Nghiên cứu đặc điểm nhiễm sắc thể
v phát hiện mất đoạn azfc
ở bệnh nhân vô sinh nam giới luận văn thạc sĩ Y học H Nội, năm 2009


Bộ giáo dục v đo tạo Bộ Y tế

Trờng Đại học y H Nội
Nguyễn Đức Nhự
Tôi xin chân thnh cảm ơn PGS.TS Trần Thị Thanh Hơng,
nguyên Trởng Bộ môn, PGS.TS. Phan Thị Hoan, Phụ trách Bộ
môn, cô Lê Thúy Hằng v các thầy, cô giáo, các bạn đồng nghiệp tại
Bộ môn Y sinh học Di truyền, Đại học Y H Nội đã chỉ bảo, động
viên, tạo điều kiện tốt v giúp đỡ tôi hon thnh bản luận văn ny.
Tôi xin chân thnh cảm ơn TS.BS Lê Vơng Văn Vệ Giám
đốc Trung tâm Nam học v hiếm muộn H Nội, cùng các đồng
nghiệp tại Khoa Nam học Bệnh viện Việt Đức đã tạo điều kiện v
giúp đỡ tôi trong thời gian nghiên cứu v hon thnh bản luận văn
ny.
Tôi xin chân thnh cảm ơn Ban lãnh đạo v khoa Y sinh học
Viện Pháp y Quốc gia đã tạo điều kiện v giúp đỡ tôi để tôi có thể
hon thnh bản luận văn ny.
Tôi xin chân thnh cảm ơn tới Đảng ủy, Ban Giám hiệu Nh
trờng, phòng Đo tạo Sau đại học, trờng Đại học Y H Nội đã giúp
đỡ v tạo điều kiện tốt cho tôi trong việc học tập, nghiên cứu v hon
thnh bản luận văn ny.
Cuối cùng, tôi xin đợc by tỏ lòng biết ơn đối với gia đình v
bn bè, những ngời đã luôn động viên, khuyến khích tôi trong suốt
quá trình học tập để tôi có thể hon thnh đợc bản luận văn ny.
H Nội, ngy tháng 9 năm 2009
Tác giả
Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các
số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và cha ai công bố trong bất
kỳ công trình nào khác.

6
8
8
9
12
12
15
18
19
Chơng 2: đối tợng v phơng pháp nghiên cứu
23
2.1. Đối tợng nghiên cứu
2.2. Tiêu chuẩn chọn đối tợng
2.3. Phơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phơng pháp
2.2.2. Lập hồ sơ bệnh án, xét nghiệm
2.2.3. Phơng pháp nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi
để thu hoạch cụm kỳ giữa, phân tích NST và lập karyotyp.
2.2.4. Phơng pháp phát hiện mất đoạn AZFc trên NST Y
2.4. Xử lý số liệu.
2.5. Khía cạnh đạo đức của đề tài
23
23
24
24
24
23

26
29

4.3. Phát hiện mất đoạn AZFc trên NST Y bằng kỹ thuật phân tích ADN
4.3.1. Phân bố tỷ lệ mất đoạn AZFc
4.3.2. Phân bố vị trí mất đoạn quan sát đợc
4.4. Mối liên quan giữa bất thờng NST, mất đoạn AZFc trên NST Y và
mật độ tinh trùng
kết luận
kiến nghị
48

48
50
51
52
52
55
59
59
62
63

66
67
Tài liệu tham khảo
Phụ lục 1: - Bệnh án di truyền của bệnh nhân vô sinh nam giới
Phụ lục 2: - Danh sách bệnh nhân đợc xét nghiệm NST, gen
Nh÷ng ch÷ viÕt t¾t


