SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI
TRƯỜNG THPT CHUYÊN HÀ NỘI-AMSTERDAM
QUẬN CẦU GIẤY
**************
ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT
DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ
LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015)
Tên đề tài: NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM
CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO KHÔNG ĐIỂN HÌNH
(NONTUBERCULOSIS MYCOBACTERIA - NTM)
TRÊN BỆNH NHÂN NGHI MẮC BỆNH LAO
TẠI VIỆT NAM
Lĩnh vực: Y- Sinh
NGƯỜI HƯỚNG DẪN
- Th.S Phan Minh Tuấn
- Phòng Phát triển Công nghệ
Y-Sinh, Trung tâm phát triển
công nghệ cao, Viện Hàn lâm
Khoa học kĩ thuật Việt Nam
TÁC GIẢ:
1. Nguyễn Công Minh

2. Nguyễn Trọng Hiếu
Lớp: 12 Sinh - Trường THPT
Chuyên Hà Nội Amsterdam
Lớp: 12 Sinh - Trường THPT
Chuyên Hà Nội Amsterdam
Hà Nội, tháng 12 năm 2014
1
LỜI CẢM ƠN
Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn công ty Intel đã tổ chức Hội thi

1.LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 10
2.MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 11
3.TÍNH MỚI VÀ SÁNG TẠO CỦA ĐỀ TÀI 12
II.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 12
1.KHÁI NIỆM CHUNG 12
Hình 1: MAC trên môi trường Lowenstein – Jensen sau 6 tuần nuôi cấy 13
2.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 13
Hình 2. Tỉ lệ các ca bệnh do vi khuẩn nhóm NTM gây ra tại khu vực châu Á 14
3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG 15
Bảng 1. Thành phần phản ứng PCR 16
Bảng 2. Chu kỳ nhiệt thông thường cho phản ứng PCR 16
4.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ DỰ KIẾN 17
III.QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU 17
1.THU THẬP, VẬN CHUYỂN, BẢO QUẢN MẪU BỆNH PHẨM VÀ CHỦNG VI KHUẨN 17
Bảng 3. Danh sách các mẫu 17
2.XỬ LÝ VÀ KHỬ TẠP MẪU BỆNH PHẨM 18
3.TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MAC 19
4.KIỂM TRA KẾT QUẢ SẢN PHẨM PCR 20
Hình 3: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm thông tin qua từ khóa “mycobacterium” trên cổng thông tin
3
NCBI 21
Hình 4: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thông qua từ khóa “mycobacterium 16S” trên
cổng thông tin NCBI 22
Hình 5: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thông qua từ khóa “mycobacterium rpoB” trên
cổng thông tin NCBI 22
Hình 6: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thông qua từ khóa “mycobacterium hsp65” trên
cổng thông tin NCBI 23
Bảng 4. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại DNA tổng số thu từ mẫu 24
5.GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE TRÊN PHẦN MỀM CHUYÊN DỤNG
24

3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG 15
Bảng 1. Thành phần phản ứng PCR 16
Bảng 2. Chu kỳ nhiệt thông thường cho phản ứng PCR 16
4.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ DỰ KIẾN 17
III.QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU 17
1.THU THẬP, VẬN CHUYỂN, BẢO QUẢN MẪU BỆNH PHẨM VÀ CHỦNG VI KHUẨN 17
Bảng 3. Danh sách các mẫu 17
2.XỬ LÝ VÀ KHỬ TẠP MẪU BỆNH PHẨM 18
3.TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MAC 19
4.KIỂM TRA KẾT QUẢ SẢN PHẨM PCR 20
Hình 3: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm thông tin qua từ khóa “mycobacterium” trên cổng thông tin
5
NCBI 21
Hình 4: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thông qua từ khóa “mycobacterium 16S” trên
cổng thông tin NCBI 22
Hình 5: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thông qua từ khóa “mycobacterium rpoB” trên
cổng thông tin NCBI 22
Hình 6: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thông qua từ khóa “mycobacterium hsp65” trên
cổng thông tin NCBI 23
Bảng 4. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại DNA tổng số thu từ mẫu 24
5.GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE TRÊN PHẦN MỀM CHUYÊN DỤNG
24
Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự 25
Hình 7: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự 25
Hình 8: Kết quả trình tự được so sánh với các mẫu đối chứng 27
Hình 9: Kết quả trình tự được so sánh với ngân hàng genethế giới (Genbank) để tìm sự tương đồng 28
IV.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
1.KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ 28
Hình 10: Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ mẫu NTM1 theo 3 quy trình tách chiết 28
2.KẾT QUẢ NHÂN GENE (PCR) 28

