ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LÊ THANH TÂM
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG
OXI HÓA VÀ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA
MỘT SỐ HỢP CHẤT LIGNAN VÀ
STILBENE
Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH
Mã số: 604429
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. NGUYỄN THỊ THANH MAI
2. GS. OLE VANG
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2010
I
Lời Cảm Ơn
Trước tiên, tôi xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Thanh Mai,
người đã tận tình giúp đỡ, chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong suốt
2.4 Các phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 6
2.4.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 6
2.4.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 7
2.4.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA 9
2.4.4 Phƣơng pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating
activity) 10
2.4.5 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) 10
2.4.5.1 Giới thiệu 10
2.4.5.2 Cấu tạo 10
2.4.5.3 Cơ chế hoạt động của enzyme XO 10
2.4.5.4 Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO 11
3. Giới thiệu phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào 12
III
3.1 Nuôi cấy tế bào 12
3.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào 13
3.2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào 13
3.2.2 Phƣơng pháp SRB 13
4. Tổng quan các chất nghiên cứu thuộc họ lignan và stilbene 14
4.1 Lignan 14
4.1.1 Isotaxiresinol (ITR) 15
4.1.2 Secoisolariciresinol
(SSR) 15
4.2 Stilbene 16
4.2.1 Resveratrol (RES) 17
4.2.2 Pterostilbene (PTS) 18
4.2.3 Piceatannol (PI) 19
5. Kết quả và thảo luận 21
5.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa 21
6.2.2.2 Chuẩn bị hóa chất 52
6.2.2.3 Sơ đồ biểu diễn quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 52
6.2.3 Phƣơng pháp ức chế enzyme XO 54
6.2.3.1 Nguyên tắc 54
6.2.3.2 Chuẩn bị hóa chất 54
6.2.3.3 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO 54
6.3 Nghiên cứu độc tính tế bào 56
6.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào 56
6.3.2 Phƣơng pháp SRB 57
7. Tài Liệu Tham Khảo 63
V
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ITR
Isotaxiresinol
SSR
Secoisolariciresinol
RES
Resveratrol
PTS
Pterostilbene
PI
Piceatannol
Da
Dalton
ROS
Reactive oxygen species
DNA
Deoxyribonucleic acid
DMSO
Dimethylsulfoxide
NaCl
Sodium chloride
PBS
Phosphate buffer saline
FBS
Fetal bovin serum
TCA
Trichloroacetic acid
COX-1
Cyclooxygenase - 1
COX-2
Cyclooxygenase - 1
HPLC
High performance liquid chromatography
GC
Gas chromatography
NMR
Nuclear magnetic resonance
VII
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của PI, RES và PTS 21
Bảng 2. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 21
Bảng 3. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 25
Bảng 4. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc enzyme XO 27
Bảng 5. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc enzyme XO của Allopurinol ở
nồng độ từ 0.2 đến 5 uM 27
Hình 12. Công thức cấu tạo của Pterostilbene 18
Hình 13. Công thức cấu tạo của Piceatannol 19
Hình 14. Công thức cấu tạo của Quercetin 51
IX
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1. Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 50
Sơ đồ 2. Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 53
Sơ đồ 3. Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO 55
X
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 1. Biễu diễn % ức chế gốc tự do DPPH• theo nồng độ các chất 22
Đồ thị 2. Biễu diễn % ức chế gốc tự do NO theo nồng độ các chất 26
Đồ thị 3. Biễu diễn % ức chế enzyme XO theo nồng độ các chất 28
Đồ thị 4. Sự phụ thuộc thời gian phơi nhiễm ITR trên số tế bào. 31
Đồ thị 5. Sự phụ thuộc nồng độ ITR trên sự phát triển tế bào theo SRB. 32
Đồ thị 6. Biễu diễn ảnh hƣởng của ITR lên đƣờng kính tế bào DLD-1 34
Đồ thị 7. Sự phụ thuộc thời gian phơi nhiễm SSR trên số tế bào theo CC 34
Đồ thị 8. Sự phụ thuộc nồng độ SSR trên số tế bào theo SRB 35
Đồ thị 9. Ảnh hƣởng của SSR lên đƣờng kính của dòng tế bào DLD-1 36
Đồ thị 10. Sự phụ thuộc thời gian vào số tế bào phát triển dƣới sự phơi nhiễm các
chất RES, PTS, PI tƣơng ứng với hình (A), (B), (C) theo phƣơng pháp CC 38
Đồ thị 11. Sự phụ thuộc nồng độ của các chất phơi nhiễm RES, PTS và PI vào số tế
bào tƣơng ứng ở các hình (A), (B), (C) theo phƣơng pháp SRB 39
Đồ thị 12. Ảnh hƣởng của RES trên đƣờng kính của dòng tế bào DLD-1 40
Đồ thị 13. Ảnh hƣởng của PTS lên đƣờng kính của dòng tế bào DLD-1 41
Đồ thị 14. Ảnh hƣởng của PI lên đƣờng kính của dòng tế bào DLD-1 42
29
.
