BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
WX ĐỖ THỊ DIỆP LAN NGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN VÀ CÔNG HIỆU
VĂCXIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TỪ NÃO
CHUỘT CHỦNG BEIJING-1 DO VIỆT NAM SẢN XUẤT
Chuyên ngành: Vi sinh Vật
Mã số: 60.72. 68
LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
GS.TS. HUỲNH PHƯƠNG LIÊN
Hà Nội – 2010
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
PGS.TS. Lê Văn Phủng- Viện trưởng Viện kiểm định Quốc gia Văcxin và
Sinh phẩm Y tế, đồng thời là Trưởng Bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Hà Nội
người thầy luôn quan tâm, động viên em trong quá trình học tập tại trường và làm
việc tại Viện.
GS. TS. Huỳnh Phương Liên- Công ty văcxin và sinh phẩm số 1, người thầy
đã luôn quan tâm hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình làm
luận văn.
Phòng kiểm định chất lượng, Công ty văcxin và sinh phẩm số 1.
Khoa Kiểm định Văcxin virut, Viện Kiểm định Quốc gia Văcxin và Sinh
Phẩm Y Tế, đã tạo điều kiện cho tôi học tập và làm việc.
Xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình , tất cả bạn bè, anh chị em đã quan tâm,
giúp đỡ, chia sẻ, động viên em trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, tháng 8 năm 2010
Người viết luận văn
Đỗ Thị Diệp Lan
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………… 1
Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………….….…3
1.1. Virut VNNB…………………………………………………………………3
1.1.1. Thành phần hoá học của virut……………………………………… 3
1.1.2. Tính chất hoá lý……………………………………………… …… 4
1.1.3. Cấu trúc hạt virut……………………………………………… ….…4
1.1.4. Hình thái học ………………………………………………… …… 4
1.1.5. Sự nhân lên của virut………………………………………………… 5
1.2. Dịch tễ học………………………………………………………………… 6
1.3. Đặc điểm lâm sàng………………………………………………… … 10
2.3.5. Đạo đức trong nghiên cứu…………………………………….…… 47
Chương III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………… …………………48
3.1. Kết quả kiểm tra thành phần hoá học của 6 loạt văcxin VNNB từ chủng
Beijing-1………………………………………………………………………… 48
3.2. Kết quả kiểm tra tính công hiệu của 6 loạt văcxin VNNB từ chủng Beijing1 57
Chương IV. BÀN LUẬN………………………………………….…………… 58
4.1.Tính an toàn của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam
sản xuất 58
4.1.1. Hàm lượng TCA-Protein 58
4.1.2. Hàm lượng Thimerosal 59
4.1.3. Hàm lượng Formaldehyd 61
4.1.4. Độ pH 62
4.1.6. Thử nghiệm an toàn chung 62
4.1.7. Thử nghiệm an toàn đặc hiệu 63
4.1.8. Thử nghiệm yếu tố gây sốt 64
4.2. Tính công hiệu của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam
sản xuất 65
Chương V: KẾT LUẬN 66
1. Tính an toàn của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất.
2. Tính công hiệu của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất.
KIẾN NGHỊ 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
BA Albumin bò ( Bovin albumin)
BHK-21 Tế bào thận chuột đất vàng (Baby hamster kidney)
CF Kết hợp bổ thể (Complement Fixation)
CPE Cytopathic effect
A
A
m
m
e
e
b
b
o
o
c
c
y
y
t
t
e
e
s
sL
L
y
y
s
s
đời [52]. Từ thập kỷ 90 của thế kỷ 20 virut VNNB đã lan đến các vùng khác
ngoài châu Á như vùng Torres của Australia [34, 44] .
Ở Việt Nam dịch xảy ra hàng năm, rải rác khắp các tỉnh thành từ đồng
bằng đến miền núi, miền Bắc có tỷ lệ mắc cao nhất. Hiện nay khi việc tiêu diệt
vectơ truyền bệnh là muỗi Culex hoặc tiêm phòng cho lợn là ổ chứa virut còn rất
khó khăn thì gây miễn dịch cho người là biện pháp duy nhất để ngăn ngừa bệnh
VNNB.Tuy nhiên với sự thay đổi của các chủng virut như VNNB genotyp 1
được phát hiện ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Việt Nam báo động cho chúng ta
cần dự phòng bệnh tích cực hơn bằng các chủng loại vắc xin VNNB có diện đáp
ứng kháng thể rộng với nhiều chủng, lưu hành ở nhiều vùng khác nhau.