2.XỬ LÝ VÀ KHỬ TẠP MẪU BỆNH PHẨM 18
3.TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MAC 19
4.KIỂM TRA KẾT QUẢ SẢN PHẨM PCR 20
Hình 3: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm thông tin qua từ khóa “mycobacterium” trên cổng thông tin
NCBI 21
Hình 4: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thông qua từ khóa “mycobacterium 16S” trên
cổng thông tin NCBI 22
Hình 5: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thông qua từ khóa “mycobacterium rpoB” trên
cổng thông tin NCBI 22
Hình 6: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thông qua từ khóa “mycobacterium hsp65” trên
cổng thông tin NCBI 23
Bảng 4. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại DNA tổng số thu từ mẫu 24
5.GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE TRÊN PHẦN MỀM CHUYÊN DỤNG
24
Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự 25
Hình 7: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự 25
Hình 8: Kết quả trình tự được so sánh với các mẫu đối chứng 27
Hình 9: Kết quả trình tự được so sánh với ngân hàng genethế giới (Genbank) để tìm sự tương đồng 28
IV.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
8
1.KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ 28
Hình 10: Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ mẫu NTM1 theo 3 quy trình tách chiết 28
2.KẾT QUẢ NHÂN GENE (PCR) 28
Hình 11: Kết quả điện của thí nghiệm tìm nhiệt độ bắt cặp và nồng độ DNA tổng số phù hợp 29
Hình 12: Kết quả điện di sản phẩm PCR 30
3.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE 31
4. THỜI GIAN HOÀN THÀNH MỘT LẦN XÉT NGHIỆM 31
V.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32
1.KẾT LUẬN 32
PHỤ LỤC 34

1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Bệnh Lao (Mycobacterium Tuberculosis - MTB) – Tác nhân gây bệnh nhiễm
trùng chiếm tỉ lệ tử vong hàng đầu tại các Quốc gia đang phát triển trong khoảng
15 năm trở lại đây. Cùng với sự bùng phát của đại dịch HIV trên toàn cầu, môi
trường sống ngày càng suy thoái, người nhập cư từ các quốc gia kém phát triển,
bệnh nhân mắc lao bỏ điều trị … ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng miễn dịch của
con người và sức khỏe cộng đồng, và quan trọng nhất sự quay trở lại của bệnh lao
– lao kháng thuốc đã đặt nhân loại một lần nữa đối diện với đại dịch lao tưởng như
đã được thanh toán ở thế kỷ trước.
Còn tại các nước phát triển, nơi bệnh lao về cơ bản được khống chế thì bệnh
10
lao không điển hình (Nontubercolusis Mycobacterium – NTM) lại là tác nhân gây
nhiễm trùng âm thầm và nguy hại đối với các bệnh nhân mắc bệnh liên quan đến
tình trạng miễn dịch.
Tại Việt Nam, nếu trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) là tác nhân
gây nhiễm trùng bệnh viện hàng đầu thì NTM âm thầm đứng ở vị trí thứ 2 về độ
nguy hiểm, và tác hại to lớn của nó với bản thân bệnh nhân, liệu trình điều trị đã
gây ra tổn thất nặng nề về kinh tế, và tâm lý cho người bệnh. Thông thường một
trường hợp nuôi cấy xác định có vi khuẩn lao M.tuberculosis thì vấn đề điều trị
thường đặt ra sớm. Nhưng với một trường hợp nuôi cấy NTM (+) thì không phải
lúc nào cũng đặt vấn đề điều trị mà cần phải cần nhắc giữa nguy cơ và lợi ích cho
người bệnh. Ngoài ra còn thấy rằng có sự khó khăn trong việc điều trị phức tạp và
kéo dài cần kết hợp nhiều loại thuốc hoặc sự nhiễm đồng thời nhiều loại bệnh cơ
hội khác cùng NTM. Vì vậy, việc xác định rõ ràng căn nguyên gây bệnh nhiễm
trùng do NTM và các vấn đề liên quan mang tính cấp thiết và thời sự đối với ngành
Y tế hiện nay.
Từ những thống kê nêu trên, nhóm nghiên cứu quyết định tiến hành đề tài
“Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm chẩn đoán vi khuẩn lao không điển hình
trên bệnh nhân nghi mắc bệnh lao tại Việt Nam” nhằm thiết kế một bộ sinh
phẩm đơn giản, hiệu quả, an toàn và có giá trị thực tiễn và tính linh động cao.