Các hợp chất phenolic đại diện cho một nhóm lớn của các phân tử với các
nhóm chức khác nhau bao gồm nhiều loại nhƣ: các phenolic đơn giản (C
6
),
phenolic acid và các dẫn xuất (C
6
-C
1
), acetophenone và phenylacetic acid, (C
6
-
C
2
), cinnamic acid, cinnamyl aldehyde, cinnamyl alcohol, coumarin, isocoumarin
và chromone (C
6
-C
3
), chalcone, aurone, dihydrochalcone, flavan, flavone,
anthocyanidin, anthocyanin (C
15
), biflavonyl (C
30
), benzophenon, xanthone,
2
stilbene (C
6
.
Các hợp chất stilbene khác, cụ thể là trans-piceatannol (PIC) và trans-
pterostilbene (TPS), cũng đƣợc báo cáo là thể hiện các hoạt tính ngăn ngừa bệnh,
kháng viêm và chống oxi hóa. Các nghiên cứu sự ức chế sinh trƣởng hay chu
trình chết apoptosis đƣợc thực hiện trên các dòng tế bào lymphocyte, tế bào
melanocyte, các tế bào dạng biểu bì
13,27,36,37,46,50
.
Trong khi đó, các hợp chất lignan đƣợc biết đến nhƣ là những estrogen
thực vật, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Ngoài ra, các lignan nhƣ
secoisolariciresinol (SSR) và isotaxiresinol (ITR) đƣợc công bố có hoạt tính ức
chế chu trình chết của khối u gan
11,12,16,17,24,25
.
Từ các kết quả nghiên cứu về hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào
của RES nên hiện nay hợp chất này đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các loại dƣợc
phẩm hiện có trên thị trƣờng. Trong khi đó, các hợp chất khác thuộc họ phenolic
cũng đƣợc tìm thấy có nhiều hoạt tính sinh học nhƣng ít đƣợc sử dụng. Do đó
mục tiêu của đề tài này là xác định và so sánh hoạt tính chống oxy hóa và độc
tính tế bào trên dòng tế bào DLD-1 của các hoạt chất RES, PTS, PI thuộc họ
stilbene và SSR, ITR thuộc họ lignan. Từ đó đề ra các hƣớng ứng dụng mới cho
hợp chất tiềm năng và có thể thay thế RES.
3
2. Giới thiệu một số phƣơng pháp nghiên cứu khả năng chống oxi hóa
2.1 Khái niệm về gốc tự do
Oxy đƣợc xem nhƣ một nguyên tố quan trọng giúp con ngƣời duy trì sự
sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lƣợng cung
cấp cho mọi hoạt động sống của con ngƣời.
Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng
2,10,18
.
Các dạng oxy hoạt động này do có năng lƣợng cao, kém bền nên dễ dàng
phản ứng với những đại phân tử nhƣ protein, lipid, DNA, … gây rối loạn các quá
trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn
công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với
những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thƣờng gọi là phản ứng dây
chuyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể
2,10
.
