SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHKT TRẺ
#  " BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NCKH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MULTIPLEX PCR
PHÁT HIỆN SỰ HIỆN DIỆN CỦA E.COLI,
S.AUREUS MANG GEN SINH ĐỘC TỐ TRONG
THỨC ĂN NHANH TẠI TP.HCM
Chủ nhiệm đề tài : ThS. Diệp Thế Tài

Cơ quan chủ trì : Sở Khoa học – Công nghệ TP.HCM DANH SÁCH CỘNG TÁC VIÊN

1. PGS. TS. Trương Thò Xuân Liên
2. ThS. Phẩm Minh Thu
3. BS. Nguyễn Thò Phương Lan
4. Th.S. Trần Chí Thành
5. CN. Nguyễn Thò Nguyệt

LỜI MỞ ĐẦU
An toàn thực phẩm là vấn đề quan trọng đối với sức khỏe con người và ảnh
hưởng đến đời sống của toàn xã hội. Trong số những vụ ngộ độc do tác nhân vi
khuẩn, Staphylococcus aureus, Salmonella, E.coli là những tác nhân chiếm đa số.
Trong quá trình trao đổi chất, các vi khuẩn này tiết ra các độc tố gây ngộ độc cho
người, ví dụ nhự S.aureus chỉ cần một lượng nhỏ độc tố < 1 µg là có thể gây độc cho
người.
Hiện nay, các phương pháp xác đònh vi khuẩn hiện diện trong thực phẩm,
thường mất nhiều thời gian. Mặt khác, khi những thực phẩm đã được xử lý, bằng
phương pháp nuôi cấy khó xác đònh được sự hiện diện của chúng. Tuy nhiên, độc tố
do vi khuẩn tiết ra vẫn còn hiện diện trong thực phẩm, đặc biệt là các độc tố bền
với nhiệt, chúng không bò nhiệt phân hủy nên khả năng gây bệnh cho người vẫn còn
rất cao.
Gần đây, Becker và cộng sự đã dùng multiplex PCR để phát hiện các nhóm
gen mã hoá độc tố cuả Staphylococcus. Mehrotra và cộng sự cũng dùng mutiplex
PCR để phát hiện các gen mã hoá độc tố cuả Staphylococcus aureus. (11). Luca
Cocolin và cộng sự (2000), cũng cho rằng dùng kỹ thuật multiplex PCR để khuyếch
đại các gen mã hoá các độc tố khác nhau cuả vi khuẩn bằng những mồi chuyên biệt
là một đònh hướng tốt cho việc phát hiện các chủng vi khuẩn mang gen gây bệnh
2

TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU


I.2. Tại Việt nam:
Tại Việt Nam, theo Cục vệ sinh an toàn thực phẩm : Năm 2001 có 231 vụ
ngộ độc với 3.036 người mắc và 61 người tử vong. Năm 2002 có 194 vụ ngộ độc với
4.694 người mắc và 69 người tử vong. Phân tích xét nghiệm cho thấy 50% các vụ

4
ngộ độc do nguyên nhân là thức ăn nhiễm khuẩn. Ước tính trung bình người dân và
nhà nước đã thiệt hại khoảng 500 tỷ đồng/năm để xử lý các vụ ngộ độc này.[3]
Số vụ Số người mắc Số tử vong
Năm 1999 327 7575 61
Năm 2000 213 4233 59
Năm 2001 245 3901 63
Năm 2002 194 4694 69
Năm 2003 238 6428 37
Năm 2004 145 3584 41
Năm 2005 141 4291 50
Đến tháng 10/2006 139 5564 49
Tổng cộng 1642 40.270 425
Bảng I.1: Tình hình ngộ độc thực phẩm (1999 – 2006) tại Việt Nam
(Theo cục quản lý chất lượng VSATTP)
Tại các khu vực của Việt Nam số ca ngộ độc thực phẩm xảy ra không đồng
đều giữa các năm và các tỉnh thành.
I.2.1. Khu vực miền Bắc, miền Trung, miền Nam:
Theo một nghiên cứu tại các chợ Hà Nội, nhìn chung 100% số mẫu thức ăn
bò nhiễm vi khuẩn hiếu khí, 80% số mẫu bò nhiễm coliform ở mức cao và không đạt
tiêu chuẩn cho phép. Có đến 28.6% số mẫu lòng lợn luộc và 16,1% số mẫu rau sống
đã nhiễm E.coli . [5]
Số ca ngộ độc thực phẩm cũng xảy ra ở các khu vực miền Trung và miền
Nam. Theo báo cáo bệnh truyền nhiễm của Viện Vệ sinh Dòch tễ Tây Nguyên
trong 3 năm từ 2001 đền 2003, cho thấy 39,9% số mẫu bò nhiễm vi sinh vật [8].

