Bộ khoa học và công nghệ

Báo cáo tổng kết
Nhiệm vụ Hợp tác quốc tế theo nghị định th

việt nam-hàn quốc
(2003-2006)


nghiên cứu hoá học theo định hớng hoạt tính
sinh học các cây thuốc dân tộc việt nam nhằm
tạo ra những sản phẩm có giá trị cao phục vụ
cuộc sống
Cơ quan chủ trì: Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS Hoàng Thanh HơngGS. TS Châu Văn Minh
mãn tính
5
I.1.2. Yếu tố nhân NF-

B
5
I.2. Các xu hớng mới trong nghiên cứu điều trị các bệnh viêm và ung
th
8
I.2.1. Vai trò của NF-

B trong các bệnh viêm
8
I.2.2.
ả
nh hởng của các glucococticoit tới NF-

B
9
I.2.3. Những vấn đề liên quan đến điều trị bệnh
10
I.2.4. Sử dụng các chất ức chế NF-B trong các liệu pháp chữa bệnh
11
Chơng II: mục tiêu, Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
13
II.1. Mục tiêu, đối tợng nghiên cứu của đề tài
13
II.1.1. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
13
II.1.2. Đối tợng nghiên cứu

34
Chuơng IV. kết quả sàng lọc và đánh giá hoạt tính NF-

B
38
IV.1. Quy trình đánh giá hoạt tính kháng NF-

B
38
IV.2.Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng NF-B
41

ii

Chơng V: Kết quả nghiên cứu hoá học theo định hớng
hoạt tính sinh học
48
V.1 Nghiên cứu hoá học theo định hớng hoạt tính sinh học của cây ngũ gia
bì hơng (Acanthopanax trifoliatus (L).Merr)
48
V.2. Nghiên cứu hoá học theo định hớng hoạt tính sinh học của cây trạch
tả (Alisma plantago-aquatica)
144
V.3. Nghiên cứu hoá học theo định hớng hoạt tính sinh học của cây muối
hoa trắng (Rhus chinensis)
184
V.4. Nghiên cứu hoá học theo định hớng hoạt tính sinh học của cây móc
diều (Caesalpinia decapetala)
207
V.5. Nghiên cứu hoá học theo định hớng hoạt tính sinh học của cây cùm

Their Utilization for the Development of High-value Biotech Product

2. Thời gian thực hiện:
01/2003 12/.2006
3. Cơ quan thực hiện:

Phía Việt Nam:
Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên
Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Điện thoại: 84-4-8363375; Fax: 84-4-7564390;Email:

Phía Hàn Quốc:
Korea Research Institute for Bioscience and Biotechnology (Kribb),
Taejon, Korea.
College of Pharmacy, Chungnam National University (CNU), Taejon,
Korea.

4. Cơ quan chủ quản: Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
18-Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
5. Chủ nhiệm Đề tài:Phía Việt Nam:

PGS.TS Hoàng Thanh Hơng
GS. TS. Châu Văn Minh
Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Tel: 84.4.8363375; Fax: 84.4.7564390; Email:
Phía Hàn Quốc:

7 Nguyễn H. Toàn Phan NCS Viện sinh học Nhiệt đới
8 Lê Thị Phơng Quỳnh TS Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên
9 Lu Văn Chính TS Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên
10 Lê Minh Hà TS Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên
11 Nguyễn Hải Đăng Th.S Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên
12 Nguyễn Hoài Nam NCS Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên
13 Nguyễn Tiến Đạt NCS Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên
14 Nguyễn Xuân Cờng Th.S Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên
15 Nguyễn Phơng Thảo CN Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên
16 Hoàng Lê Tuấn Anh NCS Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên
17 Nguyễn Hữu Tùng KS Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên
18 Trần Hồng Quang CN Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên
19 Hà Việt Bảo NCS Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên
20 Nguyễn Thị Hồng Vân NCS Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên
21 Phạm Hải Yến Th.S Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên
22 Nguyễn Xuân Nhiệm Th.S Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên3
Mở đầu

Yếu tố nhân kappa B (Nuclear Factor kappa B, viết tắt là NF-

B) lần đầu
tiên đợc tìm ra vào năm 1986 bởi các nhà khoa học Mỹ Sen và Baltimore phát
hiện ra đầu năm 1986 và đợc nhận dạng là một chất điều tiết sự biểu hiện của
gen chuỗi nhẹ kappa trong các lympho bào B ở chuột. Những nghiên cứu tiếp
theo đã chỉ ra rằng NF-

B còn có mặt ở nhiều tế bào khác nhau trong cơ thể.