trong những yêu cầu bắt buộc trớc khi tiến hành điều trị và hết sức cần thiết
để thực hiện t vấn di truyền. Các kỹ thuật xét nghiệm tinh dịch đồ đã giúp
chúng ta phát hiện những trờng hợp vô sinh nam là do KCTT hoặc ITT. Tuy
nhiên, nguyên nhân rối loạn vật chất di truyền gây ra KCTT hoặc ITT ở rất
nhiều bệnh nhân vô sinh nam giới nhiều khi không đợc phát hiện để quyết
định hớng điều trị và t vấn di truyền.
Trong những năm gần đây, di truyền học ngời là lĩnh vực đang phát
triển nhanh, mạnh và có rất nhiều thành tựu. Lĩnh vực di truyền y học nghiên
cứu ở cả hai mức độ tế bào và phân tử đã giúp cho các thầy thuốc lâm sàng
tìm hiểu đợc những nguyên nhân KCTT hoặc ITT dẫn đến vô sinh nam giới
là do rối loạn vật chất di truyền.
Phơng pháp nuôi cấy tế bào và kỹ thuật nhuộm tiêu bản nhiễm sắc
thể (NST), đặc biệt là kỹ thuật nhuộm băng ngày càng phát triển và cải tiến
không ngừng đã giúp cho các nhà di truyền học phát hiện đợc các biểu hiện
rối loạn số lợng và cấu trúc NST.
Hiện nay, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán
nguyên nhân vô sinh ở nam giới do mất đoạn nhỏ trên nhánh dài của nhiễm
sắc thể Y đang phổ biến trên thế giới. ở mức độ phân tử, chủ yếu là phát
2
hiện những mất đoạn nhỏ ở những vùng AZF (Azoospermia factor). Vùng
AZF chứa nhiều gen khác nhau và những mất đoạn trong những vùng này đã
đợc xác định là gây ra suy giảm sinh tinh trùng, đợc coi là nguyên nhân
bất thờng di truyền thứ hai sau hội chứng Klinefelter gây ra vô sinh ở nam
giới [67].
Phát hiện đợc những mất đoạn nhỏ trên NST Y sẽ cung cấp thêm
bằng chứng và sự hiểu biết đầy đủ về bất thờng di truyền liên quan đến vô
sinh nam giới [24]. Những hiểu biết này sẽ trợ giúp cho việc chẩn đoán

phát (vô sinh I). Vô sinh thứ phát là vô sinh mà ngời vợ trớc đây đã từng
có thai, đến nay không thể có con đợc (vô sinh II).
Vô sinh nam giới là vô sinh mà nguyên nhân hoàn toàn do ngời
chồng, ngời vợ hoàn toàn bình thờng. Vô sinh nữ giới là vô sinh mà
nguyên nhân hoàn toàn do ngời vợ, ngời chồng hoàn toàn bình thờng.
Vô sinh không rõ nguyên nhân là các trờng hợp vô sinh mà thăm
khám lâm sàng và làm các xét nghiệm kinh điển ở cả vợ và chồng vẫn không
phát hiện đợc nguyên nhân khả dĩ có thể quan sát đợc [29].
Trong vô sinh nam giới, nguyên nhân do bất thờng số lợng tinh
trùng là rất thờng gặp, đó là những trờng hợp vô sinh nam do KCTT và
ITT. Theo WHO, vô sinh nam giới do KCTT (azoospermia) là tình trạng
không tìm thấy tinh trùng trong tinh dịch khi xuất tinh, thờng do tinh hoàn
không sản xuất đợc tinh trùng.
ITT (oligozoospermia) là là tình trạng số lợng tinh trùng ít hơn 20 x
10
6
tinh trùng/ml tinh dịch.
ITT mức độ nặng (severe oligozoospermia) là những bệnh nhân có số
lợng tinh trùng ít hơn 5 x 10
6
tinh trùng/ml tinh dịch [85], [86].

4
1.1.2. Tình hình vô sinh và vô sinh nam giới trên thế giới
Theo WHO (1985), nguyên nhân vô sinh có khoảng 20% là không rõ
nguyên nhân, 80% có nguyên nhân, trong đó vô sinh do nữ chiếm 40%, vô
sinh do nam chiếm 40% và nguyên nhân do cả vợ và chồng là 20%. Theo