điểm khác biệt là nó được phân tán rộng rãi trong môi trường, đặc tính gây bệnh rất
linh động và không lây từ người này sang người khác. NTM có hơn 140 loài khác
nhau và không nhất thiết liên quan đến bệnh lao nên đôi khi nó được gọi dưới
những tên khác như Vi khuẩn lao không điển hình (atypical tuberculosis), vi khuẩn
lao cơ hội (opportunitic tuberculosis), vi khuẩn lao môi trường (environmental
tuberculosis). Những nghiên cứu dịch tễ gần đây đã ghi nhận sự gia tăng các ca
bệnh NTM xảy ra trên toàn cầu với tỉ lệ cao hơn cả bệnh lao truyền thống.
12
Hình 1: MAC trên môi trường Lowenstein – Jensen sau 6 tuần nuôi cấy
Triệu chứng lâm sàng bệnh biểu hiện ở cả phổi và ở ngoài phổi, trong đó biểu
hiện ở phổi thường gặp hơn. Các triệu chứng toàn thân thường không đặc hiệu như
sốt nhẹ về chiều, mệt mỏi, gầy sút ăn uống kém. Các triệu chứng tại chỗ bao gồm
ho, ho khan, hoặc ho khạc đờm kéo dài. Triệu chứng tại phổi thường là các triệu
chứng của bệnh lao. Ngoài những trường hợp nhiễm trùng biểu hiện tại một số cơ
quan như hạch, da, vết mổ… thì còn có thể có thể gặp tình trạng bệnh toàn phát ở
đa cơ quan.
Trong tổng số các ca bênh Lao ngoài phổi trên thế giới do 140 loài thuộc loại
NTM gây ra. thì có đến hơn 50% trường hợp mắc bệnh do chủng Mycobacterium
avium complex (MAC). Ở Việt Nam nói riêng, số ca bệnh Lao ngoài phổi do chủng
MAC gây ra chiếm đến 95% tổng số. Vì vậy, có thể nói, MAC là chủng vi khuẩn
đáng lo ngại nhất trong các ác loài gây bệnh NTM nói chung.
2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
Đối với nhiều nước trên thế giới, đặc biệt như Mỹ, Nhật… NTM đã được
nghiên cứu và đưa vào chương trình an toàn y tế Quốc gia và được đánh giá là 1
trong những tiêu chí hàng đầu trong công tác chống nhiễm khuẩn tại bệnh viện và
các cơ sở y tế. Những chương trình nghiên cứu về chẩn đoán và điều trị NTM được
tiến hành trên phổ rộng các chủng vi khuẩn NTM. Ngoài ra các kỹ thuật real-time
13
PCR, multiplex PCR, sequencing… được ứng dụng như là những phương pháp
chẩn đoán thường quy tại bệnh viện và các trung tâm nghiên cứu đã giúp các Quốc