2. Cây Trạch tả (Alisma plantago-aquatica) thuộc họ Trạch tả
(Alismataceae)
3. Cây Móc diều (
Caesalpinia decapetala
) thuộc họ Đậu (Fabaceae).
4. Cây Muối hoa trắng (
Rhus chinensis
) thuộc họ Đào lộn hột
(Anacardiaceae).

5. Cây cùm cụm răng ((
Ehretia dentanta
) thuộc họ Dây gối (Celastraceae)
6. Cây Cỏ lào (
Chromolaena odorata
) thuộc họ Cúc (Asteraceae)
7. Cây Bùm bụp (
Mallotus apelta
) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)
8. Cây Sau sau (Liquidambar formosana Hance) thuộc họ Sau sau
(Altingiaceae)
Đây là những đối tợng thực vật đã đợc lựa chọn thông qua chơng trình
sàng lọc theo định hớng hoạt tính kháng NF-B trong khuôn khổ đề tài hợp tác
quốc tế theo Nghị định th Việt Nam-Hàn Quốc (2003-2006).

4
Phần I: tổng quan, đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
Chơng 1. yếu tố sao chép nhân nf-B và các xu hớng mới
trong nghiên cứu điều trị các bệnh viêm và ung th
I.1. Yếu tố sao chép nhân NF-kB

nh quá trình tăng sinh. Các yếu tố phiên mã khác có ở khắp nơi và hoạt tính của
chúng có thể bị làm thay đổi bởi các tín hiệu môi trờng. Chính các yếu tố phiên
mã vừa nói này có thể có vai trò then chốt trong các đáp ứng miễn dịch và viêm.
Một yếu tố phiên mã có ở khắp nơi có tầm quan trọng đặc biệt trong các đáp ứng
miễn dịch và viêm là yếu tố nhân-B (NF-B) [3].
I.1.2. Yếu tố nhân NF-

B
NF-

B lần đầu tiên đã đợc nhận dạng là một chất điều tiết sự biểu hiện của
gen chuỗi nhẹ kappa trong các lympho bào B ở chuột [4], song sau đó đã đợc
tìm thấy ở nhiều tế bào khác nhau. Nhiều protein NF-B khác nhau đã đợc xác
định đặc tính. Dạng đợc hoạt hoá của NF-B là một dị đime, thờng gồm 2

5
protein: một tiểu đơn vị p65 (cũng dợc gọi là relA) và một tiểu đơn vị p50. Các
tiểu đơn vị khác nh rel, relB, v-rel và p50 cũng có thể là thành phần của NF-B
đợc hoạt hoá và có lẽ là các dạng khác nhau của NF-

B có thể hoạt hoá các tập
hợp khác nhau của các gen đích. Trong các tế bào không đợc kích thích, NF-

B
đợc tìm thấy trong bào tơng(tế bào chất) và nó bị liên kết với IB và IB mà
các phần tử này ngăn cản NF-B đi vào nhân tế bào. Khi các tế bào đó bị kích
thích, thì các kinaza đặc hiệu photphoryl hoá I

B làm cho nó bị giảm phân nhanh
chóng bởi các proteasom [5]

lan rộng. Trái lại, sự tổng hợp I

B

không bị kích thích để diễn ra bởi NF-

B,
cho nên NF-B hình nh là đợc hoạt hoá (đợc liên kết với ADN) trong một
khoảng thời gian dài hơn ở các kiểu tế bào có IB chiếm chủ yếu [6].

Hình I.1.2a: Sự hoạt hoá NF-

B
Sự hoạt hoá NF-

B bao gồm sự photphoryl hoá và giảm phân phân giải protein tiếp sau của
protein ức chế I

B bởi các I

B kinaza đặc hiệu. NF-

B tự do (một dị đime gồm P50 và p65) sau đó
chuyển vào nhân tế bào, tại đây nó liên kết với các vị trí

B ở các vùng khởi đầu sự phiên mã của các gen
qui định các protein viêm nh các cytokin, các enzym và các phân tử dính kết. P là protein, mARN là
ARN thông tin.
- Ozon
Các virus
- Virus trong niêm mạc mũi
- Virus cúm
- Virus Esptein- Bar
- Cytomegalovirus (virus cự bào)
- Adenovirus
Các kích thích miễn dịch
- Phytohemaglutinin
- Các kháng thể kháng CD-3( nhờ sự
hoạt hoá lympho bào T)
- Kháng nguyên
Các kích thích khác
- Lipopolysaccarit
Bức xạ tử ngoại

NF-B điều tiết sự biểu hiện của nhiều gen tham gia vào các đáp ứng miễn
dịch và viêm. Song đó không phải là yếu tố phiên mã duy nhất tham gia vào sự
điều tiết các gen này và nó thờng hoạt động kết hợp với các yếu tố phiên mã
khác nh protein hoạt hoá 1 (AP-1) và yếu tố nhân của interleukin-6, mà các yếu
tố này cũng tham gia vào sự điều tiết các gen của quá trình viêm và các gen tham
gia vào miễn dịch.
NF-

