Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
Báo cáo
Ứng dụng enzyme papain trong thủy
phân bánh dầu đậu phộng nhằm tạo sản
phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng
trong chăn nuôi
Nhóm _08DSH2 - 1 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
MỤC LỤC
CHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦU 3
CHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 4
2.1 Giới thiệu về cây đu đủ 4
2.1.1. Giới thiệu 4
2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ 5
2.1.3.Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ 5
2.2 Giới thiệu về enzyme papain 5
2.2.1 Cysteine protease 5
2.2.2 Nguồn gốc 5
2.2.3 Tính chất của papain 5
2.2.3.1 Tính chất vật lý 6
2.2.3.2 Tính chất hóa học 7
a) Cấu tạo hóa học: 7
b) Cấu trúc không gian 8
c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain 9
d) Phản ứng của papain 11
e) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain 13
CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN 14
3.1 Phương pháp thu nhận papain 14
3.1.1 Thu nhận nhựa đu đủ 14
3.1.2 Thu nhận papain 14
3.2 Phương pháp tinh sạch papain 15

một loại men phân giải protein tồn tại trong đu đủ. Enzym papain rất tốt cho hệ tiêu hóa,
giúp tiêu hóa các thức ăn giàu protein một cách dễ dàng hơn. Nó có thể giúp phân giải và
loại bỏ những lớp da chết trên bề mặt cơ thể. Papain có tác dụng tiêu hóa protid, biến đổi
các chất có albumin thành pepton, có tác dụng trên mỡ, trên các hydrat carbon trong môi
trường hơi kiềm hay trung tính. Ở nhiệt độ thường khi cho tiếp xúc papain với lòng trắng
trứng thì lòng trắng trứng bị mất tính sánh sền sệt. Trung bình một trái đu đủ cho được
12g mủ, từ 4kg mủ đu đủ tươi cho 1kg papain khô và trồng đu đủ để khai thác lấy mủ chỉ
hiệu quả trong vòng 3 - 4 năm tuy vòng đời của một cây đu đủ khoảng 20 năm.
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học , các chế phẩm
enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như:
chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Khoảng 75% chế phẩm là enzyme
thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Với những lợi ích và giá trị
mà enzyme papain đem lại , nó được ứng dụng rộng rãi và thường được dùng trong lĩnh
vực chế biến mỹ phẩm. Ngoài ra, Papain rất cần cho nhiều lĩnh vực công nghiệp: dược
phẩm, hóa chất, kỹ nghệ tơ sợi dệt may, thuộc da, thực phẩm
Vì tầm quan trọng của enzyme papain trong nhiều lĩnh vực nên nhóm chúng tôi thực
hiện đề tài: Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng nhằm tạo sản
phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi.
CHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN
Nhóm _08DSH2 - 4 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
2.1 Giới thiệu về cây đu đủ
2.1.1 Giới thiệu
Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricac
Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô
hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái). Đu đủ thường là cây đồng chu,
nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính
và cây cái. Vài cây đu đủ cũng có thể trổ cả ba loại hoa nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra
hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba
loại hoa. Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra tỉ như khô hạn và

Vitamin A và D hơn. Khoảng 1,500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650g
papain.
2.2 Giới thiệu về enzyme papain
2.2.1 Cysteine protease
- Cysteine proteases (EC.3.4.22) là nhóm các protein có trọng lượng phân tử trong
khoảng 21-30kDa, các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại liên kết:
peptide, amide, esterthiol. Đây cũng là những enzyme có nhóm –SH trong tâm hoạt động.
- Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều enzyme
trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng rộng rãi trong
công nghiệp.
Nhóm _08DSH2 - 6 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
- Có 2 loại cysteine proteases là exopeptidase ( cathepsin X, carboxypeptidase B) và
endopeptidases ( bromelain, ficain, cathepsin…). Exopeptidase thủy phân liên kết peptide
ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó endopepetidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữa
chuỗi polypeptide.
2.2.2 Nguồn gốc
Papain (EC 3.4.22.3) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được phân lập
lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya). Đây cũng là enzyme đầu
tiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis et al., 1894). Trong
nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác như chymopapain,
caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines and Brock-lehurst, 1979).
Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng có nắng nóng và
độ ẩm ổn định quanh năm.
2.2.3 Tính chất của papain
2.2.3.1 Tính chất vật lý
Bảng 2.1: Tính chất vật lý của papain
Tính chất vật lý Giá trị
Điểm đẳng điện pI = 8.75
Hằng số sa lắng S20 2.42 ± 0.04

trong đó không có chứa methionine. Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân tử là một
mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo
thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng sinh học, chỉ
làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí 25.
b) Cấu trúc không gian
Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính bị gấp
thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này,
Nhóm _08DSH2 - 8 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên
phải khe. Phần xoắn chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử.
Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159. Khoảng pH hoạt
động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là casein thì hoạt
tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp là 50 – 57
0
C.
c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain
- Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của
histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi
liên kết hydrogen.
- Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là:
Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys.
- Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động của
papain gần giống như của ficin hay trypsin, mặc dù chúng có nguồn gốc khác nhau.
Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys.
Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser.
Nhóm _08DSH2 - 9 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
 Hoạt tính enzyme và cơ chất tác dụng:
- Papain thủy phân peotein thành các polypeptide và các polypeptide và các amino