Biểu đồ I.1: Tình hình ngộ độc thực phẩm tại tp.HCM trong 10 năm
I.2.2.2. Khu vực xảy ra ngộ độc:
Các khu vực xảy ra ngộ độc thường tập trung tại các quận ven trung tâm
thành phố như quận Bình thạnh, quận Gò vấp, quận Củ Chi, và các quận vừa thành
lập như quận 12, quận Tân Phú Các vụ ngộ độc thường xảy ra tại các bếp ăn tập

6
thể, khu công nghiệp và hộ gia đình , và số ca ngộ độc có người mắc trên 100
chiếm tỷ lệ cao.
Hình I.1: Đòa điểm xảy ra ngộ độc thực phẩm trong 3 năm gần đây (2004 - 2006).
II. ĐỘC TỐ CỦA CÁC VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM :[7]

II.1. Độc tố E.coli :[7 ]
E.coli là một trong số các tác nhân gây bệnh liên quan đến đường ruột.Tuy
nhiên, không phải Escherichia coli nào cũng gây bệnh, các chủng E.coli gây bệnh,
chúng thường tiết ra các độc tố ( Echeverria et al., 1989). Các nhóm độc tố E.coli
gây bệnh thường là EPEC, EHEC và ETEC (Levine, 1987). Dựa trên các nhân tố
độc lực người ta chia E.coli thành 5 nhóm khác nhau:
- Enteroaggregative ( EaggEC)
- Enterohemorrhagic (EHEC)
- Enteroinvasive ( EIEC)
- Enteropathogenic (EPEC)
- Enterotoxigenic (ETEC)


thường gây đau đầu, nôn mửa, ỉa chảy có đàm máu.
II.1.4. Nhóm EPEC:
Nhóm này cũng không có khả năng tạo ra enterotoxin, mặc dù chúng cũng
có khả năng gây bệnh cho người. Đặc biệt chúng cò khả năng gây bệnh cho trẻ em
dưới một tuổi.

Hình I.3.: Các gen mã hoá độc tố EPEC
II.1.5. Nhóm ETEC:
Chúng có khả năng tạo ra enterotoxin và có khả năng gây bệnh rất nặng ở
người. Độc tố của nhóm này rất nhạy cảm với nhiệt. Ngoài loại độc tố nhạy cảm với
nhiệt, chúng còn có khả năng tạo ra loại độc tố bền nhiệt.
ETEC là một nhóm E.coli gây bệnh tiêu chảy mất nước thường gặp ở trẻ em.
Chúng tiết ra hai loại độc tố ST ( độc tố bền với nhiệt) và LT ( độc tố không bền
với nhiệt). Những chủng E.coli gây bệnh này chúng có thể chỉ tạo ra một loại độc
tố LT, ST hoặc cả hai. 9
 Độc tố không bền với nhiệt:
LT là một loại độc tố oligomeric có cấu trúc và chức năng gần với độc tố của
Vibrio cholerae. Có hai nhóm độc tố LT chính, LT-1 và LT-2. LT-1 được tiết ra bởi
những chủng E.coli gây bệnh cho người và cả động vật. Còn LT-2 chỉ được phát
hiện trên những chủng gây bệnh cho động vật, hiếm khi phát hiện được trên người.
Gen mã hoá cho độc tố LT là elt hay etx, những gen này hiện diện trên plasmid.
 Độc tố bền với nhiệt :
Ngược với LT, ST là một loại độc tố nhỏ monomeric chứa nhiều cysteine,
thông qua những custeine này hình thành những cầu nối disulfide giúp cho các độc
tố này bền với nhiệt. Gen mã hoá cho độc tố này đa phần hiện diện trên plasmid,
nhưng một vài gen mã hoá cho độc tố này hiện diện trên transposons. Có hai loại
độc tố STa và STb. Nhóm STa chỉ gây bệnh cho người, còn STb thường gặp chủ

9 loại enterotoxin của Staphylococcus đã được nghiên cứu đầy đủ. Enterotoxin của
tụ cầu là loại chòu nhiệt.
S.aureus là một trong số các tác nhân thường gặp trong các vụ ngộ độc thực
phẩm. Trong quá trình trao đổi chất, chúng tiết ra độc tố và gây ngộ độc cho người.
Độc tố enterotoxin cuả S.aureus được chia thành 7 loại : SEA, SEB, SEC, SED,
SEE ( Su YC et al., 1997). Phần lớn, các độc tố của S.aureus là độc tố bền nhiệt,
không bò phá hủy trong quá trình chế biến thực phẩm ( Tortora GJ, 1995). Trong số
các loại độc tố trên thì SEA, SEB, SECs là những loại độc tố thường gặp.