B tác động lên các gen qui định các cytokin, các chemokin có lợi cho
quá trình viêm (các cytokin hoá ứng động thu hút các tế bào viêm vào các vị trí
viêm), lên các gen qui định các enzym gây sản sinh các chất trung gian của quá
trình viêm, lên các gen qui định các thụ thể miễn dịch, cũng nh các phần tử dính
kết có vai trò mấu chốt trong sự tập hợp ban đầu các bạch cầu đến các vị trí viêm
(Bảng I.1.2b).

Gro-

, -

và -


Eotaxin
bào tơng
Các phân tử dính kết
Phân tử dính kết gian bào 1
Phân tử dính kết tế bào-mạch máu 2
E-selectin
Các thụ thể
- Thụ thể interleukin-2 (chuỗi

)
- Thụ thể tế bào T (chuỗi

)
Do vậy sự hoạt hoá NF-B dẫn tới sự tăng một cách phối hợp sự biểu hiện
của nhiều gen mà sản phẩm của các gen đó làm trung gian cho các đáp ứng viêm
và miễn dịch. Ví dụ, sự kích thích một cách phối hợp sự biểu hiện của các gen qui
định E-selectin, interleukin-8 và yếu tố hoại tử u

(TNF-

), dẫn tới sự tập hợp và
hoạt hoá các bạch cầu trung tính.
Các sản phẩm của các gen đợc điều tiết bởi NF-B cũng gây hoạt hoá NF-

B. mARN chỉ ARN thông tin.

8
I. 2. Các xu hớng mới trong nghiên cứu điều trị các bệnh viêm và ung
th
I. 2.1. Vai trò của NF-

B trong các bệnh viêm
NF-

B làm tăng sự biểu hiện của các gen qui định nhiều cytokin, các
enzym và các phân tử dính kết trong các bệnh viêm mãn tính. Một gen nh vậy là
gen qui định nitơ monooxyt (NO) synthaza có thể bị cảm ứng sinh ra [9], mà sự
biểu hiện của nó đợc tăng lên ở các tế bào biểu mô đờng hô hấp và bởi các đại
thực bào ở các bệnh nhân hen, ở các tế bào biểu mô đại tràng của các bệnh nhân
bị viêm loét đại tràng và ở các tế bào màng hoạt dịch của các khớp bị viêm. Sự
biểu hiện tăng lên này đợc phản ánh bằng sự tăng lợng nitơ monooxyt trong hơi
thở ra của các bệnh nhân hen [10] và ở đại tràng của các bệnh nhân bị viêm loét
đại tràng hoạt động

[11], cũng nh bởi nồng độ nitrit (NO
2-
) tăng trong nớc tiểu
của bệnh nhân bị viêm khớp dạng thấp. Xyclooxygenaza-2 -một enzym khác có
thể bị cảm ứng sinh ra đợc điều tiết bởi NF-B - là enzym gây ra sự sản xuất
tăng prostaglađin và thromboxan trong các bệnh viêm

[12].
Trong tất cả các bệnh viêm mãn tính, các phân tử dính kết tập hợp các tế
bào viêm nh các bạch cầu trung tính, bạch cầu a eosin và các lympho bào T từ

B. Stress oxy hóa cũng có thể làm sự
viêm nặng thêm. Ví dụ, ở các động vật, sự hít ozôn gây ra sự viêm đờng hô hấp
dới và kích thích các gen viêm bị kiểm soát bởi NF-B.
Có tơng đối ít phơng pháp đo trực tiếp sự hoạt hoá NF-

B ở các tế bào
viêm hoặc ở các mô bị viêm. Việc cho các bạch cầu đơn nhân to trong máu ngoại
biên, các tế bào biểu mô hoặc mô phổi của ngời tiếp xúc với các cytokin có lợi
cho quá trình viêm, nh interleukin-1 và TNF-
hoặc với các chất oxy hoá, dẫn
tới hoạt hoá rõ ràng NF-