quy trình tách chiết DNA phù hợp và hiệu quả với các mẫu nghiên cứu, chúng tôi
đã tiến hành so sánh 3 quy trình tách chiết DNA trong đó một quy trình áp dụng
theo phương pháp kit tách chiết DNA của nhà cung cấp, các quy trình còn lại được
thực hiện dựa vào vào các phương pháp tách chiết truyền thống và theo các tài liệu
tham khảo đồng thời có điều chỉnh cho phù hợp với mẫu.
Phương pháp thiết kế mồi
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Ngân hàng dữ liệu NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) để tìm kiếm các thông tin và kết hợp với hai phần
mềm hiện đại, thông dụng là BioEdit và DNAstar nhằm lưu giữ thông tin và phân
tích sự đa dạng hệ genecủa chi Mycobacterium. Từ đó chọn lọc một số genetiêu
biểu có sự đa dạng di truyền cao giữ các chủng vi khuẩn gây bệnh lao truyền thống
M. tuberculosis và các chủng vi khuẩn lao không điển hình để thiết kế các cặp mồi
tương ứng tại các vùng có độ bảo thủ cao bằng công cụ PrimerSelect trong
DNAstar. Cặp mồi đặc hiệu cho vi khuẩn M. avium complex gây bệnh trên người
có đặc điểm: đoạn trình tự đầu 3’ (từ 1 nucleotide trở lên) của mồi xuôi và ngược
đặc hiệu đối với chủng vi khuẩn M.avium complex nhưng không đặc hiệu đối với
các chủng vi khuẩn lao M.tuberculosis.
Phương pháp PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp) cho
phép nhân một số lượng không giới hạn nguyên bản của một đoạn DNA nhất định
trong thời gian ngắn, nhờ xúc tác của DNA polymerase. Đoạn geneđược nhân lên
15
nhờ cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế. Quy trình PCR được tối ưu ở các yếu tố: nồng độ
DNA ban đầu và nhiệt độ bắt cặp mồi.
Thành phần phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt được thể hiện ở Bảng 1 và 2
Bảng 1. Thành phần phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích(µl)
1 DNA tổng số (100ng) 0.5-2
2 Mồi xuôi (10 pmol) 1.0
3 Mồi ngược (10 pmol) 1.0

∞
1
30
1
Phương pháp đọc và phân tích trình tự nucleotid
Trình tự nucleotid được xác định trên máy xác định tự động ABI PRISM
®
3100 Avant Genetic Analyzer theo bộ kit BigDye
®
Terminator v3.1 Cycle
Sequencing. Trình tự được xác định trên cả hai sợi khuôn và đối nghĩa với việc sử
dụng hai mồi xuôi và ngược. Tuy nhiên, chỉ có một mồi tham gia phản ứng, mồi
đơn này bám vào vùng bổ sung đã được thiết kế trong vector. Hiện nay, có nhiều
phần mềm chuyên dụng xử lý trình tự như PC GENE, Clustal, DNA star, BioEdit,
Chromas… Trong các phần mềm kể trên BioEdit là hệ thống phần mềm tiện dụng
nhất. Chúng tôi sẽ sử dụng BioEdit trong kỹ thuật phân tích trình tự ở đề tài này
16
4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ DỰ KIẾN
Nội dung 1: Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh vi khuẩn lao không điển hình
theo nguyên lý PCR đối với đoạn trình tự đặc trưng cho M.avium complex.
- Thu thập chủng vi khuẩn và mẫu bệnh phẩm MAC từ người bệnh (đã được kết
luận là mắc bệnh lao không điển hình bằng phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền
thống) phục vụ nghiên cứu và thử nghiệm.
- Thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn geneđặc trưng cho chủng MAC
- Tối ưu các bước trong quy trình sử dụng kit nhằm mục tiêu sau: chất lượng ổn
định, giảm tối đa thời gian thực hiện, tiết kiệm chi phí, đảm bảo an toàn sinh học
và thân thiện với môi trường.
Nội dung 2: Tạo bộ sản phẩm thử nghiệm
- Xây dựng quy trình chuẩn phát hiện vi khuẩn MAC của bộ sinh phẩm.
- Thử nghiệm bộ sinh phẩm ở cấp độ phòng thí nghiệm, đánh giá độ nhạy, đặc hiệu

