TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, 1/2011
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

SÀNG LỌC CHỦNG VI KHUẨN PROBIOTIC
ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CHĂN NUÔI CBHD:

PGS.TS. NGUY
Ễ
N THÚY HƯƠNG

KS. PHAN THỊ THU DUNG
SVTH:

HOÀNG NGÂN HÀ

MSSV:

60600569
iv

TÓM TẮT

Probiotic được định nghĩa là những vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe con
người và động vật. Ngày nay, probiotic không chỉ được sử dụng cho người mà con
ứng dụng trong chăn nuôi. Nhằm mục đích sàng lọc chủng vi khuẩn probiotic để
ứng dụng trong chăn nuôi, tiến hành phân lập hệ vi khuẩn trong đường ruột heo con
dưới 20 ngày tuổi, kết quả thu được 10 chủng kí hiệu L1 đến L10 từ mẫu ruột non
và 6 chủng kí hiệu K3, K4, K5, K6, K7, K9 từ mẫu ruột già. Qua quá trình sàng lọc
hoạt tính probiotic ta thu được hai chủng K6, K7 có khả năng chịu được điều kiện
cực đoan nhất. Kết quả định danh hai chủng này bằng bộ kit API50 CHL như sau
K6: Lactobacillus acidophilus và K7: Bifidobacterium bifidum.

v
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG viii
DANH MỤC HÌNH ix
DANH MỤC ĐỒ THỊ x

2.4.2 Synbiotic 24
2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 27
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 32
3.1 Vật liệu và môi trường 32
3.2 Nội dung nghiên cứu 35
3.3 Phương pháp nghiên cứu 37
3.3.1 Quy trình thu nhận mẫu và phân lập 37
3.3.2 Cấy chuyền và làm thuần chủng vi khuẩn phân lập 39
3.3.3 Quan sát đại thể và vi thể 39
3.3.4 Đặc điểm sinh lý 40
3.3.5 Thử nghiệm sinh hóa nhằm định danh các vi khuẩn phân lập 41
3.3.6 Sàng lọc chủng vi khuẩn có hoạt tính probiotic cao 42
3.3.7 Định danh vi khuẩn bằng bộ kit định danh API50 CHL 44
3.3.8 Khảo sát giống 44
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 47
4.1 Phân lập và chọn giống vi khuẩn lactic 47
4.1.1 Đặc điểm đại thể và vi thể 47
4.1.2 Đặc điểm sinh lý 53
4.1.3 Đặc điểm sinh hóa của hệ vi sinh vật phân lập 54
4.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính probiotic cao 58
vii 4.2.1 Khả năng sống trong môi trường pH thấp 58
4.2.2 Khả năng kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh 62
4.3 Kết quả định danh từ bộ kit API 50 CHL 63
4.4 Khảo sát giống 65

Bảng 4.6: Khả năng kháng Bacillus sp. của các chủng thử nghiệm 62
Bảng 4.7: Kết quả định danh bằng bộ kit API50 CHL 64
Bảng 4.8: Số liệu đường chuẩn của Lactobacillus acidophilus trên môi trường
MRS 65
Bảng 4.9: Số liệu đường chuẩn của Bifidibacterium bifidum trên môi trường MRS
66
Bảng 4.10: Độ đục thay đổi theo thời gian nuôi cấy của Lactobacillus acidophilus
68
Bảng 4.11: Độ đục thay đổi theo thời gian nuôi cấy của Bifidobacterium bifidum68 ix DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Heo con 6
Hình 2.3: Cấu tạo ruột non của heo 9
Hình 2.4: Ảnh chụp hiển vi lông ruột của heo 45 ngày tuổi 10
Hình 2.4: Vi khuẩn bám trên thành ruột 16
Hình 2.4: Sản phẩm probiotic cho heo 21
Hình 2.5: Sản phẩm probiotic cho gà, tôm, cá 23
Hình 2.6: Tác động của FOS 26
Hình 4.1: Mẫu ruột heo 47
Hình 4.1: Đặc điểm đại thể của các chủng phân lập được 51
Hình 4.2: Đặc điểm vi thể của hệ vi khuẩn phân lập từ mẫu ruột heo 53
Hình 4.3: Khả năng lên men các loại đường 57
Hình 4.4: Hoạt tính ức chế Bacillus sp. của các chủng phân lập 63