Theo
nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy chủng Beijing-1 được coi là chủng đại
diện nhất, có thể bảo vệ chéo với nhiều chủng VNNB lưu hành ở nhiều địa
phương và khả năng miễn dịch cao hơn chủng Nakayama.
Sau khi chuyển giao công nghệ của Nhật Bản, Việt Nam đã sản xuất
thành công văcxin VNNB từ chủng Nakayama. Hiện nay, Công ty văcxin và
sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã sản xuất văcxin VNNB ở cả 2 chủng
Nakayama và Beijing-1 để đáp ứng nhu cầu thị trường trong và ngoài nước.
Kiểm tra chất lượng văcxin là một vấn đề hết sức quan trọng, có tính chất khẳng
định chất lượng của văcxin về tính an toàn và công hiệu của nó. Do đó chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài:
"Nghiên cứu tính an toàn và công hiệu văcxin viêm não Nhật Bản bất
hoạt từ não chuột chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất”
1
Trong phạm vi của đề tài này nhằm 2 mục tiêu:
1. Đánh giá tính an toàn của vắc xin viêm não Nhật Bản từ não chuột
chủng Beijing-1 trong ph
òng th í nghiệm do Việt Nam sản xuất.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Virut viêm não Nhật Bản
Virut VNNB là một thành viên của nhóm B các arbovirut, thuộc họ
Togaviridae, dòng Flavivirut; là một virut chứa ARN có vỏ bọc. Các hạt virut
hình cầu có đường kính trung bình 40 – 50nm [41].
Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc hạt virut VNNB (Flaviviruse)
1.1.1. Thành phần hoá học của virut
- ARN sợi đơn, có hằng số lắng là 44S, có trọng lượng phân tử 4 ×10
6
dalton. ARN chiếm 6% trọng lượng của virion và có thành phần bazơ là G:26;
A:30; C:22; U:22. ARN là vật liệu gây nhiễm và đóng vai trò của ARN thông tin
với một mũ "cap" ở đầu 5’ và không có dải poly A ở đầu 3’ [56].
3
- Protein: có 3 protein cấu trúc [49]:
+ Protein vỏ (protein E) là một glycoprotein có chức năng là
mộtkháng nguyên ngưng kết hồng cầu và có trọng lượng phân tử 53 ×10
0
C virut tồn tại lâu
[29]. Nhậy với các dung môi hoà tan mỡ, các thuốc tẩy và trypsin.
1.1.3. Cấu trúc hạt virut
- Nucleocapsit: có đường kính 25 - 30 nm và hệ số lắng 120 - 140S. Gồm
ARN và protein C.
- Vỏ bọc gồm 1 màng lipit kép gắn với protein E và protein M [41].
1.1.4. Hình thái học
Hạt virut hình cầu đường kính trung bình 45-50 nm với các chỗ lồi rất nhỏ
trên bề mặt tạo thành quầng sáng quanh hạt virut. Chỗ lồi trên bề mặt hạt virut là
các gai dài 5 - 10nm với đường kính 2nm. Những gai này chính là các
glycoprotein mang hoạt tính ngưng kết hồng cầu và hoạt tính trung hoà [48].
4
1.1.5. Sự nhân lên của virut
Virut VNNB có thể nhân lên được ở một số loại tế bào có nguồn gốc khác
nhau như: Tế bào có nguồn gốc từ người, khỉ, một số loài gậm nhấm, lợn, chim và
tế bào muỗi. Hiệu giá của virut khi nhân lên tuỳ thuộc vào từng loại tế bào chủ.
Quá trình nhân lên của virut VNNB có thể chia thành 4 giai đoạn:
* Giai đoạn 1: Virut bám dính và xâm nhập vào tế bào chủ
* Giai đoạn 2: Giai đoạn tổng hợp các thành phần của virut bên trong tế
bào. Khi xâm nhập vào tế bào virut truyền thông tin di truyền của nó từ ARN,
kích ứng sinh tổng hợp ARN-Polymeraza. ARN sợi (+) sẽ được phiên mã nhờ
ARN-polymeraza thành ARN (-) bổ sung thành sợi kép để làm khuôn sinh tổng
hợp ARN mới theo cách bán bảo tồn, ARN được tổng hợp ở quanh nhân tế bào.
Các ARN của virut và ARN thông tin được tạo thành để tổng hợp các protein
của virut.
* Giai đoạn 3: Giai đoạn lắp ráp các thành phần của virut khi axit nucleic
và protein của virut được tổng hợp, chúng tiến dần đến màng tế bào để lắp ráp
vỏ capsit và ARN để tạo thành virut mới.
trong các vụ dịch là 20 đến 70% phụ thuộc vào sự chăm sóc y tế và điều kiện
sống từng nơi.
