Bộ Y tế

đề tài KY 01 04

Đề tài nhánh của KY 01 04 Nghiên cứu sản xuất
bộ sinh phẩm MAC-ELISA dùng cho
chẩn đoán viêm no Nhật bản Chủ nhiệm đề tài nhánh KY 01 04
TS. Phan Thị Ngà

6612

Nghiên cứu sản xuất bộ sinh phẩm MAC-ELISA dùng cho chẩn đoán
nhanh bệnh VNNB.
II. Vật liệu:
1. Vật liệu để chế tạo sinh phẩm:
1.1. Động vật thí nghiệm:
- Chuột nhắt trắng giống Swiss loại 2 - 3 ngày tuổi.
- Chuột nhắt trắng giống Swiss 11 - 13 gam.
Do trung tâm nghiên cứu và sản xuất động vật thí nghiệm Viện Vệ Sinh
Dịch Tễ Học Hà Nội cung cấp.

2
1.2. Các hoá chất:
- Sucroza
- axeton.
- axit Boric
- Albumin bò.
- Tá dợc Freund
- Horse - Raddish - Peroxidaza
- Sephacryl S200
- O-Phenylene Diamine (OPD)
- Các muối:
+ axit citric
+ axit H
2
SO
4

+ KCl
+ NaH
2

- Pipet man 8 kênh 50-250 àl
- Đầu típ cho các loại pipet man trên
- Các dụng cụ thuỷ tinh trung tính và các đồ dùng phòng thí nghiệm cần
thiết khác. 3
1.4. Thiết bị phòng thí nghiệm
- Buồng vô trùng
- Máy nghiền não
- Máy li tâm lạnh 4
0
C (10.000 v/p)
- Tủ lạnh 4
0
C, - 20
0
C, - 70
0
C
- Tủ ấm 37
0
C
- Tủ xấy
- Máy đo pH
- Cân chính xác
- Máy hút chân không
- Máy quay điện từ
- Máy đọc ELISA
- Máy đông khô sinh phẩm

C/60 phút.
- Ly tâm 1.800 v/p trong 15 phút loại bỏ nớc nổi. Hoà cặn này bằng
axeton lạnh cho vào trong tube ly tâm 1.800 v/p trong 15 phút loại bỏ
nớc nổi.
- Trải rộng cặn trong tube và làm khô bằng máy hút chân không từ 1 - 2 giờ.
- Làm tan cặn bằng đệm Borat pH.9 có 0,4% Albumin bò để 4
0
C qua đêm.
- Ly tâm 10.000 v/p trong 60 phút ở 4
0
C lấy nớc nổi kiểm tra hiệu giá
bằng phản ứng ngng kết hồng cầu (kháng nguyên dùng cho thử nghiệm
MAC-ELISA hiệu giá phải đạt >1/256).
- Xác định hiệu giá thích hợp dùng cho thử nghiệm MAC-ELISA.
- Đông khô kháng nguyên, kiểm tra lại hiệu giá sau đông khô.
2. Quy trình sản xuất kháng thể virut VNNB gắn HRPO:
2.1. Quy trình sản xuất kháng thể kháng virut VNNB (Nak):
- Cách gây miễn dịch cho chuột Swiss 11- 13 gam:
+ Số lần gây miễn dịch: 5 lần, mỗi lần cách nhau 7 ngày.
+ Liều gây miễn dịch: 0,2 ml hỗn dịch virut (văcxin VNNB) với tá dợc
Freund theo tỷ lệ 1/1
+ Đờng tiêm: Tiêm vào phúc mạc.
- Lấy máu tim để kiểm tra hiệu giá kháng thể (ít nhất là 3 con chuột) sau
mũi tiêm thứ 4.
- Kiểm tra hiệu giá bằng phản ứng ngăn ngng kết hồng cầu hoặc bằng kỹ

5
thuật trung hoà trên tế baò nếu kết quả đạt:
+ Phản ứng ngăn ngng kết hồng cầu hiệu giá > 1/1.000
+ Kỹ thuật trung hoà trên tế bào hiệu giá > 10

2
SO
4
bão hoà để có
nồng độ cuối cùng là 39%.

f. Quay điện từ ở phòng thí nghiệm ít nhất 20 phút.

g. Ly tâm 10.000 v/p trong 20 phút.

h. Loại bỏ nớc nổi và làm tan cặn với PBS (làm nhắc lại nh các bớc e, f,
g, thêm 2 lần nữa.

i. Hoà tan cặn với một lợng PBS nhỏ nhất, thẩm tích trong PBS loại bỏ
(NH
4
)
2
SO
4
ở 4
0
C qua đêm. 6
k. Cho qua cột trao đổi Ion Sephacryl: S200) để chọn các mẫu có chứa IgG
kháng virut VNNB.

l. Hộn các mẫu có chứa IgG, cô đặc bằng áp lực chân không. Kháng thể

quay điện từ 20 phút ở phòng thí
nghiệm.
Thẩm tích trong dung dịch 1M
Acetat pH 4,5 ở phòng thí
nghiệm qua đêm
Điều chỉnh pH tới 9,5 bằng dung
dịch 1M Cacbonat pH 9,6
+

7
nghiệm bằng kỹ thuật HI chọn mẫu xác định dơng tính có hiệu giá >1/80.
Kiểm tra lại bằng thử nghiệm MAC-ELISA từng mẫu huyết thanh riêng
(có đối chiếu với huyết thanh mẫu dơng chuẩn của Viện Nagasaki Nhật
Bản).
- Những mẫu huyết thanh thoả mãn hai điều kiện:
- Hiệu giá HI > 1/80
- MAC - ELISA dơng tính (OD mẫu thử/OD chứng âm >2).