chăn nuôi là một ngành kinh tế quan trọng, vừa đáp ứng nhu cầu trong nước vừa
đáp ứng nhu cầu xuất khẩu. Hiện nay việc sử dụng kháng sinh và chất kích thích
sinh trưởng trong chăn nuôi đang rất tràn lan và thiếu kiểm soát. Dư lượng kháng
sinh và chất kích thích sinh trưởng trong gia súc làm giảm chất lượng thịt, ảnh
hưởng trực tiếp đến sức khỏe người tiêu dùng và lo ngại sử dụng quá nhiều sẽ dẫn
tới hiện tượng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh trong đường ruột.
Từ năm 2006, ở Châu Âu đã phản đối mạnh mẽ việc sử dụng kháng sinh và
chất kích thích sinh trưởng hóa học trong chăn nuôi. Từ đó, việc nhập khẩu thịt heo
của nước ta gặp phải rất nhiều khó khăn. Tuy nhiên việc cấm sử dụng các chất
kháng sinh lại dẫn tới việc gia tăng nguy cơ mắc các bệnh về đường ruột như bệnh
tiêu chảy và dẫn tới tử vong cho heo, mà trong chăn nuôi theo qui mô công nghiệp
thì việc điều khiển năng suất và phòng ngừa được dịch bệnh là rất quan trọng. Đặc
biệt, trong quá trình sinh trưởng và phát triển của heo thì thời điểm heo tách mẹ là
giai đoạn quan trọng nhất, heo con thường bị stress do một số yếu tố bất lợi như:
dinh dưỡng, môi trường, mất cân bằng hệ đường ruột. Kết quả là khả năng tiêu thụ
thức ăn thấp, giảm chức năng tiêu hoá … dẫn đến hiện tượng tiêu chảy và sinh
trưởng kém, ảnh hưởng đến toàn bộ quá trình phát triển của heo. Để thay thế chất
kích thích tăng trưởng người ta muốn tìm một chất phụ gia khác. Và chất phụ gia
trong thức ăn cho heo con cho đến nay là prebiotic, probiotic và synbiotic (là sự kết
hợp của prebiotic và probiotic). Probiotic giúp kích thích tiêu hóa, tăng khả năng
tiêu thụ thức ăn và khả năng miễn dịch của heo, phòng ngừa dịch bệnh đường ruột.
Chương 1: Mở đầu 2 Từ đó, probiotic góp phần nâng cao được hiệu quả chăn nuôi [32]. Hiện nay, các
sản phẩm probiotic được bán trên thị trường chủ yếu là nhập từ nước ngoài, chất
lượng của các sản phẩm cũng chưa được kiểm soát. Do đó, độ tin cậy của các sản