Virut VNNB được phân lập đầu tiên vào năm 1935 ở Nhật Bản và đã
được tìm thấy ở hầu hết các nước Đông Nam Á. Genotyp I phân lập bao gồm
các nước miền bắc Thái Lan, Campuchia và Hàn Quốc. Việt Nam chỉ phân lập
được 1 chủng Genotyp I từ người vào năm 1990 còn hầu hết Genotyp I được
phát hiện ở muỗi và lợn. Genotyp II được phân lập ở các nước miền nam Thái
6
Lan, Malaysia, Indonesia và phía Bắc Australia. Genotype III bao gồm các nước
Nhật Bản, Trung Quốc, Hồng Kông, Philippines, Việt Nam [40]. Ở Việt Nam,
bệnh VNNB đã được ghi nhận từ năm 1960 và đã được chẩn đoán xác định bằng
huyết thanh học và phân lập virut từ người bệnh, súc vật, muỗi vectơ. Bệnh
VNNB lưu hành ở hầu hết các tỉnh phía Bắc trên địa bàn 107 quận, huyện, thị
xã. Các ổ dịch lưu hành phần lớn tập trung tại các vùng bán sơn địa và vùng
đồng bằng trồng lúa nước thuộc các tỉnh Hà Giang, Thái Nguyên, Bắc Kạn, Hoà
Bình, Hải Dương, Hưng Yên, Hà Nam, Ninh Bình, ngoại thành Hà Nội và Hải
Phòng. Ở miền Nam, miền Trung và Tây Nguyên có tỷ lệ mắc thấp hơn so với
các tỉnh miền Bắc [10].
Trong 5 năm từ 1989-1992 có 4.130 trường hợp viêm não cấp tính được
thông báo từ 23 tỉnh, thành phố trong đó 237 trường hợp tử vong chiếm 5,7%.
1296 trường hợp được lấy máu xét nghiệm xác định được 733 trường hợp là
bệnh VNNB chiếm 56,55%, 860 mẫu huyết thanh lợn được xét nghiệm xác định
được 370 mẫu có kháng thể VNNB chiếm 43,5%[11]. Chỉ số mật độ muỗi ở nơi
lưu hành bệnh VNNB thường tăng cao từ tháng 4 đến tháng 9. Hai năm có dịch
xảy ra lớn là 1988 và 1992, 119 số quận huyện thị đã được xác định có lưu hành
bệnh, tập trung cao ở vùng đồng bằng và vùng bán sơn địa có trồng lúa nước ở
miền Bắc Việt Nam. Bệnh xảy ra quanh năm đỉnh cao là tháng 6 thường chậm
hơn đỉnh cao của sự nhiễm virut trong quần thể lợn và chỉ số mật độ muỗi từ 1-2
tháng. Trẻ em dưới 15 tuổi là đối tượng mắc bệnh chủ yếu trong đó trẻ từ 3
8Hình 1. 4: Chu trình tuần hoàn virut VNNB trong tự nhiên
Muỗi và lợn được xác định là vật truyền và ổ chứa virut VNNB quan
trọng đã gây ra các vụ dịch viêm não. Lợn còn được xác định là động vật khuếch
đại virut. Ở những vùng cận nhiệt đới như miền Bắc Việt Nam, dịch VNNB
thường xảy ra vào mùa hè, ngược lại ở những vùng nhiệt đới như miền Nam
Việt nam, các trường hợp VNNB xảy ra rải rác quanh năm. Trong mùa dịch, tỷ
lệ nhiễm virut VNNB trong quần thể lợn rất cao chiếm 82% trong tháng 6.
Ngược lại trong các tháng khác ngoài mùa dịch tần suất nhiễm virut VNNB
trong quần thể lợn rất thấp với tỉ lệ xác định dương tính trong quần thể lợn dao
động trong khoảng 1,96-14% [9].
Khả năng tồn tại qua mùa đông của virut VNNB ở các vùng ôn đới còn
chưa được sáng tỏ. Việc truyền virut VNNB do muỗi Culex và Aedes đã được
chứng minh trong phòng thí nghiệm và bằng các nghiên cứu thực địa [47]. Các
giả thiết khác cho rằng virut sống sót trong muỗi cái Culex tritaeniorhynchus
ngủ đông, tồn tại ở ve hoặc các vectơ khác, nhiễm virut dai dẳng ở động vật có
xương sống, hoặc chu trình được bắt đầu lại bởi các loài chim di cư. Ở Nhật Bản
người ta đã tìm thấy virut VNNB và kháng thể ở dơi [43,55]. Những con dơi
được gây nhiễm thực nghiệm rồi ngủ đông sẽ nhiễm virut dai dẳng và khi trời
ấm lên sẽ có đủ virut trong máu để muỗi có thể hút máu dơi và truyền virut sang
9
cho người [41]. Virut VNNB và kháng thể cũng được tìm thấy ở loài bò sát
nhưng vai trò của chúng trong sinh thái học bệnh VNNB còn chưa rõ [39].