Gốc tự do đƣợc tạo ra bằng nhiều cách. Nó có thể là sản phẩm của những
căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trƣờng, thuốc lá,
dƣợc phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nƣớc có
nhiều chlorine và ngay cả oxy
9,10
.
2.2 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể
Không phải là gốc tự do nào cũng có hại đối với cơ thể. Nếu đƣợc kiểm
soát, nó là nguồn cung cấp năng lƣợng cho cơ thể, tạo ra chất màu melamine cần
cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngăn ngừa nhiễm
4
trùng, tăng cƣờng miễn dịch, làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co
bóp cơ thịt
2
.
2.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể
Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con ngƣời
mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày.
Nếu không đƣợc kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa nhƣ:
.
5
Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS)
sẽ đƣợc loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể nhƣ
enzyme superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-Px),
enzyme catalase (CAT)… để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các
dạng chống oxy hóa trong cơ thể con ngƣời. Đó là một trạng thái cơ bản của cân
bằng nội mô (homeostasis). Do ảnh hƣởng của nhiều yếu tố tác động từ bên
ngoài hay bên trong cơ thể, làm cân bằng này di chuyển theo hƣớng gia tăng các
dạng oxy hoạt động. Trạng thái sinh lý này gọi là stress oxy hóa (oxidative
stress). Hay nói cách khác, stress oxy hóa là sự rối loạn cân bằng giữa các chất
chống oxy hóa và các chất oxy hóa theo hƣớng tạo ra nhiều các chất oxy hóa
5,38
.
Ngày nay, do ảnh hƣởng của điều kiện sống nhƣ: ô nhiễm môi trƣờng,
tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa
đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng
oxy hoạt động. Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi,
tổn thƣơng cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y. Do đó cần có
những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại
những tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe của con ngƣời. Bên cạnh đó, chúng ta
cũng cần khảo sát thêm những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ƣu và dễ
thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu. Dƣới đây chúng tôi xin giới thiệu một
số phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa đơn giản, ổn định và đã đƣợc
sử dụng rộng rãi trong thực tế.
6
2.4 Các phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa
2.4.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
2.4.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO
Trong hệ thống thần kinh trung ƣơng và ngoại biên, vai trò của NO rất quan
trọng: Đóng vai trò dẫn truyền thần kinh, mang tín hiệu đến bất cứ nơi nào trong cơ
thể, điều khiển cân bằng nội mô mạch não, điều hòa cảm nhận đau, điều khiển quá
trình tƣ duy và trí nhớ
2,33,39
.
NO đƣợc sinh ra từ NOS tổ chức (nNOS và eNOS) sẽ ảnh hƣởng lên
trƣơng lực cơ bản của mạch não và góp phần điều hòa vận mạch khi bị kích
thích. Vì vậy, sự rối loạn NO sẽ dẫn đến một số bệnh về não nhƣ bệnh: Alzeimer,
thiếu máu não, đột quỵ
22
.
NO có một vai trò vô cùng quan trọng đối với cơ thể là tác nhân góp phần
điều hòa huyết áp, ngoài ra NO còn là yếu tố gây giãn mạch nội sinh. Nếu quá
nhiều NO đƣợc sinh ra thì sự dãn mạch máu sẽ dẫn đến sự giảm huyết áp, và
ngƣợc lại, nếu lƣợng NO sinh ra ít sẽ dẫn đến hiện tƣợng tăng huyết áp
18
.