Nghề chăn nuôi heo ra đời từ rất sớm. Bắt đầu xuất hiện ở châu Âu và châu
Á cách đây khoảng một vạn năm. Kỹ thuật chăn nuôi được hoàn thiện theo thời
gian, đặc biệt là từ thế kỷ XX đến nay chăn nuôi heo đã phát triển theo hướng sản
xuất công nghiệp cho năng suất và chất lượng cao. Hiện nay heo được nuôi trên
khắp thế giới, tuy nhiên đàn heo thế giới phân bố không đều ở các châu lục. Trong
đó, châu Âu chiếm khoảng 52%, châu Á 30,4%, châu Úc 5,8%, châu Phi 3,2%,
châu Mỹ 8,6% [9]. Một số quốc gia chăn nuôi heo có công nghệ cao và có tổng đàn
heo lớn như: Nga, Anh, Pháp, Mỹ, Nhật, Canada, Hà Lan, Đan Mạch, Đức, Ý, Úc,
Trung Quốc, Singapore, Đài Loan. Nhìn chung ở các nước tiên tiến và công nghiệp
đều có chăn nuôi heo phát triển theo hình thức công nghiệp và đạt trình độ chuyên
môn hoá cao.
Theo số liệu thống kê FAO (2004). Ngành chăn nuôi heo toàn thế giới liên
tục tăng trưởng ổn định trong 15 năm qua và dự kiến sẽ tiếp tục tăng trưởng trong
thời gian tới.
Bảng 2.1: Diễn biến số lượng đàn heo thế giới
Năm 1960 1990 1995 2000 2001 2002 2003 2004
Số heo
(triệu con)
521 880 920 950 1204 1215 1278 1257
Nguồn: FAO ( 2004) [9]
Mỹ là quốc gia có sản lượng ngành chăn nuôi đứng hàng đầu trên thế giới.
Trong đó, riêng ngành chăn nuôi heo đứng thứ hai sau bò với 61,2 triệu con tính
đến tháng 12 năm 2005, tăng bình quân 1,15% năm, trong đó có 6,01 triệu con gồm
nái, nái hậu bị và heo đực giống. Số heo cai sữa trung bình 9,03 con/lứa năm 2005
Chương 2: Tổng quan tài liệu 4
khó khăn của chăn nuôi trong thời gian khủng hoảng kinh tế toàn cầu làm cho số
lượng đầu heo cả nước bị giảm nhẹ, tuy nhiên việc nâng cao chất lượng giống và kỹ
thuật chăn nuôi để đảm bảo năng suất và sản lượng thịt heo luôn có xu hướng tăng
Chương 2: Tổng quan tài liệu 5 lên. Số liệu của tổng cục thống kê năm 2007 cho thấy đàn heo nước ta tăng từ 23,2
triệu con năm 2002 lên đến 26,6 triệu con năm 2007. Sản lượng thịt heo hơi cũng
tăng nhanh từ 1,65 triệu tấn năm 2002 đến 2,71 triệu tấn năm 2007 [9].
Bảng 2.3: Diễn biến số lượng đàn heo và sản lượng thịt heo Việt Nam
Năm
Chỉ tiêu
2002 2003 2004 2005 2006 2007
Đầu heo (triệu con) 23,2 24,9 26,1 27,4 26,9 26,6
Sản lượng thịt (triệu tấn) 1,65 1,80 2,01 2,29 2,50 2,6
Nguồn: Tổng cục thống kê (2007)[9]
Thịt heo chiếm đến 76-77% trong tổng số các loại thịt sản xuất ở trong nước.
Hiện nay phần lớn heo được nuôi theo hình thức nông hộ bán thâm canh. Trong
những năm gần đây do thực hiện chính sách công nghiệp hoá trong nông nghiêp,
chuyển đổi cơ cấu vật nuôi cây trồng nên sản phẩm của ngành chăn nuôi heo đã
tăng lên đáng kể đặc biệt là về chất lượng sản phẩm.
Trong hơn 20 năm, ngành chăn nuôi phát triển khá nhanh, tốc độ tăng
trưởng bình quân qua các giai đoạn có xu hướng tăng rõ rệt, đặc biệt là tốc độ tăng
trưởng về đầu con. Heo là gia súc có xu hướng tăng khá nhanh, nhất là trong giai
đoạn sau thập kỷ 90. Trong giai đoạn 1986-1990, số đầu heo chỉ tăng 1%/năm, giai
đoạn 1991-1995 tốc độ tăng trưởng bình quân đã đạt 5,97%/năm. Giai đoạn 2000-
2003, mặc dù thị trường xuất khẩu khó khăn nhưng chăn nuôi heo vẫn tăng trưởng

2.2.1 Giới thiệu chung
Ở nhiều nước heo con thường được cai sữa vào khoảng 18-25 ngày tuổi,
nhưng ở một số nước heo được cai sữa muộn hơn. Trọng lượng trung bình của heo
con từ 25 đến 45 ngày tuổi vào khoảng 7,5 đến 13 kg [32].

Hình 2.1: Heo con [43]
Ở một số nước, heo con được cai sữa từ rất sớm, mục đích của việc cai sữa
sớm là để hạn chế các bệnh truyền nhiễm từ heo mẹ sang heo con, tăng năng suất
Chương 2: Tổng quan tài liệu 7 heo nái, giảm thời gian cho một kì sinh sản, tăng sức khỏe cho heo nái. Giai đoạn
heo cai sữa là giai đoạn vô cùng quan trọng, nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng tốc
độ tăng trưởng của heo con trong giai đoạn này ảnh hưởng sự phát triển trong giai
đoạn sau và là một trong những yếu tố tác động đến trọng lượng của heo trưởng
thành. Tốc độ tăng trưởng của heo con trong giai đoạn cai sữa đặc biệt quan trọng,
bởi trong tuần đầu tiên sau khi cai sữa nếu heo tăng trưởng 225g/ ngày thì heo thịt
sẽ nặng hơn khoảng 7,7kg [32].

