24/12/2007

Hà Nội, 9- 2007

Bản quyền thuộc VVSDTTW- Bộ Y Tế Những chữ viết tắt trong báo cáo ARN Axit ribonucleic
ADN Axit deoxyribonucleic
CID Center of Infection Diseases
Trung tâm các bệnh nhiễm trùng
CDC Center of Diseases Control
Trung tâm kiểm soát bệnh tật
ELISA Enzym linked Immunosorbent Assay
Thử nghiệm miễn dịch men
GAC- ELISA IgG Capture ELISA
Kỹ thuật miễn dịch enzym phát hiện IgG
HI Hemagglutination Inhibition test
HT Huyết thanh
FBS Fetal Bovin Serum
IFAT (Immunofluorescent indirect Antibody Technique)
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
IFDT (Immunofluorescent direct Antibody Technique)
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

SXHD Sốt xuất huyết Dengue
TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới
VVSDTTW Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương
VCNSH Viện Công nghệ Sinh học
WHO World Health Organization
(Tổ chức Y tế Thế giới)
WB Western Blot
Mục lục Số TT Nội dung TrangĐặt vấn đề
1
Chơng I.
Tổng quan tài liệu
A. Nghiên cứu virus Dengue gây nên bệnh Sốt

1.2.4.1
Phát hiện kháng thể
18
1.2.4.2
Phân lập virus
20
B. nghiên cứu virus corona gây bệnh viêm đờng
hô hấp cấp SARS ở Việt Nam
1.1
Tình hình nghiên cứu trên thế giới
26
1.2
Các nghiên cứu tại Việt nam
42
Chơng II
Đối tợng và phơng pháp nghiên cứuA. Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh bệnh Sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue
2.1
Đối tợng và vật liệu

phát hiện KT IgG (GAC- ELISA)
60
2.4
Các phơng pháp phân lập và xác định type virus
60
2.4.1
Cấy truyền trên não chuột ổ (1-3 ngày tuổi)
60
2.4.2
Phơng pháp phân lập virus trên tế bào muỗi
Aedes. albopictus dòng C6/36.
61
2.4.3
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
(Direct ImmunoFluorescent Antibody Assay DFA).
64
2.4.4
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
(Indirect ImmunoFluorescent AntibodyAssay IFA).
65
2.4.5
Kỹ thuật Trung hoà giảm đám hoại tử
( Plaque Reduction Neutralization Test - PRNT )
66
2.4.6
Phơng pháp tổng hợp dây chuyền chuỗi nhờ polymerase
(RT-PCR - Polymerase Chain Reaction)
68

C. Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh

Phân lập virus SARS-CoV
78
2.3.2
Tạo plasmid tái tổ hợp.
78
2.3.3
Biểu lộ và tinh sạch kháng nguyên .
79
2.3.4
Phơng pháp hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme tóm bắt
kháng thể IgM (MAC- ELISA)
80
2.3.5
Phơng pháp Western Blot.
81
Chơng III
Kết quả và Bàn luận
A. Kết quả sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh
bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue.
3.1
Nuôi cấy virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus
Dengue type III (D3) và virus Dengue type IV (D4) trên tế bào muỗi
Aedes albopictus dòng C6/36.
82


117
3.3.2
Khuếch đại đoạn gene PreM và E bằng phơng pháp RT-PCR
1183.3.3
Biểu hiện kháng nguyên màng và vỏ của virus Dengue type 1, 2, 3, 4
trong hệ nấm men Pichia pastoris
148
3.3.4
Biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên preM-E (gen preM-env) trong
Pichia pastoris
163
3.3.5
Kiểm tra phản ứng của kháng nguyên DxME tái tổ hợp với kháng thể
kháng virus Dengue tự nhiên bằng Western Blot
167
3.4
Thiết kế cặp mồi và xây dựng kế họach tách dòng gen mã hóa kháng
nguyên vỏ của virus Dengue các type I, II, III, IV.
168
3.5
Chế tạo cộng hợp (Gold monoclonal antibodies) gắn kháng nguyên vào
giá thể (màng thấm Nitrocellulo membrane)
173
3.6
Nghiên cứu dung dịch đệm buffer tối u
dùng trong phản ứng


B. Kết quả sản xuất Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh
bệnh viêm đờng hô hấp cấp (SARS)
3.1
Kháng nguyên tái tổ hợp protein N - SARS-CoV
217
3.2
Xác định các thông số cơ bản cho bộ sinh phẩm MAC-ELISA chẩn
đoán nhiễm virus SARS-CoV
218
3.2.1
Xác định thời gian sử dụng tối u của bộ sinh phẩm.
219
3.2.2
Xác định độ đặc hiệu của Bộ sinh phẩm
220
3.2.3
Xác định độ nhạy của sinh phẩm.
220
3.3
Thành phần bộ sinh phẩm.
221
3.4
Phát hiện kháng thể IgM trong huyết thanh bệnh nhân SARS và nhân
221viên y tế có tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân SARS.