điều kiện xử lý sớm bệnh phẩm ngay sau khi thu thập,
- Đóng gói bệnh phẩm: Bệnh phẩm phải được đóng gói trước khi vận
chuyển, bảo đảm không dễ đổ, vỡ, phát tán tác nhân gây bệnh . . . trong quá trình
vận chuyển.
+ Đóng chặt các tube chứa bệnh phẩm, bọc từng tube bệnh phẩm bằng giấy
thấm, buộc chặt.
+ Bọc ra ngoài các túi bệnh phẩm bằng giấy thấm hoặc bông thấm nước có
chứa chất tẩy trùng (cloramine B), đặt gói bệnh phẩm vào túi nilon thứ 2, buộc chặt.
+ Các phiếu thu thập, xét nghiệm bệnh phẩm được đóng gói chung vào túi
nilon cuối cùng, buộc chặt, chuyển vào hộp bảo ôn.
- Vận chuyển bệnh phẩm: Bệnh phẩm được vận chuyển tới phòng thí
nghiệm bằng đường bộ, đường không. thời gian ngắn nhất tính từ thời điểm thu
thập bệnh phẩm.
2. XỬ LÝ VÀ KHỬ TẠP MẪU BỆNH PHẨM
Bệnh phẩm mà nhóm thu thập được là các mẫu ở dạng đờm có nhiễm vi
khuẩn gây bệnh. Liên kết giữa các phân tử đờm và các tế bào vi khuẩn nhìn chung
tương đối chắc chắn; ngoài ra, lớp đờm bao quanh tế bào vi khuẩn sẽ bảo vệ vi
khuẩn khỏi ảnh hưởng của các hóa chất gây phá hủy thành tế bào. Bệnh phẩm
không qua xử lí làm tan đờm sẽ cho lượng DNA tổng số vô cùng ít, không đủ cho
quá trình nhận biết sau này. Vì vậy, việc là sử dụng hóa chất gây tan đờm là một
phần quan trọng của quá trình chẩn đoán bệnh.
2.1Dụng cụ, thiết bị và hóa chất.
- Dụng cụ: pipetter, ống tube 1,5ml, falcon 50ml, đầu type, găng tay y tế,
- Thiết bị: máy li tâm, bể ổn nhiệt ướt, tủ lạnh 4
o
C…
18
- Hóa chất: Cồn kỹ thuật, Cồn tuyệt đối, EDTA, Phenol, Chloroform, Isoamyl
alchohol, NaOH 1M, NALC, TTE, L6, L2, NaCl, RNase, PBS, Acetone, Protease
K, Sodium acetate, Ethidium bromide, Agarose, Isopropanol, nước cất

