ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ THỊ NHẪM TÌM HIỂU ẢNH HƯỞNG CỦA BA VÀ NAA LÊN SỰ
TẠO CHỒI VÀ RỄ TRONG NUÔI CẤY IN-VITRO
CÂY CẨM CHƯỚNG DIANTHUS ‘TELSTAR
PURPLE PICOTEE’ Chuyên ngành: Sinh lý thực vật

Mã số: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

ã luôn chỉ dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
em trong quá trình học tập và làm luận văn.
• Các bạn cùng học cao học khóa 19 đã bên cạnh, chia sẻ, giúp đỡ tôi trong
thời gian học tập và làm luận văn. Cảm ơn em Phước đã giúp đỡ tôi trong
thời gian thực hiện luận văn.
• Cảm ơn các anh chị ở Trạm thực nghiệm Huấn luyện & Thực nghiệ
m Nông
nghiệp-Trung tâm Khuyến nông Tp. HCM đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp
đỡ tôi trong thời gian học tập và làm luận văn.
• Con xin cảm ơn cha mẹ và gia đình đã luôn động viên, tạo mọi điều kiện tốt
nhất cho con học tập và hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011.
Vũ Thị Nhẫm
MỤC LỤC
Trang
CÁC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC CÁC BẢNG vi
DANH MỤC CÁC HÌNH viii
DANH MỤC CÁC ẢNH ix
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. Giới thiệu về cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ 2
1.1.1. Vị trí phân loại 2
1.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố 2
1.1.3. Một số kết quả
nghiên cứu về cây cẩm chướng Dianthus 3
1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật 5

3.2.3.2. Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ 23
3.2.3.3. Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh 24
2.2.4. Khảo sát sự tạo rễ 25
2.2.4.1. Tạo rễ từ mô sẹo 25
2.2.4.2. Tạo rễ từ lá 25
2.2.4.3. Tạo rễ từ chồi in-vitro 25
2.2.5. Đưa cây ra vườn ươm 26
2.2.6. Quan sát hình thái giải phẫu 26
2.2.7. Đo cường độ hô hấp và hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
nội sinh 26
2.2.8. Xử lý thống kê 28
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả 30
3.1.1. Khử trùng hột 30
3.1.2. Khảo sát sự tạo mô sẹo 30
3.1.2.1. Tạo mô sẹo từ lá 30
3.1.2.2. Tạo mô sẹo từ lá mầm 34
3.1.2.3. T
ạo mô sẹo từ khúc cắt trụ hạ diệp 36
3.1.3. Khảo sát sự tạo chồi 37
3.1.3.1. Tạo chồi từ mô sẹo lá 37
3.1.3.2. Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ 39
3.1.3.3. Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh 44
3.1.4. Khảo sát sự tạo rễ 46
3.1.4.1. Tạo rễ từ mô sẹo 46
3.1.4.2. Tạo rễ từ lá 47
3.1.4.3. Tạo rễ từ chồi in-vitro 49

3.2.3. Sự thay đổi hình thái và sinh lý trong sự tạo rễ cây cẩm chướng Dianthus
‘telstar purple picotee’ 66
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 69
4.1. KẾT LUẬN 69

4.2. ĐỀ NGHỊ 69
CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D : 1,4-Dichlorophenoxy-acetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên khả năng tạo mô
sẹo của lá, lá mầm, khúc cắt trụ hạ diệp cây mầm cẩm chướng in-vitro 2
tuần tuổi 21
Bảng 2.2. Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng tái sinh chồi từ
mô sẹo lá 3 tuần tuổi 22
Bảng 2.3. Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên khả năng tạ
o
chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ 23
Bảng 2.4. Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên khả năng tạo
chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh 24
Bảng 2.5. Các môi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA lên khả năng tạo rễ từ mô
sẹo lá 3 tuần tuổi 25
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hột với Javel ở các nồng độ khác nhau 30
Bả
ng 3.2. Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự thay đổi hình thái mẫu cấy lá cẩm
chướng trên các môi trường tạo mô sẹo khác nhau theo thời gian nuôi cấy
31
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự thay đổi hình thái mẫu cấy lá mầm
cẩm chướng trên các môi trường tạo mô sẹo khác nhau theo thời gian
nuôi cấy 34
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của BA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo lá 3 tuần tuổi
trên các môi trường khác nhau sau 4 tuầ
n nuôi cấy 37
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự thay đổi hình thái khúc cắt thân mang
chồi ngủ theo thời gian nuôi cấy 39
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi
ngủ sau 4 tuần nuôi cấy 43
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Sự tương tác giữa auxin và cytokinin đối với phát sinh hình thái 14
Hình 2 : Sơ đồ ly trích các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 29
Hình 3: Sơ đồ nhân giống in-vitro cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’
68