B. Tơng tự, ở động vật, sự hoạt hoá các lympho bào T

9
bằng các kháng thể kháng CD-3 dẫn tới sự hoạt hoá rõ ràng NF-B

[13]. NF-B

cũng có thể đợc hoạt hoá ở các đại thực bào trong đờm, ở các tế bào biểu mô và
các đại thực bào trong bệnh phẩm sinh thiết phế quản từ các bệnh nhân hen cũng
nh trong các tế bào màng hoạt dịch và các tế bào nội mô ở khớp của các bệnh
nhân viêm khớp dạng thấp [14].
Mặc dù có nhiều điểm tơng tự trong các đáp ứng viêm ở các bệnh nhân
viêm khớp, hen, viêm ruột và các bệnh viêm khác, song vẫn có những khác nhau
quan trọng ở kiểu tế bào viêm có liên quan và các chất trung gian của quá trình
viêm. Các khác nhau này có thể liên quan với sự chế tiết các cytokin đặc hiệu,
nh interleukin-5, mà yếu tố này ở bệnh nhân hen thì thúc đẩy viêm kiểu bạch
cầu a eosin. NF-B nên đợc xem là một cơ chế làm tăng và kéo dài trạng thái
viêm, mà có thể làm trầm trọng thêm quá trình viêm đặc hiệu cho bệnh, thông


B đã đợc hoạt hoá và ngăn cản NF-

B liên kết với các vị trí

B trên các gen
có vai trò trong quá trình viêm (Hình I.2.2a). Tơng tác này có thể xảy ra trong
bào tơng hoặc nhân tế bào.
Các glucococticoit cũng làm tăng sự phiên mã của gen đối với IB, bởi
vậy làm tăng sự tạo thành protein này; protein này liên kết với NF-B đã đợc
hoạt hoá trong nhân tế bào. Protein I

B

có lẽ kích thích gây sự phân ly của NF-

B từ các vị trí

B trên các gen đích và làm cho NF-

B chuyển dịch tới bào tơng

(Hình I.2.2a). Cơ chế này đã đợc quan sát thấy ở các tế bào T và các bạch cầu
đơn nhân to nhng nó cũng có thể xẩy ra ở tất cả các kiểu tế bào. Các

10
glucococticoit là các chất ức chế mạnh sự hoạt hoá NF-B, điều này có thể lý giải
đa số các tác dụng chống viêm [17].

Hình I.2.2a: Sơ đồ tác dụng của các glucococticoit lên sự hoạt hoá NF-


B là một đích hiển nhiên
cho các kiểu điều trị chống viêm mới. Các glucococticoit là các chất ức chế hữu
hiệu NF-B, nhng chúng cũng có tác dụng phụ tới nội tiết và chuyển hoá khi
đợc sử dụng theo kiểu điều trị toàn thân. Các tác dụng phụ này không thể xảy ra
đối với chất ức chế NF-

B đặc hiệu hơn. Các chất chống oxy hoá ức chế sự hoạt
hoá của NF-B là các hợp chất còn cha đợc nghiên cứu rộng rãi. Bởi vì các
chất chống oxy hoá sẵn có hiện nay nh các vitamin C, E và axetylxystein là
tơng đối yếu, nên cần có các chất chống oxy hoá mạnh hơn, có tác dụng lâu bền
hơn. Aspirin và natri salixilat cũng ức chế sự hoạt hoá của NF-

B, mặc dù chỉ ở
nồng độ tơng đối cao, và các muối của vàng cũng ức chế đợc sự liên kết NF-B
vào ADN [18], điều này cho thấy rằng tác dụng chống viêm của các loại thuốc
này, ít nhất, một phần có thể qui cho sự ức chế NF-

B.

11
Một số chất ức chế NF-B có trong tự nhiên đã đợc tìm ra nh gliotoxyn
lấy từ
Asper gillus
là một chất ức chế mạnh tơng đối đặc hiệu. Cytokin chống
viêm interleukin-10 cũng ức chế tác dụng của NF-

B thông qua tác dụng lên
I


(AdAMP)
Lasek et al, 2002
2-(4-Amino-3-methylphenyl)-5-fluoro-
benzothiazole
Brantley et al, 2005
1-b-D-Arabinofuranosyl-cytosine (ara-C)) Strum et al, 1994
Anthralin Schmidt et al, 1996
Azidothymidine (AZT) Kurata, 1994
Baicalein Chou et al, 2003
Bleomycin Ishii & Takada, 2002
Bryostatin-1 Do et al, 2004
Bucillamine metabolite SA 981 Distler et al, 2004
Camptothecin Piret & Piette, 1996
Celecoxib Kim et al, 2004
Ciprofibrate Li et al, 1996
Cisplatin Nie et al, 1998
Cycloprodigiosin Teshima et al, 2004
Dacarbazine Lev et al, 2003
Daio-Orengedeokuto Cho et al, 2004