1.3. Đặc điểm lâm sàng
VNNB là bệnh nhiễm trùng cấp tính hệ thần kinh trung ương bởi vậy các
* Lấy mẫu bệnh phẩm để chẩn đoán phòng thí nghiệm hết sức quan trọng.
Nó quyết định tác nhân gây bệnh, nếu lấy mẫu bệnh phẩm đúng quy định thì tỷ
lệ chẩn đoán sẽ cao và ngược lại.
- Lấy mẫu bệnh phẩm để phân lập virut:
* Ổ chứa virut (máu lợn, não chim ).
* Máu lợn lấy 2-4 ml.
* Véc tơ (muỗi Culex triaeniorlynchus) 20-50 con/mẫu.
* Người: + Lấy máu bệnh nhân từ khi có triệu chứng đầu tiên đến ngày
thứ 13 thì virut vào hết hệ thần kinh.
+ Nước não tuỷ sau khi mắc 1-3 ngày 2-4 ml.
+ Não tử thi: Lấy não tử thi sau khi chết không quá 6 giờ, bệnh
nhân chết sau khi mắc bệnh dưới 2 tuần, lấy các vị trí khác nhau: đại não, tiểu
não, các nhân xám (trong trường hợp không lấy được não có thể dùng kim chọc
hút qua khe sàng).
- Lấy mẫu bệnh phẩm để chẩn đoán huyết thanh:
+ Máu lợn để xác định sự lưu hành VNNB trong quần thể lợn.
+ Máu và nước não tuỷ của bệnh nhân nghi mắc VNNB.
Thông thường thì lấy máu kép để tìm động lực kháng thể (ELISA-IgG,HI).
Máu 1: Ngày khởi bệnh.
Máu 2: 2 tuần sau khi lấy máu 1.
11
Ngày nay có những kỹ thuật chỉ cần một mẫu máu cũng có thể cho kết
quả chính xác như kỹ thuật phát hiện sớm IgM bằng ELISA có thể chẩn đoán
sau khi mắc bênh từ 3-5 ngày. Kỹ thuật RT-PCR phát hiện ARN của virut
VNNB với cặp mồi đặc hiệu cho ta kết quả chính xác
1.4.2.2. Bảo quản bệnh phẩm:
Thường các mẫu bệnh phẩm sau khi lấy được chuyển về phòng xét
nghiệm càng sớm càng tốt.
Các bệnh phẩm phải được ghi đầy đủ tên, tuổi, địa chỉ, ngày mắc bệnh,
1-2 ngày tuổi C6/36 nguyên
Chuột Chuột
liệt Tế bào bị huỷ hoại Phát hiện genom
không liệt sau 4 ngày CPE(+) hoặc CPE(-) của virut bằng phản
Sau 3 lần tiêm truyền ứng chuỗi Polymeraza
Tiêm truyền Chuyển tiếp trên tế bào phiên mã ngược
Huỷ sau Tiêm truyền CPE (+) CPE (-) Huỷ
14 ngày tiếp
theo dõi RT-PCR
Đ
ị
nh lo
ạ
i
Kháng thể đơn dòng với ELISA SANDWICH
Hình 1.5: Sơ đồ phân lập và định loại virut
13
1.4.2.3. Chẩn đoán huyết thanh
Trong chẩn đoán huyết thanh học có nhiều phương pháp- các phương
pháp cổ điển như ngăn ngưng kết hồng cầu (HI), kết hợp bổ thể (CF), phản ứng
trung hoà trên chuột Thập kỷ 80 và 90 của thế kỷ trước các kỹ thuật được sử
dụng nhiều là IF, ELISA, PRNT.
MAC-ELISA: WHO đã công nhận kỹ thuật MAC-ELISA là kỹ thuật
Độ nhạy cảm của phản ứng tương đương thử nghiệm HI và IF nhưng tính
đặc hiệu cao.
Tóm lại: Các thử nghiệm để chẩn đoán virut VNNB rất phong phú, trong
thực tế tuỳ từng mục đích, điều kiện mà ta có thể lựa chọn thử nghiệm nào cho
thích hợp.