II.2.1 Độc tố :
II.2.1.1 Độc tố bề mặt:
Gồm các loại độc tố staphylosin (gồm α-hemolysin và β-hemolysin) ,
leukocidin, protein A, polysacharide vỏ.
• α-hemolysin
Đây là một loại độc tố phá màng. Độc tố là một monomer kết hợp với màng
của những tế bào dễ bò độc. Ở người, tiểu cầu và bạch cầu đơn bào nhạy với α-

11
toxin. Những tế bào dễ bò độc có một thụ thể chuyên biệt cho α toxin và cho phép
độc tố kết hợp tạo ra những lỗ nhỏ cho những ion đơn hoá trò đi qua. Do đó, cách
thức hoạt động của α toxin là phá hủy tính thấm chọn lọc của tế bào.
• β-hemolysin
Đây là enzyme sphingomyelinase phá những màng có nhiều loại lipid.
• Leukocidin:
Leukocidin là một phức hợp protein được tạo thành từ nhiều thành phần riêng
biệt và cùng hoạt động với nhau để phá màng. Leukocidin ít độc hơn α toxin. Đây
là một nhân tố rất quan trọng trong sự xâm nhiễm da bò hoại tử.
Ngoài ra, leukocidin là một độc tố có chức năng diệt bạch cầu đa nhân và
chống lại sự thực bào của vật chủ và giúp cho sự xâm nhiễm của S.aureus dễ dàng
hơn.

Ngoại độc tố có tính chòu nhiệt cao và khả năng chòu nhiệt của chúng trong
thực phẩm cao hơn trong môi trường nuôi cấy phòng thí nghiệm, các xử lý nhiệt qua
chế biến thực phẩm thông thường không thể phá hủy được các độc tố.
Ngoại độc tố hoà tan được trong nước và trong dung dòch muối, đặc điểm này
giúp độc tố có thể nhiễm đựơc vào nhiều loại thực phẩm khác nhau. Ngoại độc tố
có tính ổn đònh cao, kháng với hầu hết các enzyme tiêu hoá như pepsin hay trypsin
và vì vậy nó có thể duy trì đựơc hoạt động của nó trong hệ thống tiêu hoá của vật
chủ.
• Độc tố gây hội chứng shock TSST - 1:
S.aureus sản xuất độc tố TSST-1 gây ra hội chứng sốc do độc tố. Biểu hiện
của hội chứng diễn ra một cách có hệ thống. Đầu tiên, độc tố gây sốt nhanh, nôn
mửa và tiêu chảy. Sau đó là đau họng, đau cơ và phát ban rồi tróc da nhất là trong
lòng bàn tay và bàn chân. Huyết áp tăng đột ngột dẫn đến tr tim. Hội chứng sốc

13
do độc tố có thể xảy ra ngay sau sự xâm nhiễm S.aureus nếu độc tố được phóng
thích với số lượng lớn và cơ thể thiếu kháng thể.

Hình I.5. Cơ chế hoạt động của enterotoxin:
Độc tố có thể hoạt động theo hai dạng khác nhau là hoạt động sinh học và
hoạt động miễn dòch. Hai phương thức hoạt động này là hai chức năng riêng bòêt
được đònh vò trên những chuỗi khác nhau của protein độc tố. Hầu hết các trường hợp
đột biến gen dẫn đến mất hoạt động miễn dòch thì cũng dẫn đến mất hoạt động sinh
học và ngược lại.

Hoạt động miễn dịch :
Sau khi độc tố vào máu thi hoạt động như một siêu kháng nguyên, siêu kháng
nguyên không phải là một kháng nguyên thực sự vì nó không gây đáp ứng miễn
dòch một cách bình thường.
Kháng nguyên bình thường có khả năng liên kết một cách đặc hiệu với thụ thể

hiện Staphyloccocus trong nhiều năm.