12
Daunomycin Das & White, 1997; Hellin et al, 1998
Daunorubicin Wang et al, 1996
Diazoxide Eliseev et al, 2004
Diclofenac Cho et al, 2005
5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid Ching et al, 1999
Doxorubicin Das & White, 1997
Epinephrine Lymperopouos et al, 2006
Etoposide Bessho et al, 1994
Flavone-8-acetic acid Ching et al, 1999

truyền của Việt Nam. Trên cơ sở các kết quả về sàng lọc hoạt tính ức chế NF-B
lựa chọn một số đối tợng thực vật để tập trung nghiên cứu hoá học và hoạt tính
sinh học.
- Tách chiết và xác định cấu trúc các chất có hoạt tính từ một số đối tợng
thực vật đã đợc lựa chọn thông qua sàng lọc hoạt tính, nhằm định hớng sử dụng
có hiệu quả nguồn tài nguyên thiên nhiên của Việt nam.
- Đào tạo các cán bộ nghiên cứu (Tiến sĩ, thực tập sinh) nhằm tăng cờng
năng lực nghiên cứu của Viện
.
II.1.2. Đối tợng nghiên cứu của đề tài
Trong thời gian thực hiện dự án (2003-2006) đề tài đã tiến hành thu hái
các mẫu thực vật thành nhiều đợt để tiện cho việc giám định tên khoa học và định
loài. Để xây dựng cơ sở dữ liệu thực vật chúng tôi đã thu thập các thông tin khoa
học của các mẫu thực vật và các thông tin kèm theo bao gồm:
Vị trí lấy mẫu, thời
gian, mô tả mẫu, ảnh chụp mẫu, tiêu bản mẫu
để sử dụng trong việc tạo tiêu bản
mẫu và xây dựng file lu trữ thông tin về từng mẫu thực vật. Làm tiêu bản mẫu và
lu trữ tiêu bản mẫu đợc lu trữ tại Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên.
Hình ảnh và các thông tin chi tiết kèm theo của các mẫu thực vật đợc trình bày
trong cơ sở dữ liệu xây dựng riêng cho đề tài.
Qua nghiên cứu các tài liệu trong và ngoài nớc, đồng thời kết hợp với
kinh nghiệm y học cổ truyền trong nớc. Đề tài đã chọn lựa đợc hơn 512 mẫu
thực vật ở khắp mọi miền Việt Nam và tiến hành thu hái theo các đợt khác nhau.
II.2. Các phơng pháp nghiên cứu.
I.2.1. Phơng pháp thu thập mẫu, giám định tên phân loại
Đề tài đã tiến hành 5 đợt thu lấy mẫu tại các địa điểm phân bố thực vật ở
các tỉnh phía Bắc Việt Nam và một số mẫu thực vật ở các dải miền Trung và Nam
Việt Nam. Số mẫu thu đợc tập trung ở 147 họ (512 loài thực vật), các địa điểm
thu mẫu đã đợc ghi lại trên bản đồ theo công nghệ GIS.

sinh học của phía Hàn quốc chúng tôi đã xây dựng quy trình chiết các mẫu thực
vật phục vụ cho đề tài nh sau:
Bớc 1
:
Chuẩn bị mẫu: Các mẫu thực vật đợc sấy khô hoặc phơi khô.
Bớc 2:
Cân lợng mẫu thu đợc và xay mẫu (Tuỳ theo loại mẫu thực vật:
lá, thân hoặc rễ sử dụng các thiết bị xay và nghiền mẫu khác nhau).
Bớc 3:
Mẫu thực vật đợc tiến hành chiết 3 lần bằng MeOH trên thiết bị
chiết siêu âm (Ultrasonic 2010, 950W) ở nhiệt độ 40-50
o
C, thời gian chiết mỗi
lần tối thiểu 60 phút.
Bớc 4:
Dịch chiết của 3 lần chiết đợc lọc qua giấy lọc (Whatman,
d=240nm, No 1) gộp lại và tiến hành cất loại dung môi dới áp suất giảm ở nhiệt
độ dới 50
o
C thu đợc dịch cô MeOH.
Cách đánh số ký hiệu mẫu thô: Ký hiệu mẫu thô = Ký hiệu mẫu+ ký hiệu
dung môi. Trong đó: Dung môi MeOH (Ký hiệu 00); Dung môi n-Hexan (01);
Dung môi Clorofom (Ký hiệu 02); Dung môi Butanol (Ký hiệu 03)
Ví dụ
:
Mẫu cây Ngũ gia bì hơng (
Acanthopanax trifoliatus
(L).Merr) thu tại
Lạng sơn, mẫu số 62 trong đợt lấy mẫu. Đợc ký hiệu là VNH-62.00.
Bớc5:

Trong những năm gần đây, ngời ta đặc biệt chú ý đến MAO bởi hai lý do:
+ Một là, ngời ta đã phát hiện ra độc tố thần kinh 1-methyl-4-phenyl
1,2,3,6-tetrahydro-pyridine (MDTP) là nguyên nhân gây ra cái chết của các nơ
ron thần kinh gây tiết Dopamin và làm giảm hội chứng Parkinson ở ngời.
+ Hai là, các chất ức chế MAO không gây ra tác động phụ nh tăng huyết
áp, rối loạn nhịp tim nh các điều trị thần kinh khác.
Vài năm trở lại đây, các nhà khoa học trên thế giới đã quan tâm rất nhiều
đến các chất ức chế MAO có nguồn gốc thiên nhiên biển do khả năng chữa trị
bệnh trầm cảm, cũng nh độc tố thấp của chúng.