Sự rối loạn con đƣờng chuyển hóa L-arginin – NO làm thay đổi nồng độ
NO tạo ra. Những sự rối loạn này thƣờng dẫn đến một số bệnh nhƣ: chứng tăng
huyết áp, tiểu đƣờng, béo phì, suy tim, xơ vữa động mạch, lão hóa, tổn thƣơng
mạch máu. Ngoài ra, khi lƣợng NO sản xuất quá nhiều thì chính nó sẽ trở thành
N
N
NO
2
O
2
•
O
2-
↔ ONOO
-
4NO
•
+ O
2
+ H
2
O ↔ NO
2
-
+ H
+
Nguyên tắc
NO phản ứng với oxi tạo ra sản phẩm bền vững là nitrite và nitrate, hoạt
chất ức chế NO sẽ phản ứng cạnh tranh với oxy, kết quả là làm giảm sản phẩm
nitrit tạo thành trong dung dịch nƣớc và nồng độ nitrite trong dung dịch nƣớc
đƣợc xác định bằng phƣơng pháp trắc quang sử dụng thuốc thử Greiss. Trong đó,
nitrite phản ứng với thuốc thử Greiss tạo thành hợp chất màu diazo bền vững và
có bƣớc sóng hấp thu cực đại ở 540 nm. Dựa trên sự giảm nồng độ nitrite tạo
thành, ta tính đƣợc khả năng ngăn chặn gốc tự do NO của hoạt chất (tính trên %
ức chế)
5,8,33,39
.
Hình 2. Cơ chế phản ứng lên màu nitrite bằng thuốc thử Greiss
H
2
O
NED
N
H
C
H
2
C
H
2
N
H
2
=540 nm
H
2
N
O
2
S
N
N
H
C
H
sau:
Hình 3. Cơ chế phản ứng lên màu của MDA và Acid thiobarbituric
Malonyl dialdehyd
Acid thiobarbituric
Phức
Trimethin
HN
N
O
S
H
O
HN
N
O
S O
H
N
O
SNO
H
CH
2
CHO
HOC
2
5,7,38,51
.
2.4.5.2 Cấu tạo
Enzyme XO là một protein dimer đồng nhất (homodimeric protein) có
phân tử lƣợng là 300000 Da, trong đó mỗi monomer của protein tổ chức gồm 3
phần (domain) chính: một phần chứa 2 tâm Fe
2
S
2
, một phần chứa tâm
molybdenum (Mo) liên kết với pterin gọi là molybdopterin, một phần là flavin
adenine dinucleotide (FAD). Trong đó phần chứa Mo là phần lớn nhất và là trung
tâm hoạt tính xúc tác của enzyme, tâm Fe
2
S
2
và FAD đóng vai trò là những chất
vận chuyển điện tử trong quá trình oxy hóa đƣợc xúc tác bởi enzyme
21
.
2.4.5.3 Cơ chế hoạt động của enzyme XO
Enzyme XO là một trong ba loại enzyme chứa tâm hoạt tính xúc tác là
molybdenum (XO, DMSO reductase, sulfite oxidase). Enzyme XO xúc tác cho
sự hydroxyl hóa các chất nền khác nhau theo phản ứng tổng quát:
11
RH + H
2
O ROH + 2H
+
H
H
H
H
O
O
glu
126
MoS
S
O
O
SH
N
N
N
N
O
O
H
H
H
H
, e
MoS
S
O
O
S
N
O
O
Xanthine
Acid uric
VI
IV
V
VI
MoS
S
O
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
12
enzyme XO càng cao sẽ càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó sẽ làm giảm
giá trị mật độ quang.
HN
O NH
O
NH
N
+
H
2
O
+
O
2
2
XO
HN
O NH
NH
NH
O
O
+
O
2
+
H
2 2
12
enzyme XO càng cao sẽ càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó sẽ làm giảm
giá trị mật độ quang.
Xanthine
Acid uric
HN
O NH
O
NH
N
+
H
2
O
+
O
2
2
XO
HN
O NH
NH
NH
O
O
+
O
2
+
H
2 2
3.2.2 Phƣơng pháp SRB
Phƣơng pháp phân tích Sulforhodamine B (SRB) đầu tiên đƣợc Skehan và
các cộng sự phát triển để nghiên cứu khám phá các loại thuốc chống ung thƣ với
tỷ lệ lớn của Viện ung thƣ quốc gia vào năm 1985. Phƣơng pháp SRB dựa trên
khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dƣ lƣợng amino acid
của các protein
22,40
.
Dƣới các điều kiện môi trƣờng axit nhẹ, SRB liên kết với các dƣ lƣợng
amino acid trên các protein của các tế bào đã đƣợc cố định bằng trichloroacetic
Copyright: Tài liệu đại học ©