vitro trồng trong vườn ươm sau 20 ngày (B), ra hoa sau 45 ngày (C) 50
Ảnh 11: Cắt ngang lá ở ngày 0 (A), lá gia tăng kích sau 1 tuần nuôi cấy (B), mô sẹo
hình thành từ lá sau 2 tuần nuôi cấy (C) trên môi trường MS½ + NAA 0,1
mg/l + BA 2 mg/l +15% ND (B4) 51
Ảnh 12: Mô sẹo đang phân chia ở ngày thứ 2 nuôi cấy trên môi trường MS½ + BA
1,5 mg/l +15% ND (A3) 52
Ảnh 13: Sơ khởi chồi (A) ở ngày thứ 5, chồi phát triể
n (B) ở ngày thứ 7 trên môi
trường MS½ + BA 1,5 mg/l +15% ND (A3) 52 Ảnh 14: Mô sẹo ở ngày thứ 2 (A), sơ khởi rễ ở ngày thứ 5 (B), sơ khởi rễ kéo dài
(C, D) ở ngày thứ 7 trên môi trường MS½+ NAA 0,2 mg/l (R2) 53
Ảnh 15: Vùng gân lá ở ngày 0 54
Ảnh 16: Cắt ngang lá sau 3 ngày trên môi trường MS½+ NAA 0,2 mg/l (R2) 54
Ảnh 17: Sơ khởi rễ ở ngày thứ 5 (A), sơ khởi rễ kéo dài (B) sau 1 tuần trên môi
trường MS½+ NAA 0,2 mg/l (R2) 54
Ảnh 18: Thân chồi ở ngày 0 (A), sơ khởi rễ và rễ kéo dài sau 1 tuần nuôi cấy trên
môi trường MS½ + 0,2 mg/l NAA (B) 55
đích tìm hiểu ảnh hưởng của hai
chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô là BA
và NAA lên quá trình tạo chồi và rễ trực tiếp từ cơ quan và gián tiếp thông qua mô
sẹo, cũng như một số biến đổi sinh lý trong quá trình phát sinh chồi và rễ để tạo ra số
lượng lớn cây con khỏe mạnh, đồng nhất, phục vụ cho nhu cầu sản xuất cây giố
ng
của thành phố và làm cơ sở cho những nghiên cứu sâu hơn về đối tượng này.
2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’
1.1.1. Vị trí phân loại
Giới: Plantae
Ngành: Magnophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Caryophyllales
Họ: Caryophyllaceae
Chi : Dianthus
Tên thực vật: Dianthus ‘telstar purple picotee’
Tên tiếng Anh: Dianthus Telstar Purple Picotee
1.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố
Cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ là cây thân thảo mọc hơi bò ở
phần gốc và thẳng đứng ở ngọn, thân có tiết diện tròn, nhẵn, cao 25-30cm, có đốt

Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý ethymethane sulphonate (EMS) in-vitro đối
với cây cẩ
m chướng Dianthus caryophylus thấy rằng nồng độ EMS càng cao, thời
gian xử lý mẫu càng dài thì tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi càng giảm. Xử lý EMS
đã làm tăng tỷ lệ biến dị cho cây cẩm chướng nuôi cấy in- vitro từ 5,1 đến 22,7 lần
so với đối chứng. Nồng độ và thời gian xử lý thích hợp là 0,4% EMS trong thời
gian 2 giờ (Nguyễn Thị Lý Anh và cs, 2009).
Nghiên cứu phát sinh phôi soma và tái sinh cây Dianthus caryophyllus ghi
nhận phôi soma chỉ được thành lập từ
mô sẹo cánh hoa còn các mô sẹo có nguồn
4