Nguyên liệu
Các hợp chất sạch phân lập đợc từ các thực vật trong khuôn khổ đề tài
- Chuột nhắt trắng (Male, ICR, 25-30 g/con)

- Dung dịch đờng
- Dung dịch đệm KH
2
PO
4
(pH = 7.4 )
- Dung dịch đệm NaH
2
PO
4
(pH = 7.4)
- Dung dịch ZnSO
4
10%
- Dung dịch KOH 1N
- Dung môi dimethylsulfoside Bớc 2
: Thử hoạt tính kháng MAO in vitro
Hoạt tính kháng MAO
in vitro
đợc tiến hành theo phơng pháp Kraml và
Naoi có cải biên lựa chọn phản ứng và mô hình chuyển hoá Kynuramine thành 4-
hydroxy quinoline (ôxy hoá đề amine kynuramine thành 4-hydroxy quinoline có
phát huỳnh quang).
Các mẫu cần thử nghiệm ở đây là các mẫu thực vật và các hợp chất sạch đã
đợc phân lập, đợc pha trong dung môi dimethylsulfoside (DMSO) theo tỷ lệ
nồng độ 250
à
g/ml. Nồng độ của 4-hydroxy quinoline đợc xác định bằng mật
độ quang và đợc đo trên máy HITACHI-F 3000 ở các bớc sóng 380 nm (phát
xạ) và 315 nm (kích thích). Hỗn hợp phản ứng gồm 75àl dung dịch đệm photphat
0.2 M (pH=7.4) 5
à
l enzyme, 2
à
g dung dịch chất ức chế(các mẫu thử) và 20
à
l
dung dịch kynuramine (cơ chất). Lắc nhẹ hỗn hợp phản ứng và tiến hành phản
ứng trong 30 phút ở nhiệt độ 37
0
C. Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 25 àl dung

Đón
g
viên 1,5
g
Enz
y
me
Ly tâm 16000 vòng/phút trong 20 phút, 40
0
C
Tạo huyền phù trong 11.5 ml dung dịch đệm
10 mM NaH
2
PO
4
(pH=7.4)

17

- Cờng độ huỳnh quang mẫu trắng (không có mẫu thử,
không có enzyme).
II.2.3.3. Phơng pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxic activity
assay).

Nguyên liệu:
- Dòng tế bào
Dòng KB (
Human epidemoid carcinoma
- ung th biểu mô) từ phòng thí
nghiệm Bioassay trờng Đại học Dợc Illinois- USA.
Dòng Fl (Fibril sarcoma of Uteus - Ung th màng tử cung).
Dòng RD (
Rhabdosarcoma
-Ung th màng tim ) từ Viện VSDT Trung
ơng.
-
Môi trờng nuôi cấy tế bào
: DMEM (Dulbeccos Modified Eagle
Medium) hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagles salt). Có bổ
sung L-glutamine, Sodium piruvat, NaHCO
3
, PSF (Penixillin-Streptomycin
sulfate-Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf
Serum).
Thêm 140
à
l d
2


l ZnSO
4
10% và 5
à
l d
2
1N NaOH
Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút.

Phần dịch trong
Đo nồng độ 4-hydroxy quinoline bằng máy HITACHI F-
3000 (
phát xạ
=380 nm
kíchthích
=315 nm)

18
- Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA(Trichloro
Acetic Acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo
Rhodamine B); Acid Acetic.
-
Các typ dùng 1 lần
: Bình nuôi cấy tế bào, phiến vi lợng 96 giếng, pipet
pasteur, các đầu tip cho micropipet
- Chất chuẩn chứng dơng tính
: Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào:
Elipticine hoặc Colchicine pha trong DMSO với nồng độ 0.01mM.
- Các chất sạch
: Các hợp chất sạch đợc phân lập trong khuôn khổ đề tài

dung

dịch
huyền phù tế bào.
- Phiến đợc ủ trong tủ CO
2
thêm 3 ngày.
- Kết thúc thí nghiệm: Tế bào khi ủ 3 ngày đợc cố định bằng dung dịch
TCA lạnh (30-50%). Rửa, để khô, nhuộm SRB 0,4% trong axit acetic 1% và rửa
lại bằng axit acetic 1% để loại mầu thừa và để khô, hoà lại bằng dung dịch đệm
Tris base 10 mM.
- Đọc trên máy ELISA ở bớc sóng 495-515nm.