ở Việt Nam, một số công trình nghiên cứu về vô sinh cho thấy tỷ lệ
vô sinh có xu hớng tăng. Điều tra dân số năm 1980, tỷ lệ này chỉ ở mức
7%-10%, đến năm 1982, tỷ lệ vô sinh chung ở Việt Nam lên đến 13%, trong
đó vô sinh nữ chiếm 54%, vô sinh nam chiếm 36%, vô sinh không rõ nguyên
nhân chiếm 10% [10].
Theo Phan Văn Quyền (2000) tỷ lệ vô sinh là 10%-15% [11]. Theo
Trần Thị Trung Chiến và cs. (2002) đã công bố tỷ lệ vô sinh chiếm 5%,
trong đó vô sinh do nam giới chiếm 40,8% [4].
Ngô Gia Hy (2000), đã nhận định rằng trong số các cặp vợ chồng bị
vô sinh thì nguyên nhân do ngời chồng là 40%, do ngời vợ là 50% và do
cả hai vợ chồng là 10% [7].
Nghiên cứu của Nguyễn Khắc Liêu và cs. tại Viện Bảo vệ Bà Mẹ và
trẻ sơ sinh từ năm 1993-1997 cho thấy vô sinh nữ giới chiếm 54,5%, vô sinh
nam giới chiếm 35,6%, vô sinh không rõ nguyên nhân là 10% [8].
Theo nhận xét của Trần Quán Anh, hiện nay cứ 100 cặp vợ chồng thì
có khoảng 15 cặp vợ chồng không thể có con, trong đó trên 50% nguyên
nhân là do nam giới và tỷ lệ này đang có chiều hớng gia tăng mạnh.
Theo báo cáo của Trần Thị Phơng Mai (2001), vô sinh nguyên nhân
do nữ giới thờng chiếm khoảng 30%-40% các trờng hợp. Vô sinh nam
giới chiếm khoảng 30% các trờng hợp. Khoảng 20% các trờng hợp tìm
thấy nguyên nhân vô sinh ở cả hai vợ chồng. Bên cạnh đó, có khoảng 20%
các cặp vợ chồng sẽ không tìm thấy nguyên nhân gây vô sinh [9].
6
Nhìn chung, theo thống kê của các tác giả nghiên cứu ở Việt Nam đều
cho rằng nguyên nhân vô sinh do nam giới chiếm tỷ lệ gần bằng với vô sinh
do nữ giới. Với các số liệu nêu trên, rõ ràng vô sinh nói chung và vô sinh
nam giới nói riêng đang là một vấn đề lớn về y học và xã hội ở Việt Nam.

Theo WHO, (1999) trong các nguyên nhân vô sinh do nam giới thì có
đến 90% là do bất thờng tinh trùng, tức là có liên quan trực tiếp đến tinh
dịch đồ [86]. Để khảo sát một cặp vợ chồng hiếm muộn, phải thực hiện xét
nghiệm ít nhất một tinh dịch đồ của ngời chồng. Dựa trên tiêu chuẩn của
WHO năm 1999, nếu tinh dịch đồ bất thờng phải xét nghiệm lại lần thứ hai
cách lần thứ nhất ít nhất hai tuần và xa nhất dới ba tháng. Tiêu chuẩn thực
hiện và đánh giá của WHO (1999) hiện đang đợc áp dụng hầu hết ở các cơ
sở xét nghiệm tinh dịch trên thế giới [86].
Bảng tiêu chuẩn xét nghiệm tinh dịch đồ theo WHO (1999) [86].
Chỉ số Giá trị bình thờng
Thể tích tinh dịch
2.0 ml
pH
7.2
Mật độ tinh trùng
20 x 10
6
TT/ml
Tổng số tinh trùng
40 x 10
6
TT /một lần xuất tinh
Di động
50% di động tịnh tiến hoặc
25% di động nhanh sau 60 phút
Hình thái bình thờng
30%
Khả năng sống
75% hoặc hơn
Tế bào bạch cầu