3.2. Chọn mẫu huyết thanh âm tính:
- Huyết thanh ngời lành ở vùng không có lu hành dịch VNNB đợc làm
xét nghiệm kiểm tra bằng kỹ thuật HI và MAC-ELISA xác định âm tính
(có đối chiếu với huyết thanh mẫu âm chuẩn của Viện Nagasaki).
4. Pha các dung dịch đệm cho bộ sinh phẩm.
4.1. Dung dịch phủ bản pH. 9,6:
Na
2
CO
3
1,59 g
NaHCO

2
SO
4
đậm đặc 10,6 ml
(Chú ý cho từ từ axit đậm đặc vào nớc)

8

4.5. PBS tinh thể:
NaCl 8,0 g
KCl 0,2 g
Na
2
HPO
4
1,15 g
KH
2
PO
4
0,2 g
(Khi dùng pha trong 1.000 ml nớc cất)
* Các dung dịch đệm và hoá chất đợc đóng lọ đủ dùng cho từng bộ sinh
phẩm 96 thử nghiệm.

5. Cố định kháng thể IgG kháng IgM ngời đặc hiệu chuỗi à trên phiến
nhựa 96 ghiếng:
- Chuẩn độ hiệu giá kháng thể kháng IgM ngời theo phơng pháp của
Bundo, K. và Igarashi, A. để xác định hiệu giá thích hợp.
- Pha kháng thể kháng IgM ngời trong dung dịch phủ bản pH 9,6

3. Kháng nguyên VNNB (Nak)
4. IgG chuột kháng vi rút VNNB gắn Peroxydaza.
5. Cơ chất hiện màu OPD.

Tiêu chuẩn nhận định dơng tính đọc bằng máy đọc ELISA ở bớc sóng 492 nm.
OD chứng dơng
2
OD chứng âm

OD mẫu thử
2
OD chứng âm
IV. Kết quả.

Bảng 1. So sánh hiệu giá các sinh phẩm sản xuất:

Sinh phẩm Viện BiKen Viện VSDT
Hiệu giá - kháng nguyên > 1/2000 > 1/2000
Hiệu giá - Cộng hợp enzym > 1/2000 > 1/2000 10
Bảng 2
. Theo dõi điều kiện và thời gian bảo quản sinh phẩm:

Thời gian bảo
quản
Sinh phẩm Hình thức
40
0

. So sánh độ nhậy của 2 thử nghiệm HI và MAC-ELISA đối với 173
mẫu máu sớm

(Lấy sau khi mắc bệnh 1 - 5 ngày, trong vụ dịch 1988)

Kết quả Số mẫu
MAC-ELISA HI
37
71
60
5
(+)
(+)
(-)
(-)
Có kháng thể
(-)
(-)
Có kháng thể
Tổng số 108/173 (62,42%) 42/173 (24,27%)

11
Bảng 4
: Kết quả ứng dụng bộ sinh phẩm MAC-ELISA trong chẩn đoán và
giám sát bệnh Dengue và VNNB

Kết quả Bảng 5
: Sự phân bố VNNB đợc xác định bằng MAC-ELISA theo lứa tuổi
(1989 - 1991)

Nhóm tuổi 0 - 4 5 - 9 10 - 14 15 - 19 > 19 Tổng số
Xác định
VNNB
174 169 38 2 18 401
43,39 42,14 9,48 0,50 4,49 100 %
85,53 9,48 4,99 100 12

Bảng 6
: Những địa phơng có bệnh nhân VNNB đã đợc xác định bằng
MAC-ELISA (1989 - 1991)

Địa phơng Chẩn đoán lâm sàng Xác định VNNB
Nội thành 20 8 Hà Nội
Ngoại thành 138 77
Hà Bắc 118 68
Hà Sơn Bình 117 64
Hải Hng 104 66
Hà Nam Định 30 19
Thái Bình 2 2

Hà Tĩnh 1 1
Lai Châu 1 0
Lạng Sơn 3 2
Tuyên Quang 2 1
Yên Bái 4 1
Sơn La 1 0
Quảng Trị 1 1
Huế 28 11
Không rõ địa chỉ 138 39
Tổng số 530 339 14
V. Nhận xét và bàn luận
1. Các sinh phẩm sản xuất đạt hiệu giá cao, tinh khiết để sử dụng cho thử
nghiệm MAC - ELISA hiệu giá kháng nguyên (kiểm tra bằng phản ứng ngng
kết hồng cầu - HA) >1/2000, hiệu giá công hợp enzym >1/2000 (Bảng 1)
2. Qua theo dõi điều kiện bảo quản sinh phẩm đã xác định thời gian bảo quản
sinh phẩm.
- ở 4
0
C trong 3 tháng
- ở - 20
0
C trong 3 năm
3. ứng dụng bộ sinh phẩm MAC-ELISA trong chẩn đoán nhanh và sớm bệnh
VNNB thấy có những u điểm nổi bật nh:
- Chẩn đoán bệnh với một mẫu huyết thanh, huyết thanh không phải xử lý,
tránh đợc dơng tính giả, chẩn đoán sớm bệnh. Trong 173 mẫu máu đơn (lấy
sau khi mắc 1 - 5 ngày) thử nghiệm MAC-ELISA. Xác định dơng tính là

- Cộng hợp enzym hiệu giá >2000 (ELISA)
2. Thời gian và điều kiện bảo quản sinh phẩm
- ở điều kiện 4
0
C bộ sinh phẩm có hạn dùng trong 3 tháng
- ở điều kiện - 20
0
C bộ sinh phẩm có hạn dùng 12 tháng.
3. Bộ sinh phẩm MAC - ELISA đợc ứng dụng trong chẩn đoán bệnh VNNB
cho kết quả nhanh, sớm chính xác.