Bàn luận
1
Đặt vấn đề Trong vòng 15 năm gần đây, nhiều dịch bệnh nguy hiểm ở qui mô khu vực cũng
nh toàn cầu đã xảy ra và lần đầu tiên gây ảnh hởng lớn đến nền kinh tế thế
giới. Tất cả các bệnh dịch nguy hiểm này (nh dịch hạnh ấn Độ vào năm 1994,
dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông 1997, dịch viêm não Nipah tại Malaysia, dịch
SARS hay hội chứng hô hấp cấp tính ở Trung Quốc từ năm 2002 đến 2003, và
cúm gia cầm ở vùng Đông Nam
á
từ năm 2003 đến2007) đều có mầm bệnh
từ động vật và phát sinh tại á Châu và dần dà lây lan làm ảnh hởng đến nền
kinh tế thế giới. Với tiến trình toàn cầu hoá hiện nay, chúng tôi thiết nghĩ trong
tơng lai sẽ xảy ra nhiều dịch bệnh ở tầm mức tơng tự. Hơn nữa, do các yếu tố
xã hội, văn hoá và nhân khẩu ở Châu
á
có lẽ vẫn là nơi tiếp tục xuất hiện các
dịch bệnh bắt nguồn từ động vật Việc phát hiện ổ dịch trong chơng trình
chiến lợc dự phòng sớm tại á châu sẽ giúp chúng ta chủ động phát hiện và
ngăn chặn kịp thời các bệnh dịch đã biết đến cũng nh các bệnh dịch mới phát
sinh. Trong các bệnh dịch mới gần đây, nổi lên có dịch SD/ SXHD và Viêm
đờng hô hấp cấp SARS

Sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue (SD/ SXHD) là một bệnh nhiễm trùng cấp
tính do virus Dengue gây ra. Bệnh không có vacxin và thuốc điều trị. Biểu hiện
lâm sàng của SD/ SXHD rất đa dạng từ sốt cao đột ngột kéo dài 2-7 ngày kèm
theo triệu chứng đau đầu, đau cơ, đau xơng, đau khớp, đau bụng cho tới buồn


Ngoài bệnh SD/ SXHD, Hội chứng viêm đờng hô hấp cấp tính nặng (SARS) là
một bệnh dịch mới xuất hiện trên phạm vi toàn cầu. SARS đã xuất hiện tại 23
Quốc gia: Trung Quốc, Hồng Kông, Singapore, Canada, Hoa Kỳ, Việt Nam,
Malaysia, Thái Land Tính đến tháng 04 năm 2004 trên toàn thế giới đã có
tổng số mắc/ tổng số chết là: 3169/ 144 ngời (Theo Tổ chức Y tế Thế giới-
WHO) [39].

Tác nhân gây bệnh SARS là một biến thể họ Corona (Coronaviridae); Một
nhóm virus có thể gây bệnh cho cả ngời và động vật [41]. Trên ngời, Corona
thờng gây ra viêm đờng hô hấp trên, chủ yếu ngời trởng thành. Ngoài ra 3
cũng cần chú ý tới một số loại vi khuẩn, virus cơ hội thờng xuyên có mặt ở
đờng hô hấp của ngời; Có thể góp phần gây ra các bội nhiễm đờng hô hấp
dới và viêm phổi không điển hình trên bệnh nhân SARS.

Virus này có sức đề kháng yếu, tồn tại với động lực lớn trong không khí mát
lạnh khoảng 2- 5 giờ. Virus SARS nhạy cảm với nhiệt độ cao, tia cực tím, các
hoá chất khử trùng

Nguồn bệnh và ổ chứa virus SARS: Cha biết rõ ràng. Ngời có thể là nguồn
bệnh chính trong chuỗi mắt xích lây truyền Ngời- Ngời. Ngời bệnh SARS,
nhất là bệnh nhân nặng đang trong giai đoạn khởi phát và toàn phát là nguồn
truyền nhiễm nguy hiểm. Theo qui luật chung của các bệnh do virus thì SARS
có thể thải mầm bệnh từ 5 đến 15 ngày sau khởi phát. Thời gian ủ bệnh trung
bình 7 ngày; Một số trờng hợp có thể kéo dài tới 14- 15 ngày [32].