Các nhóm nguyên nhân vô sinh nam giới (Theo WHO) [86].
Rối loạn về tình dục và phóng tinh Nhiễm trùng tuyến sinh dục phụ
Miễn dịch Nội tiết
Bất thờng tinh dịch Tinh trùng ít
Bệnh lý toàn thân Tinh trùng di động yếu
Dị tật bẩm sinh Tinh trùng dị dạng
Tổn thơng tinh hoàn mắc phải KCTT do tắc nghẽn
Giãn tĩnh mạch tinh KCTT không rõ nguyên nhân
Nguyên nhân do khám và điều trị
9
Cách phân loại trên đã giúp tiêu chuẩn hóa việc chẩn đoán các nguyên
nhân vô sinh do nam giới trên thế giới và để so sánh các nghiên cứu. Tuy
nhiên, với sự tiến bộ của y học gần đây, các thầy thuốc đã tìm ra các nguyên
nhân vô sinh nam giới, đặc biệt các nguyên nhân liên quan đến di truyền,
cách phân loại này cũng đang đợc tiếp tục nghiên cứu, cải thiện để phù hợp
với sự phát triển của kỹ thuật chẩn đoán [15].
1.3.2. Nguyên nhân do rối loạn di truyền ở mức độ NST
Bất thờng di truyền nói chung và bất thờng NST nói riêng đợc coi
là một trong những nguyên nhân gây ITT hoặc KCTT, đôi khi do không
đợc chẩn đoán xác định nên thờng đợc xếp vào nhóm KCTT không rõ
nguyên nhân.
Theo các tài liệu đã công bố trên thế giới, ở vô sinh nam giới bất
thờng NST thờng cao gấp 6 lần và bất thờng NST giới tính cao gấp 15 lần
so với dân số trong cộng đồng [11]. Với sự tiến bộ của di truyền học tế bào,
nhiều nghiên cứu đã cho thấy khoảng 20%-30% bệnh nhân KCTT là do bất
thờng di truyền [63]. Kjessler phát hiện bất thờng về karyotyp gây vô sinh
chiếm khoảng 21% [90].

(47,XXY) có 11 trờng hợp, hội chứng Klinefelter thể khảm có 9 trờng hợp
và các biến thể của nó có 5 trờng hợp [64].
Han-Sung Chiang (2004) nghiên cứu trên 334 nam giới vô sinh ở Đài
Loan phát hiện thấy 22,5% nam giới vô sinh có bất thờng di truyền, trong
đó 15,9% là có rối loạn NST [36].
Báo cáo của Lakshim Rao (2004) cho thấy bất thờng NST chiếm
11,5% trong tổng số 251 nam giới vô sinh. Hội chứng Klinefelter và các biến
thể của nó là 3,18% [48].
Theo kết quả nghiên cứu của Punam Nagvenkar (2005) tại ấn Độ trên
những bệnh nhân KCTT hoặc ITT mà không có tắc nghẽn phát hiện thấy bất
th
ờng bộ NST ở 14,3% bệnh nhân KCTT, 6,5% ở những bệnh nhân ITT
dới 5 triệu/ml tinh dịch và tỷ lệ chung là 10,2% [61].
11
Theo Daniel (2005), cứ 1 trong 1.000 trẻ khi sinh có karyotyp là 47,
XXY. Hầu hết nam giới có karyotyp là 47, XXY bị vô sinh. Tỷ lệ hội chứng
Klinefelter ở 3% vô sinh nam giới, trong đó có 5%-10% KCTT và ITT [28].
Các nhà chuyên môn về sản phụ khoa và vô sinh tại Hội nghị Việt -
Pháp - Châu á Thái Bình Dơng diễn ra tại Thành Phố Hồ Chí Minh ngày
16/8/2008 cho biết, qua 11 cuộc khảo sát trên 9766 trờng hợp nam giới vô
sinh do KCTT hoặc ITT trên thế giới cho thấy có 5,8% trờng hợp bị bất
thờng về NST, trong đó bất thờng NST giới tính nổi bật nhất ở những bệnh
nhân KCTT và ITT mức độ nặng (chiếm 4,2%). Còn bất thờng về NST
thờng chỉ chiếm một số ít.
ở Việt Nam, tại Bệnh viện Từ Dũ, thành phố Hồ Chí Minh cũng đã
gặp những trờng hợp vô sinh nam giới có bộ NST 47,XXY hoặc bất thờng
về số lợng và cấu trúc NST.