gốc từ đài hoa, đế hoa và lá non (lá thứ 2 và thứ 3 của chồi đỉnh) thì không tạo phôi
soma. Mô sẹo tạo ra trên môi trường MS + 2 mg/l 2,4-D + 0,2 mg/l BA + 9%
sucrose sẽ tạo được phôi soma khi chuyển qua môi trường MS không có chất điều
hòa sinh trưởng thực vật hoặc có bổ sung 2,4-D ở nồng độ thấp 0,2-0,4 mg/l, và 80-
85% phôi soma nẩy mầm phát triển thành cây con bình thường khi nuôi trên môi
trường MS½ + 3% sucrose (Karami, 2008)
Nghiên cứu nhân giống in-vitro từ mô phân sinh chồi đỉnh và mô phân sinh
chồi ngủ của cây c
ẩm chướng Dianthus caryophyllus ghi nhận môi trường MS + 4
mg/l BA đáp ứng hình thành chồi sau 6 ngày nuôi cấy đối với mô phân sinh chồi
đỉnh và sau 7 ngày nuôi cấy đối với mô phân sinh chồi ngủ. Môi trường nhân chồi
thích hợp nhất là MS + 1 mg/l BA cho số chồi nhiều nhất, đã tạo được 25,2 chồi
trong 16,2 ngày nuôi cấy, còn môi trường tạo rễ thích hợp nhất là MS +1 mg/l NAA
đã tạo được 9,6 rễ trong 8 ngày nuôi cấy (Ali và cs, 2008), và một nghiên cứu khác
khi nhân giống in-vitro từ mô phân sinh chồi đỉnh củ
a cây cẩm chướng Dianthus
caryophyllus cũng ghi nhận môi trường MS + 1 mg/l BA hay 1 mg/l kinetin thích
hợp nhất cho việc nhân nhanh chồi, còn môi trường MS + 0,5 mg/l NAA thích hợp

hình thái và cấu trúc thực vật mà cần phải tìm hiểu nguồn gốc phát sinh và các yếu
tố liên quan trong các biến đổi hình thái và cấu trúc.
Sự phát sinh hình thái tùy thuộc vào hai quá trình căn bản: điều hòa h
ướng
kéo dài và kiểm soát mặt phẳng phân chia của tế bào. Chính kiểu tăng trưởng của
mọi tế bào riêng rẽ quyết định hình thể của cơ quan và cơ thể thực vật.
Sự phát sinh hình thái liên quan một cách toàn diện tới nguồn gốc và sự phát
triển hình thái thực vật, nên không có một kỹ thuật hay phương pháp nào có thể
chứng minh được tất cả mọi khía cạnh của nó. Tất cả các kỹ thuật t
ừ nhiều lãnh vực
khác nhau như mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học và di truyền học đều
có thể giúp ta tìm hiểu hiện tượng phát sinh hình thái.
Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp thường được dùng
nhất là sự cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát
triển sau đó, và sự nuôi cấy trong điều kiện vô trùng có kiểm soát các phần tách rời
của một cơ thể
thực vật. Các nghiên cứu sinh lý học trực tiếp trên mô phân sinh
thường khó tiến hành do kích thước mô phân sinh quá bé nhỏ, nên sử dụng các chất
điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh nghiên cứu các sự kiện phát sinh hình thái
trên những cơ quan tách rời, đặc biệt là trong các thí nghiệm in-vitro được sử dụng
6

phổ biến, đã cung cấp nhiều thông tin quan trọng cho sự hiểu biết về phát sinh hình
thái (Bùi Trang Việt, 2000).
Sự phát sinh cơ quan trong nuôi cấy in-vitro có thể phát sinh trực tiếp từ mẫu
cấy hoặc gián tiếp qua giai đoạn tạo mô sẹo hay phôi vô tính, tùy thuộc vào nguồn
gốc của mẫu cấy, loại chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh bổ sung vào
môi trường nuôi cấy và nồng độ
của chúng.
1.2.2. Phát sinh cơ quan trực tiếp