Triệu chứng: Hắt hơi, chảy nớc mũi, ngạt mũi, ho, đau họng hoặc khó thởCó

nghiên cứu này là:
1. Xây dựng đợc qui trình kỹ thuật chẩn đoán nhanh và chính xác sốt
Dengue/ sốt xuất huyết Dengue và bệnh Viêm đờng hô hấp cấp (SARS).
2. Sản xuất Bộ sinh phẩm chất lợng cao, dễ sử dụng cho việc chẩn đoán
bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue và bệnh Viêm đờng hô hấp cấp
(SARS).

5
Chơng I.
Tổng quan tài liệu

A. Nghiên cứu virus dengue gây bệnh Sốt Dengue/ Sốt xuất
huyết Dengue ở Việt Nam1.1 Bệnh sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue
1.1.1. Biểu hiện lâm sàng
Sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue đợc chia thành nhiều cấp độ khác nhau tuỳ

C, đau mỏi cơ và các
khớp xơng, đau đầu vùng trán và thái dơng, rất ít gặp mảng xuất huyết dới
da, tỉ lệ tử vong thấp (khoảng 0.018%) [21].
+ Sốt xuất huyết Dengue: Sốt cấp tính cao, kéo dài 2-7 ngày kèm theo nhức
đầu, đau khớp, đau cơ, xuất hiện mảng hoặc chấm xuất huyết dới da, niêm
mạc, xuất huyết nội tạng, hạ sốt do xuất huyết nhiều, xuất hiện các biểu hiện
nh chảy máu mũi, chảy máu chân răng nhiều và kéo dài [21]
+ Hội chứng sốc Dengue: có các biểu hiện tợng tự nh SXHD nhng còn
kèm theo hiện tợng mạch đập nhanh, huyết áp tụt, da lạnh và ớt. Khi sốc sâu,
kéo dài có thể dẫn tới suy thận cấp, rối loạn tiêu hoá, ngừng tim, xuất huyết nội
tạng và tử vong sau 12-24 giờ [30].

ở ngời mắc sốt Dengue thờng thấy các đặc điểm nh: Hạch lympho sng đau
toàn thân, lợng tiểu cầu ít giảm, giãn mạch ngoại vi, bạch cầu giảm, hematocrit
tăng nhẹ. Đối với trờng hợp mắc SXHD thì có thêm các đặc điểm khác nữa
nh: gan to, tiểu cầu giảm, hematocrit tăng hơn 20% so với bình thờng, có biểu
hiện vàng da, xuất huyết phủ tạng hệ tiêu hoá và ngoài tiêu hoá nh não, màng
não nặng có thể chuyển sang các giai đoạn khác nghiêm trọng hơn nh SXHD
thể não (hội chứng não cấp), SXHD thể suy gan cấp

1.1.2 Tác nhân truyền bệnh
Bệnh SD và SXHD lây qua đờng máu. Các nghiên cứu về trung gian truyền
bệnh đã xác định muỗi vằn Aedes aegypti (A.aegypti) là vector chủ yếu, ngoài ra
các loại muỗi khác nh Aedes albopictus, Aedes polynesiens cũng có thể truyền
bệnh SXHD. Muỗi A.aegypti là loại muỗi sống ở trong nhà hoặc xung quanh
nhà. Chỉ có muỗi cái đốt ngời vào ban ngày, chủ yếu vào sáng sớm và chiều tối
[35]. Muỗi cái có thể truyền bệnh sau thời kỳ ủ bệnh 3 đến 10 ngày hoặc có thể
truyền bệnh ngay nếu đang hút máu bệnh nhân dở dang rồi đốt sang ngời khác.
Nơi đậu của muỗi là những chỗ tối tăm trong nhà nh: hốc tủ, gầm giờng, gầm


Sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue là bệnh nhiễm virus cấp tính đang lan tràn
rộng trên thế giới Bệnh thông thờng là nhẹ (sốt Dengue - SD) nhng có thể
H
ình 1.1. Vòng đời của Muỗi8
nặng nếu có xuất huyết (Sốt xuất huyết Dengue- SXHD). Bệnh hay bùng nổ
thành dịch lớn ở những vùng cha từng bị nhiễm virus Dengue và có điều kiện
thuận lợi cho sự phát triển lan tràn của vectơ truyền bệnh.