nghiên cứu sự ảnh hởng của mất đoạn nhỏ trên NST Y có liên quan đến quá
trình sinh tinh [47].
Năm 1976, Tiepolo và Zuffardi nghiên cứu trên 1170 trờng hợp đã
phát hiện 6 trờng hợp KCTT bị mất 1 đoạn lớn ở phần xa nhánh dài NST Y
qua phân tích karyotyp. Phơng pháp nhuộm băng NST đã xác định đợc
những mất đoạn này ở vị trí Yq11 và đa ra giả thuyết quan trọng về đoạn
AZF trên NST Y. Tuy nhiên, những phân tích sâu hơn về vùng này rất khó
khăn vào thời điểm đó do cha có bản đồ gen chi tiết trên NST Y. Nghiên
cứu của Tiepolo và Zuffardi lần đầu tiên cung cấp những bằng chứng về
nguyên nhân di truyền là do mất đoạn NST Y gây suy giảm sinh tinh trùng
[75]. Sau đó, vào năm 1986, Vergnaud và cs. đã chia vùng AZF thành
khoảng 5 và 6. Trên cơ sở đó, đã có nhiều nghiên cứu tiếp theo của Vogt và
cs. (1992), Ma và cs. (1993) cũng phát hiện ra sự mất đoạn trên NST Y có
liên quan đến suy giảm sự sinh tinh trùng và dẫn đến vô sinh ở nam giới.
Tiếp theo, vào năm 1992, Vollrath và cs. lần đầu tiên báo cáo nghiên cứu ở
13
mức độ phân tử bằng kỹ thuật PCR dựa trên các trình tự đích (Sequence
Taggeg Sites STSs) và đã xác định đợc 132 vị trí STSs trên NST Y [82].
Với sự phát triển không ngừng của các kỹ thuật di truyền, đặc biệt là
kỹ thuật di truyền phân tử, các nhà nghiên cứu đã chỉ rõ đợc việc mất
những đoạn nhỏ trong vùng AZF liên quan đến KCTT hay ITT mà trớc đây
đợc cho là không rõ nguyên nhân. Ba vùng AZF trên nhánh dài NST Y liên
quan đến sinh tinh trùng lần lợt là AZFa, AZFb, và AZFc [51]. Vị trí của
ba vùng AZF trên nhánh dài NST Y đợc minh họa ở hình 1.1.

Hình 1.1: Mô hình cấu trúc NST Y, vùng AZFa,b,c và các nhóm gen [46]
Mất đoạn nhỏ xảy ra ở ba vùng AZFa,b,c thờng dẫn đến những rối

chẩn đoán mất đoạn hoàn toàn AZFb hoặc AZFb+c là phù hợp với việc
không nên khuyên những bệnh nhân này tìm tinh trùng để tiến hành kỹ thuật
ICSI.
- Vùng AZFc nằm ở vị trí gần với đầu gần vùng dị nhiễm sắc, kích
thớc của nó khoảng 1,4 Mb. Có nhiều gen quan trọng ở vùng này và những
mất đoạn nhỏ trên vùng AZFc liên quan chủ yếu đến 5 nhóm gen DAZ,
CDY1, BPY2, PRY, và TTY2 [73].
15
Mất đoạn ở vùng AZFc liên quan đến sự thay đổi về lâm sàng và mức
độ mô học của tinh hoàn. Nhìn chung, những mất đoạn AZFc còn có khả
năng sinh đợc tinh trùng. Mất đoạn AZFc có thể tìm thấy trên những nam
giới KCTT hoặc có ITT, và trong một số trờng hợp rất hiếm, thậm chí ngời
đó có thể di truyền gen mất đoạn cho con trai của họ. ở những nam giới
KCTT, mất đoạn AZFc vẫn có cơ hội tốt để tìm thấy tinh trùng bằng kỹ thuật
TESE và những đứa trẻ có thể đợc sinh ra bằng thụ thai bằng phơng pháp
ICSI. Do đó, những đứa trẻ là con trai cũng sẽ bị mất đoạn AZFc giống nh
ngời cha.
Các nghiên cứu cho thấy, những tổn thơng mất đoạn nhỏ trên NST Y
cũng có thể truyền từ cha sang con, mà đặc biệt là bé trai sẽ làm tăng nguy
cơ vô sinh cho thế hệ sau [20].
1.3.3.2. Tình hình nghiên cứu về mất đoạn nhỏ trên NST Y ở thế giới
và Việt Nam.
Dựa trên cơ sở của Tiepolo và Zuffardi (1976) báo cáo có 6 bệnh nhân
nam giới vô sinh do KCTT bị mất đoạn ở nhánh dài của NST Y [75], cho đến
nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu khác về những mất đoạn trên NST
Y ở những bệnh nhân vô sinh nam giới trên khắp thế giới.
Vogt và cs. (1992) đã nghiên cứu trên 19 bệnh nhân vô sinh nam giới