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến heo con trong giai đoạn cai sữa
Khi heo con được cai sữa, chúng thường phải đối mặt với nhiều yếu tố bất
lợi gây stress như thay đổi nguồn dinh dưỡng (sự thay đổi nguồn thực phẩm từ sữa
mẹ sang thức ăn khô), môi trường (nhiệt độ), tâm lý, mất cân bằng hệ vi sinh vật
đường ruột. Dẫn đến việc heo con thường tiêu thụ lượng thức ăn thấp và phải được
theo dõi trong 1-2 tuần đầu tiên. Đặc biệt trong giai đoạn này heo con thường bị
bệnh tiêu chảy, giảm khả năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn.
2.2.2.1 Thay đổi nguồn thức ăn

các chất dinh dưỡng từ thức ăn sau khi đã tiêu hóa. Phần cuối ruột già được nối với
manh tràng rồi đến ruột kết, là nơi nhận nhiệm vụ tiêu hóa cellulose. Cuối cùng của
hệ tiêu hóa là trực tràng, là nơi chứa bã thức ăn đã hấp thụ hết chất dinh dưỡng sau
khi đi qua hệ tiêu hóa [13].

Hình 2.2: Hệ tiêu hóa của heo [13]
2.2.4 Hệ vi sinh vật đường ruột của heo trong giai đoạn cai sữa
Hệ vi sinh vật chủ yếu trong đường ruột heo là Lactobacilli, Bifidobacteria,
Streptococci, Clostridium perfringes và E.coli, chúng còn thay đổi theo độ tuổi của
heo và bắt đầu ổn định khi heo đạt từ 4 đến 6 tuần tuổi [32]. Vi khuẩn
Bifidobacteria chiếm ưu thế trong đường ruột heo là Bifidobacterium
psuedolongum. Nhiệt độ tối ưu của Bifidobacteria từ 37-43°C, pH tối ưu từ 6,5-7,1.
Chương 2: Tổng quan tài liệu 9 Đối với heo con, tổng số vi khuẩn Bifidobacteria trong dịch bao tử 10
3
-10
6
, khoảng
10
8
trong dịch ruột non và khoảng 10
8
đến 10
9
trong ruột già [32].

phần lông nhung và tăng phần chân lông, làm teo các sợi lông dẫn đến việc giảm
50-75% lượng tế bào trên đỉnh của các sợi lông. Những thay đổi này bắt đầu rõ rệt
từ ngày thứ 5 và kéo dài đến tuần thứ 2 sau khi cai sữa. Điều này giải thích nguyên
nhân dẫn đến khả năng hấp thu chất dinh dưỡng kém của heo con trong giai đoạn
cai sữa [32].
Những yếu tố ảnh hưởng đến sự thay đổi hình thái của ruột non:
 Vi khuẩn gây bệnh
Vi khuẩn sống kí sinh trong ruột non có ảnh hưởng sâu sắc đến cấu trúc và
sự tiêu hóa, hấp thụ của động vật. Đặc biệt là vi khuẩn E.coli, một loài gây bệnh và
ảnh hưởng đến chiều dài của lông ruột.
 Stress khi cai sữa
Heo con gặp thay đổi của môi trường, tách khỏi mẹ, bắt đầu sống chung
trong bầy đàn làm ảnh hưởng đến khả năng tiêu hóa, cụ thể là làm giảm chiều dài
lông ruột.
 Thích nghi dần với thực phẩm dạng rắn
Chương 2: Tổng quan tài liệu 11 Trong nhiều thập kỉ, để kích thích khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng
của heo con người ta đã sử dụng các chất kích thích tăng trưởng và đều đem lại
hiệu quả. Nhưng ngày nay ngày càng nhiều lo ngại về thực phẩm có sử dụng chất
kích thích. Từ năm 2006 ở các nước châu Âu đã cấm sử dụng chất kích thích tăng
trưởng cho gia súc nhưng kèm theo đó thì nguy cơ mắc bệnh tiêu chảy và tỉ lệ tử
vong ngày càng tăng. Để thay thế các chất kích thích tăng trưởng, người ta đã tìm
một loại phụ gia khác là prebiotic, probiotic và synbiotic (là sự kết hợp của
prebiotic và probiotic) và vẫn được sử dụng hiện nay.
Nhiều nghiên cứu cho thấy, sử dụng bổ sung probiotic, prebiotic hay