sắp xếp tế bào giống như sinh mô chóp và có mạch gắn liền với mạch của thân. Tuy
nhiên, chồi thường được c
ảm ứng và tạo thành ở vùng ngoại vi nên thường được
xem là có nguồn gốc ngoại sinh (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001).
Bằng thực nghiệm nuôi cấy in-vitro đã tạo được chồi bất định từ mẫu cấy lá
cây dầu mè Jatropha curcas khi nuôi trên môi trường có bổ sung 1 mg/l BA kết hợp
với 1 mg/l kinetin, và 100% mẫu cấy được cảm ứng phát sinh chồi trực tiếp từ rìa
các vết cắt của mẫu cấy lá (Bùi Th
ế Vinh và cs, 2011)
Chồi bất định có thể phát sinh từ tế bào biểu bì, mô giậu, mô khuyết hay
vùng mô bao quanh mạch của mô cấy. Trước khi phân hóa để hình thành tầng phát
sinh chồi được tạo mới, tế bào đã phân hóa phải trải qua quá trình tái hoạt động. Sự
tái hoạt động này có thể được cảm ứng trên cây nguyên bằng cách gỡ ưu tính ngọn
hoặc trên mô cấy nhờ môi trường nuôi cấy có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng
thự
c vật thích hợp. Quá trình tái hoạt động trải qua hai giai đoạn: giai đoạn khử
phân hóa và giai đoạn tái phân hóa.
Trong giai đoạn khử phân hóa, tế bào đã phân hóa bắt đầu phân chia, các cơ
quan bên trong tế bào biến đổi để trở về trạng thái của các tế bào mô phân sinh thứ
cấp, sau đó từ trạng thái mô phân sinh thứ cấp chuyển sang trạng thái mô phân sinh
sơ cấp có khả năng sinh cơ quan. Tế bào có thể tích nhỏ, vách mỏng, t
ế bào chất
đậm đặc, nhân và hạch nhân rất to. Trong giai đoạn tái phân hóa, tế bào trở lại trạng
thái mô phân sinh thứ cấp (Bùi Trang Việt, 2003).
1.2.2.3. Sự hình thành rễ bất định
Rễ bất định là những rễ rất thông thường ở thực vật có mạch và được tạo ra ở
nhiều vùng trên cơ thể thực vật như đốt, nhánh phụ, lá thực vật cấp thấp nhưng có
mạch, đơn t
ử diệp hay song tử diệp nào nhân giống bằng giò, dây leo, thủy thực vật
hoặc những thực vật sống bám vào cây chủ (Võ Thị Bạch Mai, 2004).

Sự tạo mô sẹo liên quan đến tình trạng sinh lý của mô cấy, liên quan đến việc
sử dụng auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin, bản chất và nồng độ của auxin
(Bùi Trang Việt, 2000). Ví dụ, như ở cây gỗ rừng Eurycoma longifolia, m
ẫu cấy
thân cây mầm có tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất so với các mẫu cấy khác như lá,
cuống lá, lá mầm, rễ. Ở cây Saccharum officinarum, 2,4-D có khả năng hình thành
9

mô sẹo tốt hơn NAA và IBA đối với mẫu cấy lá khi nuôi trên môi trường MS có bổ
sung 10% nước dừa, nồng độ 2,4-D 3 mg/l tạo mô sẹo tốt nhất (Gopitha và cs,
2010); nhưng ở cây Gossypium hirsutum khi môi trường nuôi cấy có chứa 2,4-D thì
mô sẹo bị hóa nâu và chất lượng không tốt bằng khi bổ sung vào môi trường nuôi
cấy NAA (Abdellatrf và Khalaphallah, 2008); ở cây Agropyron cristatum, dicamba
và picloram ảnh hưởng khác nhau đến sự hình thành chồi và mô sẹo, dicamba tác
động hình thành mô sẹo tốt hơn picloram; picloram tác độ
ng tốt hơn dicamba trong
sự hình thành chồi (Can và cs, 2008).
Mẫu cấy càng non thì càng dễ tạo mô sẹo, do khả năng phân chia tế bào
mạnh của những cơ quan còn non. Ngược lại, những cơ quan trưởng thành hay già
thường ít có khả năng tạo mô sẹo.
Trong nuôi cấy in-vitro, sử dụng auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin
để kích thích quá trình tạo mô sẹo ở những cơ quan còn non.
Sự tạo mô sẹo in-vitro, nhờ auxin, thuộc một trong 3 quá trình:
- Sự phản phân hóa của các tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan)
- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng. Các tế bào tượng tầng của phần lớn
cây hai lá mầm dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin, thậm chí không cần
auxin ngoại sinh như ở các loài cây cỏ hay dây leo.
- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ). Quá trình này được
ưu tiên áp dụng ở cây một lá mầm, vì ở các cây này tượng tầng thường thiếu, và các
tế