Tính kết quả:
Giá trị CS: Là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử
tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo đợc của chúng OD (ngày 0),
DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS(%) theo
công thức:
OD (mẫu) OD (ngày 0)
CS% = x 100
OD (DMSO) OD (ngày 0)
Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, đợc đa vào tính toán Excel
để tìm ra % trung bình độ lệch tiêu chuẩn của phép thử đợc lặp lại 3 lần theo
công thức của Ducan nh sau: Độ lệch tiêu chuẩn

19


(x

2
, prostaglandin E
2
và
một số sản phẩm khác, là nguyên nhân chính của các quá trình gây nên hàng loạt
bệnh viêm nhiễm và sốc quá mẫn cảm. Một lợng không bình thờng của các
prostaglandin có thể tìm thấy từ những bệnh nhân mắc các chứng bệnh viêm
khớp, hen suyễn, bệnh vẩy nến, viêm ruột kết hoặc dễ bị sốc Đến nay, ngời ta
đã tìm đợc hai dạng COX đó là COX-1 và COX-2. COX-1 liên quan nhiều đến
mô tế bào và tiểu hồng cầu trong máu và gây ra các bệnh về sinh lý. Trong khi đó
COX-2 liên quan nhiều đến các bệnh bội nhiễm.
Thử nghiệm Cyclooxygenase:

COX đợc tiến hành dựa trên phơng pháp của Bohlin có cải biên. Phơng
pháp chung có thể tóm tắt nh sau: 10
à
l enzim [COX-1 (3.0 units, 0.43
à
g
protein), COX-2 (3,0 unit, 0,39 àg protein)] đợc hoạt hoá bằng 170 àl dung dịch
cofactor có chứa 1 àM hematin, 1,95 mM
l
-ephedrine và 0,49 mM trong dung
dich đệm Tris-HCl (pH 8.0), giữ lạnh trong nớc đá 4 phút. 10
à
l dung dịch mẫu
thử (trong DMSO) đợc bổ sung vào hỗn hợp phản ứng và tiếp tục đợc giữ lạnh
trong nớc đá thêm 10 phút. Phản ứng bắt đầu xảy ra ngay khi bổ sung 10
à
l (20

2
SO
4
10% đợc

20
phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện
màu.
2. Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G
F
254
(Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bớc sóng
254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H
2
SO
4

10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng nh cũ để xác định vùng
chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết
tinh trong dung môi thích hợp.
3. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột đợc tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thờng và pha
đảo. Silica gel pha thờng có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica
gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50
à
m, FuJisilisa Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi
ion Dianion HP-20 (Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).
4. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với detector tử ngoại-khả kiến

các dữ liệu, thờng đủ lớn để lu trên một thiết bị lu trữ nh đĩa hay băng. Dữ liệu này đợc
duy trì dới dạng một tập hợp các tập tin trong hệ điều hành hay đợc lu trữ trong các hệ quản
trị cơ sở dữ liệu

21
Cở sở dữ liệu thực vật đợc xây dựng dới dạng một tập hợp thông tin có cấu trúc, một
dạng tập hợp liên kết các dữ liệu và đợc lu trữ trên ổ đĩa cứng hoặc đĩa CD. Dữ liệu về thực vật
đợc duy trì dới dạng các tập tin (biên soạn bằng các công cụ của bộ ứng dụng văn phòng
Microsoft Office và Acrobat). Các tập hợp dữ liệu thực vật này đợc lữu trữ trong các hệ quản
trị cơ sở dữ liệu (Trong đề tài này hệ quản trị cơ sở dữ liệu đợc dùng là Microsoft Access
2000).
Hệ quản trị cơ sở dữ liệu là từ dịch từ tiếng Anh: Database Management System
(
DBMS
). Cụm từ này bao gồm những chơng trình có khả năng lu trữ, sửa chữa, xóa và tìm
kiếm thông tin trong một cơ sở dữ liệu (CSDL). Có rất nhiều loại CSDL khác nhau: từ phần
mềm nhỏ chạy trên máy vi tính cá nhân cho đến những hệ quản trị phức tạp chạy trên một hoặc
nhiều siêu máy tính.Tuy nhiên, tất cả những hệ quản trị CSDL trên thị trờng đều có một đặc
điểm chung là sử dụng ngôn ngữ truy vấn theo cấu trúc mà tiếng Anh gọi là "Structured Query
Language" (SQL). Các hệ quản trị CSDL phổ biến đợc nhiều ngời biết đến là Microsoft
Access 2000, MySQL, Oracle,PostgreSQL, SQL Server, DB2, vv. Phần lớn các hệ quản trị CSDL
kể trên hoạt động tốt trên nhiều hệ điều hành khác nhau nh Linux, Unix và MacOS ngoại trừ
SQL Server của Microsoft chỉ chạy trên hệ điều hành Windows
Ngôn ngữ lập trình (tiếng Anh programming language) là một tập con của ngôn ngữ
máy tính. Đây là một dạng ngôn ngữ đợc chuẩn hóa (đối lập với ngôn ngữ tự nhiên). Nó đợc
dùng để miêu tả những quá trình, những ngữ cảnh một cách rất chi tiết. Ngôn ngữ lập trình là
một hệ thống đợc ký hiệu hóa để miêu tả những tính toán (qua máy tính) trong một dạng mà cả
con ngời và máy đều có thể đọc và hiểu đợc. Theo định nghĩa ở trên thì một ngôn ngữ lập
trình phải thỏa mãn đợc hai điều kiện cơ bản là:
1. Nó phải dễ hiểu và dễ sử dụng đối với ngời lập trình, để con ngời có thể dùng nó giải