trình chức phận của cơ thể.
Hiện nay, probiotic được định nghĩa đơn giản hơn: probiotic là những vi
sinh vật sống, chủ yếu là vi khuẩn Lactobacilli và Bifidobacteria có lợi cho sức
khỏe được ăn vào qua đường miệng cùng với chất dinh dưỡng truyền thống khác
trong thức ăn. (Zayed &Roos, 2003) [4][24].
Còn theo FAO/WHO 2002 thì probitics được định nghĩa như sau: “Live
microorganisms which when administered in adequate amounts confer a health
benefit on the host” có nghĩa là một hay hỗn hợp nhiều vi khuẩn sống mà khi cung
cấp cho người hay động vật thì mang lại những hiệu quả có lợi cho vật chủ bằng
cách tăng cường các đặc tính của vi sinh vật trong hệ tiêu hóa [31][15].
2.3.2 Giới thiệu nhóm vi khuẩn được sử dụng làm probiotic
2.3.2.1 Nhóm vi khuẩn dùng làm probiotic cho người
Dòng vi khuẩn phổ biến: vi khuẩn sinh acid lactic (LAB). LAB đóng vai trò
quan trọng đối với sức khỏe, được sử dụng nhiều trọng công nghiệp.
LAB là những vi khuẩn Gram dương, thường không di động, không sinh bào
tử, các phản ứng catalase âm, oxydase âm, nitratreductase âm. Những vi khuẩn này
sinh tổng nhiều hợp chất cần cho sự sống rất yếu nên chúng là những vi sinh vật
khuyết dưỡng đối với nhiều loại acid amin, base nucleotic, nhiều loại
vitamin,…không co khả năng tổng hợp nhân heme của porphyrine, bình thường
chúng không có cytochrome. Vì vậy, chúng được xếp vào nhóm vi khuẩn kỵ khí
tùy nghi (vi hiếu khí), có khả năng lên men trong điều kiện hiếu khí cũng như
kỵ khí.
LAB có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, phụ thuộc vào nhiều yếu tố môi
trường như pH, nhiệt độ và sự tích lũy các sản phẩm chuyển hóa cuối. Chúng đòi
hỏi các vitamin như: thimine, biotin, acid pantotemic, acid nicotinic và các acid
Chương 2: Tổng quan tài liệu 13


L. rhamnosus
L. salivarius
B. adolescentis

B. alimalis
B. bifidum
B. breve
B. infantis
B. lactis
B. longum
Enterococcus faecalis

Enterococcus faecium
Lactococus lactis
Leuconostoc
mesenteroides
Pediococus acidilactici
Sporolactobacillus
inulinus
Streptococus
thermophilus
Bacillus cereus

Escherichia coli
Propionibacterium
freudenreichii
Saccharomyces
cerevisiae
Saccharomyces
boulardii

cerevisiae . Các chủng thuộc nhóm Bacillus và Lactobacillus có nhiều loại được sử
dụng làm probiotic. Trong đường tiêu hóa của động vật, Lactobacillus và
Enterococcus thường hiện diện với mật độ khoảng 10
8
và 10
5
/10
6
trên gam. Còn
Bacillus và nấm men không thường hiện diện ruột [21]. Các chủng thường được
dùng như Lactobacillus acidophilus, Enterococci faecium, Bifidobacterium
bifidum. Các chủng này phải không gây bệnh, gram dương, chịu được môi trường
acid, muối mật, chống lại E.coli, ổn định, bám dính vào màng nhầy ruột. Chúng
được cho vào thực phẩm heo như chất phụ gia, để có hiệu quả các chủng probiotic
cần phải đáp ứng điều kiện sau:
 Sống được và ổn định trong thực phẩm gia súc.
 Có khả năng sống và sinh sản sau khi đi qua dạ dày.
 Cản trở ảnh hưởng của những vi khuẩn gây bệnh hoặc tiết ra các hợp
chất chuyển hóa để ức chế vi khuẩn gây bệnh [22].

Chương 2: Tổng quan tài liệu 15 Bảng 2.5: Những chủng vi sinh vật dùng làm probiotic cho động vật [19]

Trong các chủng vi khuẩn probiotic bổ sung vào đường ruột, chủng
Enterococcus faecium là có khả năng bám dính ngay vào thành ruột, sự hiện diện

S. cerevisiae
Bacillus
Reid, G, 2000
Reid, G, 2000
Garriga, M, 1998 và Pascual, M, 1999
Morishita, T.Y. và cs, 1997
Morishita, T.Y. và cs, 1997
Casas, I.A và cs, 1998
Netherwood, T. và cs, 1999
Kumprecht, I. và cs, 1996
Kumprecht, I. và cs, 1996
Bò
Nấm men
Aspergillus oryzae
B.subtilis
L. acidophilus
E. coli
Proteus mirabilis
Bifidobacterium pseudolongum
Gambos, S. và cs, 1995
McGilliard, M.L. và cs, 1998
McGilliard, M.L. và cs, 1998
Abe, F. và cs, 1995
Zhao, T. và cs, 1998
Zhao, T. và cs, 1998
Abe, F. và cs, 1995
Chương 2: Tổng quan tài liệu 16