tế bào (Robert và Friml, 2009)
Ở mức tế bào, auxin kích thích sự kéo dài tế bào, sự phân chia của tượng
tầng, đồng thời giúp sự phân hóa của các mô dẫn. Auxin c
ũng có khả năng cảm ứng
trực tiếp sự phân hóa tế bào nhu mô thành các tổ chức mô dẫn. Trong sự phân chia
tế bào tượng tầng, auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng, nhưng
hầu như không tác động đến mô phân sinh sơ cấp. Như vậy, auxin tác động trên sự
tăng trưởng theo bề dày. Ở nồng độ cao, auxin kích thích sự tạo mô sẹo.
Trong sự phát triển chồi, auxin chẳng những kích thích sự t
ăng trưởng chồi
non, mà còn khởi phát sự tạo chồi mới. Nồng độ auxin có vai trò quan trọng trong
sự phát triển chồi; ở nồng độ thấp (và thường cần phối hợp với cytokinin), auxin
khởi phát mô phân sinh ngọn; vượt nồng độ nào đó, auxin cản sự phát triển của phát
thể vừa được tạo mới hay của mô phân sinh nách (chồi nách); các chồi bây giờ vào
11

trạng thái tiềm sinh, chúng chỉ được tái lập tăng trưởng khi sự cản (do auxin) được
gỡ.
Trong sự phát triển rễ, auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ,
nhưng cản sự tăng trưởng của các sơ khởi này (Mai Trần Ngọc Tiếng và cs, 1980).
Thật ra auxin không phải là chất duy nhất liên quan trong sự tạo rễ; auxin cần phối
hợp với các chất khác: vitamin (như
thiamin mà rễ không tổng hợp được), acid amin
(như arginin), và nhất là các hợp chất ortho-diphenolic (như acid cafeic, acid
chlorogenic) (Bùi Trang Việt, 1998).
Trong sự hình thành rễ đặc biệt là rễ phụ, hiệu quả của auxin là rất đặc
trưng. Sự hình thành rễ phụ có thể chia làm 3 giai đoạn: giai đoạn đầu là phản phân
hóa tế bào trước tầng phát sinh; tiếp theo là xuất hiện mầm rễ và cuối cùng mầm rễ
sinh trưởng thành rễ phụ chọc th
ủng vỏ và ra ngoài. Để khởi xướng sự phản phân

Hiệu quả sinh lý đặc trưng của cytokinin là kích thích sự phân chia tế bào
mạnh mẽ. Vì vậy, người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào,
nguyên nhân là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp acid nucleic và
protein dẫn đến kích sự phân chia tế bào (Vũ
Văn Vụ và cs, 2003).
Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình
phân chia tế bào, cụ thể cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha trong nguyên
phân và giữ cho qúa trình này diễn ra một cách bình thường.
Cytokinin ở nồng độ thấp kích thích sự phát triển của chồi nách, ở nồng độ
cao hơn sẽ cảm ứng hình thành chồi bất định nhưng chồi rất khó ra rễ (Nguyễn Thị
Ngọc Hương, 2009).
Ðể tăng hệ số
nhân giống, người ta thường tăng nồng độ cytokinin trong môi
trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in-vitro (Võ Thị Bạch Mai, 2004) nhưng nồng
độ cytokinin cao sẽ làm giảm số lượng và chất lượng chồi, có thể gây hiện tượng
thủy tinh thể của cụm chồi (Wang và cs, 1984).
Trong sự hình thành rễ, sự có mặt của cytokinin trong môi trường nuôi cấy
thường hạn chế khả năng ra rễ. Cây sẽ hình thành r
ễ trong môi trường có bổ sung
auxin hay không còn phụ thuộc loài thực vật (Rout và cs, 2004). 13

1.2.2.3. Sự tương tác giữa auxin và cytokinin
Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có sự hiện diện của
auxin. Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và
phân bào. Cytokinin kích thích sự kéo dài tế bào, quá trình do auxin cảm ứng,
nhưng cũng kích thích sự sự gia tăng kích thước của tế bào mà auxin không tác
động (Bùi Trang Việt, 1998).