tính papain. Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp là dùng hỗn hợp cysteine và
EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò
chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ.
 Bất hoạt:
- Papain bị kìm hãm ( ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O2, O3,
H2O2, iodur acetate, cysteine và các hợp chất disufur khác. Các chất này phản ứng với
nhóm –SH ở tring tâm hoạt động của papain làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó.
- Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp. papain tác
dụng với chloromethul cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính. Tuy nhiên
papain lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ ( độ quay cực của papain
hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6-8m).
d) Phản ứng của papain
Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amin, nó đóng vai trò vừa
như endopeptidase vừa như exopeptidase.
Nhóm _08DSH2 - 11 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
Nhóm _08DSH2 - 12 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
Nhóm _08DSH2 - 13 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain
Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô
papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100
0
C. Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt
tính sau 30 phút ở 82.5
0
C và nếu nhiệt độ tăng cao hơn (>100
0
C) thì nó sẽ bị mất hoàn

dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm giảm hoạt tính
cũng như thay đổi cấu hình của papain. Các chất gây biến tính mạnh như TCA 10%,
guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạt
tính của papain.
CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN
3.1 Phương pháp thu nhận papain
200-300m dd cysteine 0.04M
pH: 5.7
Thời gian: 1-2 giờ
400-500ml (NH4)2SO4

Nhóm _08DSH2 - 15 -
Nguyên liệu
180g nhựa đu đủ
Nghiền
Trích ly
Lọc
Chỉnh pH
Lọc
Kết tủa phân đoạn 1
Ly tâm 1
Celite(100g)
Cát sạch(150g)
Bã
Bã
110mlNaOH
1M
Tủa xám
(NH4)2SO4
Dịch lỏng

Tái kết tinh
Sấy chân không
Papain.
Dịch lỏng
60g NaCl rắn
dd NaCl bão
hòa
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
Khi nhựa tạo thành thể huyền phù thì gạn bỏ lớp nổi ở trên. Quá trình nghiền và trích
được lặp lại với 300mL dung dịch cysteine. Rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh
thể tích chiết lên 11.
Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số 1,
thời gian lọc có thể rất dài. Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5.7.
Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzyme được tiến hành trong điều kiện lạnh.
 Loại bỏ các chất không tan pH9:
Thêm từ từ và khuấy đều 1 lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M để điều chỉnh
pH của dịch chiết thu được ở trên lên pH 9. Lọc hoặc ly tâm ở 2600 vòng/phút trong 1
giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dịch trích trong.
 Quá trình phân đoạn bằng (NH4)2SO4:
Cho (NH4)2SO4 vào dịch enzyme đến 40% độ bão hòa, sau 1-2 giờ, ly tâm ở 2500
vòng/ phút. Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể giữ lại lấy chymopapain. Tủa được
rửa lại 1 lần nữa với 400-500ml dung dịch (NH4)2SO4 40% độ bão hòa.
 Quá trình phân đoạn bằng NaCl:
Hòa tan trong 600mL dung dịch cysteine 0.02M, dung dịch thu được có pH 7- 7.5 sau
đó thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau 1 giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút trong 1 giờ để thu tủa,
bỏ dich lỏng.
 Kết tinh
Hòa tan tủa với 400mL dung dịch cysteine 0.002M ở nhiệt độ phòng được 1 dung
dịch huyền phù có pH = 6.5. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành,
duy trì ở 4

là 1.1x100 cm. cột được cân bằng trước dung dịch đệm gồm sodium phosphate 0.1M và
dung dịch EDTA ( ethylenediamine-tetraacetic aicd) pH=7.
Nhóm _08DSH2 - 18 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
CHƯƠNG IV: ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN
BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG
4.1 Ứng dụng của enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng
4.1.1 Sơ đồ thực hiện phản ứng thủy phân
Nhóm _08DSH2 - 19 -
Bánh dầu đậu
phộng xay nhuyễn
Enzyme papain
(khô)
dd đệm phosphate 0.1M
Thủy giải
Lọc hoặc ly tâm
Bã sau lọc
Dịch lọc
t: 150
0
C
pH : 8-8.5
thời gian: 2 giờ
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương

Sơ đồ thủy phân.
a/ Nguyên lý chung:
Quá trình chuyển từ protein bánh đậu phộng thành acid amin là một quá trình
khá phức tạp. Dưới điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân, enzyme sẽ tham gia
phản ứng theo sơ đồ sau:

chất lượng cao và bảo quản dễ dàng hơn người ta thường cô đặc sản phẩm tao ra sản
phẩm khô ở đây ta kết thúc quá trình thủy phân của enzyme papain.
Mục đích người ta dùng enzyme papain dể thủy phân bánh dầu đậu phộng là nhằm
cung cấp them các acid amin có trong enzyme vào trong bánh dầu, để bổ sung vào thức
ăn cho gia súc và cho người.
4.1.2 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân:
- Những nghiên cứu về sự liên kết enzyme và cơ chất đề ra giả thuyết: phần lớn các
enzyme trở nên hấp thụ với bề mặt ngoài của protein đậu phộng theo một tiến trình tương
đối nhanh, sau đó sự khuếch tán những phân tử enzyme vào trong những thành phần này
xảy ra chậm hơn. Sự thủy phân những nối peptid của protein đậu phộng có thể chia làm
hai pha:
+ Pha nhanh (pha động): xảy ra ở giai đoạn đầu. Trong suốt pha này, một số lớp
peptid bị phá hủy trong một đơn vị thời gian và một phần chất hòa tan được phóng thích
vào trong dung dịch.
+ Pha chậm (pha tĩnh): tốc độ thủy phân càng về sau càng giảm, tiến trình hầu
như ít có sự thay đổi cho đến khi phản ứng thủy phân kết thúc.
4.1.3 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân
- Tính chất quan trọng nhất của sản phẩm là tính dinh dưỡng. Chiều dài chuỗi peptid
của sản phẩm thủy phân có tầm quan trọng đặc biệt. Khả năng hòa tan, khả năng nhũ
tương, vị đắng …đều phụ thuộc ít nhiều vào kích thước và trọng lượng phân tử của các
loại proteint có trong sản phẩm. Tất cả các sản phẩm thủy phân đều có vị đắng ở những
mức độ khác nhau làm hạn chế rất nhiều tính cảm quan của sản phẩm. Vị đắng là nhược
điểm chung của các sản phẩm thủy phân với xúc tác enzyme và được cho là có liên quan
đến những peptid có trọng lượng phân tử thấp (khoảng 6,000 Da). Ta không thể khử được
vị đắng nhưng có thể giảm bớt được bằng cách kiểm soát mức độ thủy phân để cho
những peptid có phân tử lượng lớn chiếm ưu thế.
Nhóm _08DSH2 - 21 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
- Việc sử dụng enzyme làm xúc tác có nhược điểm là thủy phân không triệt để, sau
thủy phân còn khoảng 20% nitơ tổng số vẫn không tan, do đó người ta thường phối hợp

phản ứng enzyme.
- Có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau:
1. Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành
trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định.
2. Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất
hay sản phẩm với một nồng độ enzyme nhất định.
3. Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự
biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
- Đơn vị đo hoạt độ của enzyme:
Hội nghị quốc tế về hóa sinh enzyme đã đưa ra khái niệm đơn vị enzyme quốc tế (hoặc
đơn vị enzyme tiêu chuẩn) vào năm 1961. Đơn vị hoạt độ enzyme (U) là lượng enzyme
có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 micromole (1mmol) cơ chất sau một phút ở điều
kiện tiêu chuẩn.
1 U = 1mmol cơ chất (10-6 mol)/ phút.
Từ năm 1972 người ta lại đưa thêm khái niệm Katal (Kat):
- Katal (Kat) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ chất sau
một giây ở điều kiện tiêu chuẩn
1 Kat = 6.107 U Và 1 U 60= 1 microkatal.
Đối với chế phẩm enzyme, ngoài việc xác định mức độ hoạt động cần phải đánh giá độ
sạch của nó. Đại lượng đặc trưng cho độ sạch của chế phẩm enzyme là hoạt độ riêng.
- Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị enzyme/ 1mg protein (U/mg)
cũng có thể 1g chế phẩm hoặc 1 ml dung dịch enzyme.
- Thông thường hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Lowry. Khi đã
biết khối lượng phân tử của enzyme thì có thể tính hoạt độ phân tử.
- Hoạt độ phân tử là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử enzyme
trong một đơn vị thời gian.
c.2. Phương pháp xác định hoạt tính của papain:
Nhóm _08DSH2 - 23 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
Để xác định hoạt tính của protease nhóm chúng em đã sử dụng phương pháp

Nhóm _08DSH2 - 24 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
- Dung dịch KH
2
PO
4
1/15M : hòa tan 0,9072 g KH
2
PO
4
trong nước vừa đủ 100
ml
- Dung dịch đệm Sorensen pH 7,6: trộn chung 88,5 ml dung dịch Na
2
HPO
4
1/15M với 11,5 ml dung dịch KH
2
PO
4
1/15M đến khi pH đạt 7,6.
- Dung dịch casein 1%: pha 1g Casein trong 100 ml dung dịch đệm Sorensen
- Dung dịch TCA 5%: hòa tan 5 g TCA trong nước cho đủ 100 ml
- Dung dich NaOH 0,5N: hòa tan 10 g NaOH trong nước cho đủ 500 ml.
- Thuốc thử Folin ( pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:4).
- Dung dich HCl 0,2N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250 ml
- Dung dịch Tyrosine 20 µM/l : khuấy nghiền 1,8119 g Tyrosin trong dung dịch
HCl 0,2N vừa đủ 500 ml
- Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 µM/l trong dung dịch HCl 0,2N: pha loãng 5 ml
dung dịch Tyrosine 20 µM/l trong dung dịch HCl 0,2N thành 100 ml