p
nhậ
p
dữ liệu
Giao diện nhập
liệu cho cơ sở
dữ liệu thực vật
Giao diện Web
của cơ sở d
ữ
liệu thực vật
Cơ sở dữ liệu
thực vật
Tru
y
xuất dữ li
ệ
u
C
ập
nh
ậ
t dữ li
ệ
u
Ngời quản lý cơ
sở dữ liệu
-Cập nhật dữ liệu
- Chỉnh sửa dữ
li

vào cơ sở dữ liệu

22
Phần II: Kết quả nghiên cứu
Chơng III. Kết quả thu thập mẫu và xây dựng cơ sở dữ liệu
III.1. Kết quả thu thập mẫu

Sau 3 năm thực hiện đề tài đã tiến hành thu thập đợc 512 mẫu thực vật.
Các mẫu thực vật đợc gửi đến các chuyên gia phân loại thực vật giám định tên
khoa học. Chúng tôi cũng đã tiến hành tạo tiêu bản mẫu để lu trữ lâu dài, đồng
thời đánh dấu các khu vực thu mẫu nhằm tiến hành khai thác các dợc liệu tiềm
năng. Trong đề tài này chúng tôi cũng đã tiến hành xây dựng các dữ liệu tổng
quan về từng loại thực vật thu thập đợc nh:
Tên khoa học, khu vực thu hái mẫu,
khu vực sinh sống của thực vật, ứng dụng y học cổ truyền, các nghiên cứu hoá
học đã đợc thực hiện, ảnh thực vật.
Các dữ liệu này đợc sử dụng trong xây
dựng cơ sở dữ liệu thực vật sử dụng cho đề tài. Danh sách các mẫu thực vật đợc
cập nhật vào cơ sở dữ liệu đợc trình bày trong bảng III.1.1a
Bảng III.1.1a: Danh sách các mẫu thực vật thu thập đợc (2003-2005)
STT
Ký
hiệu
Tên Việt
Nam
Tên khoa học Tên họ
Ghi
chú
1
VNH001

Móng bò trắng
Bauhinia acuminata L.
Fabaceae

7
VNH007
Bùm bụp
Mallotus apelta Muel-Arg.
Euphorbiaceae

8
VNH008
Kảm lênh
Pothos repens (Lour.) Druce
Araceae

9
VNH009
Xoan nhừ
Choerospondias axillaris Roxb.
Anacardiaceae

10
VNH010
Kim sơng
Micromelum minutum
Rutaceae

11
VNH011

ớt rừng
Tabernaemontana pallida Pierre ex Spire
Apocynaceae

17
VNH017
Cốt khí
Cassia occidentalis L.
Fabaceae

18
VNH018
Hồi núi
Illicium griffithii Hook.f. et Thoms.
Illiciaceae

19
VNH019
Bọ chó
Buddeja asiatica Lour.
Buddlejaceae

20
VNH020
Sổ
Dillenia pentagyna Roxb.
Dilleniaceae

21
VNH021

Bổ béo tía
Polygala aureocauda Dunn.
Polygalaceae

27
VNH027
Tai chua
Garcinia cowa Roxb.
Clusiaceae

28
VNH028
Vù hơng
Cinnamomum parthenoxylon Meisn.
Lauraceae

29
VNH029
Thành ngạnh
Cratoxylum cochinchinensis Lour. Bl.
Clusiaceae

30
VNH030
Dây tơ hồng
Cuscuta chinensis Lam.
Cuscutaceae

31
VNH031