là 5% và 9,63% [20], [64].
Năm 2004, Mostafa nghiên cứu trên 33 bệnh nhân vô sinh nam giới ở
Ai Cập cũng phát hiện 12% có mất đoạn nhỏ trên NST Y [55]. Han-Sun
Chiang (Đài Loan) cũng báo cáo 30 bệnh nhân phát hiện mất đoạn nhỏ trên
NST Y chiếm tỷ lệ 9% [36]. Theo Yong Hoo Lee (2000), tại Hàn Quốc thì tỷ
lệ mất đoạn nhỏ trên NST Y là 11,1% ở những bệnh nhân KCTT [83].
Mir Davood Omrami (2006) nghiên cứu ở những ngời vô sinh nam
giới tại Azarbaijan thấy có tới 24,2% bệnh nhân có mất đoạn nhỏ trên NST
17
Y và không phát hiện thấy mất đoạn tơng tự ở nhóm nam giới sinh sản bình
thờng [54].
Theo các tác giả, ở những nam giới KCTT thì tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên
NST Y cao hơn so với những ngời có ITT và tỷ lệ phát hiện có mất đoạn
khác nhau ở từng nghiên cứu, có thể thay đổi từ 1%-10%, thậm chí cao hơn.
Những nghiên cứu khác gần đây cho thấy rằng 10%-15 % trong số nam giới
KCTT và khoảng 5%-10% ITT mức độ nặng có đột biến mất đoạn Yq11.
Theo J.T. Arruda nghiên cứu trên 63 bệnh nhân vô sinh nam giới ở Brazin đã
phát hiện 28 bệnh nhân có mất đoạn nhỏ NST Y, trong đó có 10/23 bệnh
nhân ở nhóm KCTT và 18/40 bệnh nhân ở nhóm ITT mức độ nặng [22].
Sarah Girardi (1997) nghiên cứu ở Mỹ phát hiện tỷ lệ mất đoạn nhỏ
NST Y là 7% ở những nam KCTT, 10% ở những nam giới có số lợng tinh
trùng dới 1 triệu/ml, 8% ở những nam giới có số lợng tinh trùng từ 1 đến
dới 5 triệu/ml [67].
Báo cáo của Ferlin (2007) khi nghiên cứu trong 10 năm trên 3073
bệnh nhân vô sinh nam giới ở nớc ý cho thấy nguyên nhân do mất đoạn
nhỏ NST Y chiếm 3,2% ở những bệnh nhân ngẫu nhiên, 8,3% ở nhóm bệnh
nhân KCTT không có tắc nghẽn, và 5,5% ở những nam giới ITT [29].

cũng mới đợc nghiên cứu thực hiện. Khảo sát bớc đầu ở bệnh viện Từ Dũ
đã phát hiện đợc một số mất đoạn nhỏ NST Y ở những bệnh nhân thuộc
nhóm nguy cơ cao [11]. Tuy nhiên cho đến nay, cha có tài liệu nào chính
thức đợc công bố về tỷ lệ mất đoạn nhỏ NST Y ở những bệnh nhân vô sinh
nam giới.
1.3.3.3. Những đột biến gen trên các NST khác
Xơ hóa u nang là một bệnh rối loạn di truyền liên quan đến đột biến
gen CFTR trên nhánh dài NST số 7 (Kerem v cs., 1989; Riordan v cs.,
1989). Đột biến gen CFRT gây u xơ nang là một bệnh lý di truyền thờng
gặp ở ngời da trắng. Nam giới bị bệnh này thờng không có ống dẫn tinh