1.5. Bệnh lý học và sinh bệnh học
Giữa các chủng virut VNNB có sự khác nhau đáng kể ở khả năng gây độc
hại thần kinh và khả năng gây bệnh thực nghiệm cho chuột. Các điểm nhân lên
và lan toả của virut trên chuột đã được Huang và Wong mô tả. Những điểm đặc
trưng cho bệnh lý học của bệnh VNNB đã được Miyake và Shiraki [50] mô tả.
Trong suốt giai đoạn cấp người ta thường thấy có xung huyết, phù và những
xuất huyết nhỏ ở não. Những tổn thương vi mô như thoái hoá tế bào thần kinh
và hoại tử, viêm thực bào thần kinh, các hạch thần kinh đệm và viêm quanh
mạch. Những biến đổi này xảy ra ở chất xám và ảnh hưởng trước tiên lên não
trung gian, não giữa và các cấu trúc não. Có thể có sự phá huỷ các tế bào Purkije
của tiểu não. Hàng loạt những biến đổi bệnh lý ở các mô ngoài thần kinh cũng
được nhận thấy gồm sự tăng sản các trung tâm điểm hệ thống hạch bạch huyết,
viêm cơ tim mô kẽ, sưng và thay đổi albumin ở các tế bào Kupffer ở gan, viêm
phổi và xuất huyết ở thận. Khi nghiên cứu các trường hợp tử vong người ta thấy
lượng virut cao nhất ở trong các tế bào thần kinh vùng đồi thị và thân não.
15
Nhiễm virut qua nhau thai ở lợn dẫn đến kết quả sẩy thai và đẻ non, thai
bị sẩy có những tổn thương ở não. Virut VNNB cũng làm giảm và vô tinh hoàn
ở lợn đực. Những thay đổi bệnh lý của tổ chức gồm viêm mào tinh hoàn, ngừng
sinh tinh dịch và viêm bao tinh hoàn. Nhiễm virut qua nhau thai ở người cũng
dẫn đến kết quả sẩy thai và phân lập được virut từ thai nhi. Tiêm phúc mạc cho
chuột chửa cũng truyền virut cho chuột bào thai và thường dẫn đến sẩy thai.
Trong bệnh VNNB có nhiều trường hợp nhiễm trùng ẩn, nhiều người bị
nhiễm virut mà không mắc bệnh. Người ta cho rằng các yếu tố sau ảnh hưởng
kháng nguyên sau khi vào cơ thể sẽ chọn lọc và gắn với các lympho bào B chín
để có những thụ thể thích hợp. Việc kháng nguyên gắn với lympho bào B là một
trong những điều kiện cơ bản cho sự phát triển một đáp ứng miễn dịch.
Các kháng thể được chia thành nhiều lớp, đó là IgM, IgG, IgA, IgD và
IgE dựa theo cấu trúc phân tử của chúng. IgG và IgM là các kháng thể phổ biến
nhất tuần hoàn trong máu, trong khi đó các phân tử IgA thường được tạo thành ở
ruột, đường hô hấp và chỉ có một lượng rất nhỏ trong máu.
Sau lần tiếp xúc đầu tiên với một kháng nguyên (do nhiễm khuẩn hoặc
tiêm chủng), cơ thể có phản ứng lần thứ nhất để hình thành kháng thể. Đó là một
đáp ứng hạn chế, cường độ yếu và ngắn hạn (hình 1.6). Kháng thể xuất hiện
trong máu hầu hết gồm IgM và IgG. Phân tử IgM được tổng hợp sớm và sau đó
mất đi, trong khi phân tử IgG tồn tại trong máu một thời gian khá dài. Trong đáp
ứng lần thứ nhất này, các tâm điểm mầm phát triển thành các nhóm lympho bào
khu trú trong tổ chức lympho (gọi là các nang lympho), trong khi đó các tế bào
plasma gia tăng ở tiếp điểm vỏ - tuỷ và trong các giây tuỷ. Trong lần tiếp xúc
sau với kháng nguyên, thì cơ thể có đáp ứng lần thứ 2 ; kháng nguyên sẽ khu trú
trong các tâm điểm mầm và trong vùng tuỷ của các hạch lympho, và các tế bào
plasma được gia tăng phát triển mạnh mẽ. Đáp ứng lần thứ 2 này mạnh hơn đáp
ứng lần thứ nhất rất nhiều, và kháng thể có thể được hình thành liên tục trong
nhiều tháng hoặc trong nhiều năm liền. Đáp ứng lần thứ 2 chủ yếu là IgG. Các
IgM cũng được hình thành, nhưng rất ít và trong thời gian rất ngắn. Người ta
17
Copyright: Tài liệu đại học ©