eppendorf loại 1,5 ml.
+ Bổ sung 1 µl RNase A 10 g/mL. Ủ hỗn hợp trong 1 giờ ở 37
0
C.
+ Thêm 800 µl isopropanol để kết tủa DNA, trộn hỗn hợp bằng cách đảo đều ống
19
và ủ 30 phút ở -20
0
C.
+ Ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 15 phút, thu tủa DNA, rửa DNA ba lần bằng 500
µl dung dịch ethanol 70%.
+ DNA được làm khô, sau đó hòa tan trong nước cất khử ion khử trùng (không có
DNase).
4. KIỂM TRA KẾT QUẢ SẢN PHẨM PCR
4.1Thiết kế mồi đặc hiệu
Do điều kiện kĩ thuật không cho phép, nhóm nghiên cứu chỉ xây dựng đoạn
mồi trên phương diện lí thuyết. Công đoạn chế tạo mồi được thực hiên tại các cơ
sở nước ngoài, nơi có điều kiện kĩ thuật và cơ sở vật chất phù hợp. Tại cơ sở của
nhóm nghiên cứu, sau khi nhận được sản phẩm là các đoạn mồi do nhóm đặt thiết
kế, nhóm tiến hành kiểm tra đoạn mồi với DNA tổng số của chủng gốc Avium
ATCC® 25291
TM
sử dụng phương pháp PCR
Bằng từ khóa “mycobacterium” trên mảng dữ liệu về nucleotide của ngân hàng
dữ liệu Genbank của NCBI có 361314 kết quả hiện thị; trong đó chiếm phần lớn là
162563 trình tự của vi khuẩn lao (M. tuberculosis); 61847 trình tự của vi khuẩn lao
không điển hình M. avium (hình 1). Từ số liệu này cho thấy hệ genecủa vi khuẩn lao
và vi khuẩn lao không điển hình đã nghiên cứu khá sâu và phổ biến trên thế giới.
20
Hình 3: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm thông tin qua từ khóa “mycobacterium”

sản phẩm được tách từ chủng M.avium chuẩn ATCC 25291
Bằng cách sử dụng kĩ thuật PCR với cặp mồi mang tính đặc hiệu với đoạn
gene16S định danh MAC, ta có thể khuếch đại số lượng bản sao của gene; sau đó,
ta kiểm tra sự có mặt của gene bằng phương pháp điện di SafeView™-Classic. Nói
chung, theo lí thuyết, khi mẫu có chứa DNA của NTM, băng DNA sẽ hiện lên và
ngược lại, nếu không có mặt DNA của NTM trong mẫu thì sẽ điện di sẽ không có
băng DNA.
4.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất:
- Dụng cụ: pipetter, ống tube 0.2ml, Parafilm, găng tay y tế
- Thiết bị: máy PCR, máy điện di, máy soi gel
- Hóa chất: PCR master mix, dung dịch agarose, dye SafeView™
4.3Kĩ thuật PCR định tính:
- Thành phần các chất cần bổ sung vào một ống eppendorf cho phản ứng PCR bao
gồm: DNA tổng số từ bệnh phẩm (100 ng); mồi xuôi-For (10pmol); mồi ngược-
Rev (10pmol); DreamTaq™ MasterMix (µl) và nước cất khử ion, khử trùng (µl)
- Tổng tỉ lệ các chất trên phải đạt 25 (µl) (bảng 2.1), tuy nhiên chúng có thể thay
đổi tuỳ theo số lượng DNA thu được từ mẫu bệnh phẩm
- Chu trình nhiệt của phản ứng PCR được đặt với thời gian quy định của mỗi giai
đoạn như sau:
23
Bước Phản ứng Nhiệt độ (
0
C) Thời gian Chu kỳ
1
2
3
4
5
6
Biến tính

* Chuẩn bị mẫu:
- Mẫu được trộn với dung dịch loading dye 6x, Load các mẫu vào từng giếng của
bản điện di
* Điện di:
- Tiến hành điện di với 5 µl dung dịch SafeView™/100ml buffer
- Sau 30 phút, dừng điện di và quan sát bản điện di dưới tia cực tím.
5. GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE
TRÊN PHẦN MỀM CHUYÊN DỤNG
5.1 Kiểm nghiệm tính đúng đắn và độ tin cậy của sản phẩm
Sản phẩm PCR thu nhận ở chuyên đề 2 được đem xác định trình tự nucleotid
để kiểm chứng tính đúng đắn của quy trình.
Trình tự gene được xác định trên máy xác định tự động ABI PRISM® 3100
Avant Genetic Analyzer theo bộ kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle
24
30
25 chu kỳ
96
o
C
96
o
C
60
o
C 72
o
C
4
o
C