Dịch Sốt Dengue lần đầu tiên đợc Y văn ghi nhận là vào mùa hè năm 1780 tại
Philadenphia, Hoa Kỳ. Sau đó bệnh đợc thấy ở nhiều nớc nhiệt đới và cận
nhiệt đới Tại châu A, năm 1953, SXHD xuất hiện lần đầu tiên ở Manila
(philipin). Rồi Thái Lan, Indonexia, Singapore, India, Banglades ở vùng Tây
Thái Bình Dơng, có từ 28 đến 35 nớc đã trải qua các vụ dịch SD/ SXHD. Sốt
Dengue và sốt xuất huyết Dengue đã đợc các nớc trên thế giới công nhận là
một vấn đề Y tế công cộng quan trọng [34].

Tại Việt Nam, SXHD đợc phát hiện lần đầu tiên ở miền Bắc vào năm 1958;
Còn miền Nam là năm 1960. Sau đó dịch lan rộng tới hầu hết các tỉnh trong cả
nớc Những năm có dịch lớn là: 1969,1977,1978,1979,1980,1983,1987,1991,
1994, 1998. Hiện nay bệnh SD/ SXHD không chỉ lu hành ở thành thị, khu vực
đông dân c mà còn lan tràn cả các vùng nông thôn đồng bằng, trung du và
miền núi [26].

Theo thống kê cuả TCYTTG thì ở Việt Nam từ năm 1963 đến năm 1988 có số
bệnh nhân mắc trên số bệnh nhân chết về SD/ SXHD là 1.111.734/ 10.415; đây
là số lợng bệnh nhân mắc và chết lớn nhất so với các nớc trong khu vực Đông
Nam A và Tây Thái Bình Dơng, tính trung bình hàng năm có 50.000 - 100.000

trong đó có khoảng 12.000 trờng hợp tử vong hoặc cao hơn nữa nếu nh bệnh
nhân không đợc chẩn đoán và điều trị kịp thời. Đặc biệt vào những tháng đầu
năm 2004, tại Inđônêxia dịch SD/SXHD đã bùng phát mạnh với tổng số trờng
hợp bị nhiễm hơn 80.000, số tử vong là hơn 1000 trờng hợp [17]. 10

Hình 1.2. Bản đồ dịch tễ về tình hình mắc SD/ SXHD trên thế giới
Nhìn vào Hình 1.3, ta thấy bệnh SD/ SXHD hiện đang lu hành tại vùng
Trung, Nam Mỹ và vùng Đông Nam A.
Hình 1.3. Vùng lu hành bệnh SD/ SXHD hiện nay 11

Bệnh SD/ SXHD hiện đang đe dọa tính mạng và sức khỏe tời hàng tỷ ngời nằm
trong khu vực nhiệt đới, A nhiệt đới [14].

1.1.4 Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam
ở Việt Nam, từ năm 1913, Gaide đã thông báo về bệnh Dengue cổ điển ở miền
Bắc và miền Trung. Năm 1929, Boye có viết về một vụ dịch Dengue cổ điển xảy
ra ở miền Nam Việt nam vào năm 1927.

Miền Bắc Việt Nam, vụ dịch SXHD đâu tiên đợc Mirosky. J, F. Vymola,
Hoang Thuc Thuy ghi nhận vào mùa hè năm 1958 [19]. Nhiều tác giả đã mô tả
các đặc điểm lâm sàng của 68 bệnh nhân nằm viện giống hệt nh các nét lâm

Capsid

3
N.R.

V
ựng cu
trỳc
V
ựng khụng
cu trỳc
CAP
5

N.C.R
~ 100 nt
Si ARN n cha khong 11,000 baz
650 prM

E

NS

NS

NS
2a 2b 4a 4bC

1.2.2 Genome của virus
Virus Dengue có hệ gen của Flavivirus điển hình. Genome là một sợi ARN đơn,
dơng có chiều dài xấp xỉ 10200 ribonucleotit. Hệ gen chứa một khung đọc mở
mã hoá thành một chuỗi polyprotein duy nhất. Chuỗi này, sau đó sẽ đợc phân
cắt bởi các enzyme của tế bào vật chủ và các enzyme của virus thành 10 phân tử
protein chức năng, bao gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein phi cấu trúc. Genome
của virus Dengue có cấu trúc phân bố của các gen theo thứ tự nh sau: 5-C-
preM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3 (Hình 1.5). - Đầu 5 không mã hoá dài khoảng 100 nucleotit.
- Đầu 5 không mã hoá dài khoảng 100 nucleotit, đợc metyl hoá đảm
bảo sự bền vững cho vật liệu di truyền. Đầu 3 (không đợc polyadenin hoá)
không mã hoá dài khoảng 400 nucleotit.
H
ình 1.5. Cấu trúc bộ gen của virus Dengue14
- Khoảng một phần t chiều dài của genome tính từ đầu 5 mã cho các
protein cấu trúc: protein lõi (C), protein màng (M), protein vỏ (E). Đoạn gen này