15
Phương pháp truyền thống để phát hiện độc tố LT dựa trên việc nuôi tế bào
chuột tàu (CHO) hoặc tế bào thượng thận chuột Ý. Độc tố LT làm tế bào chuột Ý co
tròn và tế bào CHO bò kéo dài ra. Phát hiện độc tố nhờ sự quan sát hình dạng tế bào
nuôi.
Về sau, một vài phương pháp miễn dòch đã sử dụng để phát hiện độc tố ST,
LT bao gồm phương pháp phân tích miễn dòch phóng xạ và phương pháp hấp phụ
dùng men liên kết (ELISAs) hay còn gọi là phương pháp miễn dòch dùng men
(EIA). Đây là phương pháp đựơc dùng khá phổ biến trong các phòng thí nghiệm.
Phương pháp này dựa trên cơ sở sử dụng một thể tiếp hợp chứa kháng thể đặc hiệu
với một kháng nguyên và được gắn với một loại men nhất đònh. Men liên kết trong
thể tiếp hợp có tác dụng xúc tác cho một phản ứng hoá học, phản ứng này sinh ra
một sản phẩm có màu từ cơ chất không màu. Sản phẩm có màu này có thể phát
hiện bằng mát thường khi cần kết quả đònh tính hoặc có thể đo bằng quang phổ kế
hay khúc xạ kế khi cần kết quả đònh lượng.

III.1.2. Phương pháp chuẩn đoán phân tử:
ETEC là một trong những vi sinh vật gây bệnh đầu tiên được phát hiện bởi
việc sử dụng các phương pháp chẩn đoán phân tử. Năm 1982, người ta đã sử dụng
có hiệu quả các mẫu dò DNA để phát hiện gen mã hoá ST và LT trong mẫu phân
và mẫu môi trường bằng phương pháp lai phân tử. Kể từ đó, mặc dù có nhiều
phương pháp khác được đề nghò nhưng kỹ thuật phân tử vẫn thu hút sự quan tâm và
được sử dụng nhiều hơn. . Cơ sở của hiện tượng lai phân tử là sự tách rời hai mạch
đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ môi trường vượt quá nhiệt độ nóng chảy
(Tm) của phân tử và sự tái bắt cặp giữa các trình tự tương đồng sau đó. Một trong
hai trình tự bổ sung ( thường là trình tự đích, tức là trình tự cần tìm) được cố đònh
trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên mô hoặc tế bào. Sự lai phân tử xảy ra khi
các trình tự bổ sung gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp

màu hay phát sáng [11]. 17

Hình I.7.: Sơ đồ nguyên tắc phản ứng ELISA. [11]
Một sản phẩm ELISA đã được thương mại hóa là bột Kit TECRA
TM
có khả
năng phát hiện và đònh danh được các loại độc tố enterotoxin A, B, C, D, E của vi
khuẩn Staphylococcus aureus. [11]
III.2.3.
Kỹ thuật miễn dòch phóng xạ(RIA): [4]
Nguyên tắc kỹ thuật RIA gần giống như kỹ thuật ELISA nhưng kháng thể
phát hiện được đánh dấu phóng xạ và sự hiện diện của kháng nguyên độc tố được
phát hiện bằng tín hiệu phóng xạ.
III.2.4.
Kỹ thuật ngưng kết: [9]
* Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu thụ động ngược (RPHA):
Nguyên tắc của RPHA là kháng thể đặc hiệu được gắn với tế bào hồng cầu,
khi gặp kháng nguyên là độc tố cho phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên, kháng
thể xảy ra và có thể quan sát hiện tượng ngưng kết các hạt hồng cầu bằng mắt
thường.
Phương pháp này dễ thực hiện nhưng có nhiều trường hợp không cho phản
ứng đặc hiệu. Do đó, phương pháp được cải tiến bằng kỹ thuật RPLA.
* Kỹ thuật ngưng kết latex thụ động ngược (RPLA):
Nguyên tắc: kháng thể được gắn với giá thể rắn là các hạt latex bằng nhựa
polystyrene. Khi mẫu thử có kháng nguyên là độc tố cần phát hiện thì phản ứng
ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể gắn trên hạt latex xảy ra tạo nên đám
ngưng kết lớn.

đoạn DNA tổng hợp được giới hạn bởi hai đoạn mồi.
* Quy trình:

19
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
. Bước 1 (biến tính): phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn T
m
của
phân tử, thường là 94-95°C. Mạch đôi DNA đươc tách ra thành dạng mạch đơn.
Thời gian kéo dài từ 30-60 giây.
. Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp hơn T
m
của các mồi, cho phép các mồi
bắt cặp với mạch khuôn, thường nhiệt độ dao động trong 40 - 70°C tùy thuộc T
m
của
các mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây.
. Bước 3 (kéo dài): nhiệt độ được tăng lên 72°C giúp cho DNA polymerase-
một enzyme chòu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bước này tùy
thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường từ 30 giây đến nhiều phút. 20Hình I.8.: Sô ñoà phaûn öùng PCR[13]

21
Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bước sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần,
mỗi lần làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp

VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP 23