
Aspartate
75
79
86
Glutamate
209
208
190
Alanine
34
35
40
ca ỏnh sỏng, gúp phn lm cho sa cú mu trng tinh.
Sa dờ cú cha nhiu cht khoỏng v cht vi lng: 80% tinh cht sa
v 20% vỏng sa, cựng rt nhiu vitamin A v B
2
, kali, mangan, clorit, ng,
canxi. Mt cc sa dờ cha 33% lng canxi cn thit mi ngy, lng natri
t nhiờn cng di do v nhiu protein hn cỏc loi sa khỏc. c bit, hm
lng vitamin A tỡm thy trong sa dờ u c hỡnh thnh t nc gi l
vitamin A s khai, nờn c th khụng cn n cụng on chuyn hoỏ. iu
ny giỳp c th tng kh nng chuyn hoỏ nng lng. Cỏc cht bộo cú trong
sa dờ u di dng chui mt xớch vi hm lng ớt bộo gn ging vi sa
m, nờn khi ung, sa dờ tiờu hoỏ tt hn. Vi tr nh, mt cc sa dờ m vo
bui ti, s cho bộ mt gic ng ngon lnh. Lng cholesterol trong sa li rt
ớt. So sỏnh vi sa bũ thụng thng thỡ sa dờ cú nhiu vitamin D, canxi v
photpho hn, iu rt thun li cho s cu to xng. Tuy nhiờn sa dờ cú
cha ớt cht st v folic acid hn sa bũ. S khỏc bit trong thnh phn ca
Nguyễn Hùng Thanh Luận án thạc sỹ khoá 12
12
S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn
sa bũ v sa dờ cng lm cho tớnh cht vt lý ca chỳng khỏc nhau. Vớ d
nh sa dờ cú tớnh bn nhit thp hn sa bũ, trong khi tớnh m ca sa dờ
li cao hn ca sa bũ [9, 12, 23, 29, 39, 40, 56, 83].
1.2.3. Giỏ tr dinh dng ca sa dờ
Sa dờ l thc phm t nhiờn gn nh hon ho. Nú cú cu trỳc húa
hc tng t sa m. Thnh phn protein ca nú cha cỏc acid amin cn
thit. Sa dờ cha ớt cht bộo hn sa bũ, khụng cha cht bộo phõn t lng
cao nh sa bũ v thng c dựng cho tr em khụng th ung sa bũ hoc
cho nhng ngi gp nhng vn v tiờu hoỏ vi sa bũ. Sa dờ cú th
1.3. PHƢƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG CHỌN GIỐNG DÊ SỮA Ở
VIỆT NAM
1.3.1. Chọn giống dê sữa cái hƣớng sữa
Chất lƣợng dê sữa phụ thuộc: ngoại hình, khả năng tiết sữa, phẩm chất
chăn nuôi, dòng giống.
1.3.1.1. Ngoại hình
Nên chọn dê cái có các đặc điểm: Đầu rộng, hơi dài, cơ chắc khoẻ, vẻ
mặt linh động. Hàm dài khoẻ. Cổ dài, mềm mại, nhọn về phía đầu. Lƣng
thẳng, sƣờn cong và xiên về phía sau. Chân trƣớc thẳng, cân đối. Hông rộng,
hơi nghiêng đảm bảo cho dê cái có bầu vú gắn chặt vào phần bụng. Những
mạch máu lớn nổi rõ ở phía sau. Khớp mắt cá thẳng tránh cho dê khi đi không
làm ảnh hƣởng tới các mạch máu trên bầu vú. Những núm vú to dài từ 4-6 cm
treo vững vàng trên bầu vú, bầu gắn chắc vào phần bụng, gọn về phía trƣớc,
thấy rõ các tĩnh mạch ở phía trƣớc bầu vú, gân sữa (tĩnh mạch) chạy từ bầu vú
lên tới nách chân trƣớc, gân sữa càng gấp khúc dê càng nhiều sữa.
Copyright: Tài liệu đại học ©