15
+ Protein màng (M) Có hai dạng phụ thuộc vào độ sinh trởng của
virus bao gồm M có khối lợng phân tử 8 kDa và pre_M có khối lợng phân tử
19 23 kDa.

Protein phi cấu trúc

Chức năng của nhóm protein này cha đợc biết một cách đầy đủ. Các
chức năng sinh học này xác định vòng đời của virus . Cấu trúc đoạn gen này khá
giống nhau ở các type virus Dengue khác nhau, đây chính là nguyên nhân gây
lên các phản ứng chéo nhau trong chẩn đoán huyết thanh học.
+ NS1 là glycoprotein ở dạng chất tiết hoặc không tiết, có thể giữ vai
trò sao chép ban đầu
+ NS2 có thành phần là các enzyme quan trọng trong việc sao chép
ARN, helicase và ARN triphotphatase tạo thành cấu trúc đầu 5, protease để
phân cắt polyprotein và liên kết với màng.
+ NS5 thành phần là các enzyme polymerase phụ thuộc ARN có chức
năng phiên mã DNA và enzyme methyltransferase metyl hoá đầu 5.
+ Ngoài ra còn có các vị trí của NS2A, NS2B, NS4A, NS4B. Các
protein này cùng phối hợp thực hiện các chức năng sinh học trong vòng đời của
virus [12].

H
+

H
+

H
+

H
+

H
+

H
+

RCs
+
-
-
+
NC
3-10 h p.i.
dsRN
A
prME
NS1

capsit đợc tổng hợp đủ, chúng tập hợp lại thành một cấu trúc rỗng gọi là
procapsit, sợi ARN dơng đi vào cấu trúc này và kết hợp thành nucleocapsit. 17
Các nucleocapsit này di chuyển đến màng tế bào chất nhờ bộ máy Golgi, sau đó
chúng di chuyển đến mặt trong của màng và đợc bao bọc bởi màng. Các hạt
virus trong một tế bào đợc hình thành và giải phóng ra ngoài do tế bào chủ bị
huỷ hoại. Các nucleocapsit có màng bao chính là màng sinh chất của tế bào chủ
cũ và các virion mới có thể sử dụng các bao màng này để hoà nhập với màng
của tế bào chủ mới (Hình 1.6).

ở trong cơ thể, virus Dengue tăng sinh trong các đại thực bào. Khi cơ thể bị
nhiễm virus Dengue type khác thì những kháng thể có sẵn trong cơ thể không có
khả năng phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên nên không trung hoà đợc kháng
nguyên của virus. Virus xâm nhập vào bạch cầu đơn nhân, số lợng bạch cầu
đơn nhân to tăng lên. Hoạt hoá các CD4, CD8, lympho độc tế bào. Các lympho
T hoạt hoá giải phóng ra nhiều cytokinin, các bạch cầu đơn nhân to nhiễm virus
bị ly giải do đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Xuất hiện thoát huyết
tơng và xuất huyết [15]. Theo thống kê có đợc từ Tổ Chức Y Tế Thế Giới thì
cả bốn type virus đều có thể gây SD, SXHD và shock Dengue.

1.2.4. Đặc điểm kháng nguyên
Virus Dengue mang các kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên gây ngng kết
hồng cầu, kháng nguyên kết hợp bổ thể trên protein màng (E) [15]. Virus
Dengue có nhiều kháng nguyên, trong đó có kháng nguyên đặc hiệu type, kháng
nguyên chung của phân nhóm và của nhóm, dựa vào sự khác biệt giữa các đặc
điểm quyết định kháng nguyên ngời ta phân chia virus Dengue thành 4 type
khác nhau từ virus Dengue type I (D1) đến virus Dengue type IV (D4). Cả 4
type huyết thanh của virus Dengue rất gần nhau về phơng diện kháng nguyên