Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
-------------------------------------------------
ĐÀO XUÂN THANH NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU
PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG BẰNG KỸ THUẬT
NUÔI CẤY BAO PHẤN Ở CÂY LÚA LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP
THÁI NGUYÊN, NĂM 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
Lêi c¶m ¬n

Để hoàn thành khóa học và thực hiện đề tài, ngoài sự nỗ lực của bản
thân, tôi còn nhận đƣợc sự giúp đỡ, chỉ dẫn của các thầy cô giáo Khoa Nông
học, tập thể cán bộ công nhân Trung tâm Thực hành Thực nghiệm - Trƣờng
Đại học Nông lâm Thái Nguyên, bạn bè cùng gia đình.
Nhân dịp này tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới tập thể thầy, cô giáo
và cán bộ nhân viên:
Bộ môn công nghệ sinh học - Khoa Nông học - Trƣờng Đại học Nông
lâm Thái Nguyên
Bộ môn Giống cây trồng - Khoa Nông học - Trƣờng Đại học Nông lâm
Thái Nguyên
Đặc biệt cho phép tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:
PGS.TS.Trần Ngọc Ngoạn – Phó Hiệu Trƣởng - Trƣờng Đại học Nông
lâm Thái Nguyên
PGS.TS. Ngô Xuân Bình - Phó trƣởng khoa Nông học - Trƣờng Đại học
Nông lâm Thái Nguyên
ThS. Phạm Văn Ngọc - Bộ môn cây trồng - Khoa Nông học - Trƣờng
Đại học Nông lâm Thái Nguyên.
Đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua
Xin kính chúc thầy cô, các anh chị cán bộ cùng bạn bè và gia đình luôn

v.v…các nhà tạo giống đã có nhiều thành công với những giống mới có năng
suất và sản lƣợng cao. Song việc sử dụng các phƣơng pháp tạo giống nhƣ đã
nói ở trên tuy có tạo ra những tổ hợp lai năng suất cao nhƣng độ thuần chƣa
ổn định. Mặt khác, nếu áp dụng phƣơng pháp chuyển gen bất dục đực mẫn
cảm nhiệt độ vào các giống lúa thuần rồi chọn thuần nhƣ các giống lúa thuần
thì phải mất khoảng 10 vụ bởi vì giống bất dục đực mẫn cảm với nhiệt độ chỉ
kết hạt trong điều kiện nhiệt độ < 24
0
C. Nhƣ vậy, thời gian từ tạo đƣợc giống
đến khi phổ biến sản xuất thực tiễn đại trà phải mất 10 năm. Trong những
năm gần đây, việc ứng dụng biện pháp nuôi cấy bao phấn tạo các dòng nhị Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
bội, nhanh chóng tạo các giống lúa thuần có năng suất cao, chống chịu tốt,
đã thu đƣợc nhiều kết quả. Đó là phƣơng pháp tạo dòng thuần nhanh và hiệu
quả nhất.
Tuy nhiên, mỗi dòng lúa với những tính trạng di truyền khác nhau, sẽ
có hàm lƣợng Auxin trong cây khác nhau do đó sẽ có những phản ứng khác
nhau với điều kiện nuôi cấy. Để thành công trong việc tạo các dòng thuần
bằng kỹ thuật nuôi cấy đó thì phải xác định đƣợc những yêu cầu về vật liệu
cấy, môi trƣờng dinh dƣỡng, các tác nhân vật lý, hoá học…của các dòng lúa
và đánh giá đƣợc khả năng thích ứng của chúng trên đồng ruộng.
Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên
cứu tạo vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống bằng kỹ thuật nuôi cấy
bao phấn ở cây lúa”
2. Mục đích của đề tài
- Xác định đƣợc mức ảnh hƣởng của các nhân tố: vật lý, môi trƣờng
nuôi cấy, nồng độ hormon kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo mô sẹo, tái

- Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần bổ sung quy trình kỹ thuật tạo cây lúa
thuần đồng hợp tử bằng phƣơng pháp nuôi cấy bao phấn. Từ đó làm cơ sở cho
việc chọn các dòng tế bào nhƣ:
+ Chọn dòng kháng sâu bệnh.
+ Chọn dòng chịu thâm canh…
- Lựa chọn sơ bộ đƣợc một số dòng thuần, làm vật liệu khởi đầu cho
công tác tạo giống ƣu thế lai.
- Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần định hƣớng, làm tăng tính khả thi cho
những đề tài nghiên cứu về bao phấn lúa tiếp theo.
* Ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất:
Rút ngắn thời gian tạo giống, do đó giảm giá thành sản xuất giống lúa
mới đồng thời nhanh chóng đƣa đƣợc nhiều giống lúa mới vào sản xuất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
CHƢƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình nghiên cứu mô tế bào thực vật
1.1.1. Lịch sử phát triển
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã đƣợc các nhà khoa học tiến hành vào
cuối thế kỷ XIX.
Quá trình phát triển đó có thể tạm chia thành 4 giai đoạn. [12]
1.1.1.1. Giai đoạn khởi xƣớng (1898-1930)
Phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã đƣợc nhà Bác học
ngƣời Đức Grottied Haberlandt đề xƣớng năm 1898. Ông đã tìm cách nuôi

Năm 1955 Miller và Skoog trong khi nuôi cấy mô lõi cây thuốc lá đã
xác định đƣợc vai trò của Kinetin tới việc kích thích sự phát triển của mô.
Những phát hiện mới mẻ về vai trò của các chất kích thích sinh trƣởng 2,4D,
IAA, NAA, kinetin, các vitamin trong giai đoạn này là bƣớc tiến quan trọng
trong lịch sử của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
1.1.1.3. Giai đoạn phát sinh hình thái (1950 - 1960)
Năm 1956 Miller và Skoog đã thành công trong thí nghiệm tạo chồi từ
mô thuốc lá nuôi cấy. Chính Skoog đã phát hiện ra vai trò của kinetin trong sự
phân hoá các cơ quan của cây thuốc lá.
Những năm 1958-1959 Reinert (Đức) và Steward (Mỹ) đã nuôi cấy tế
bào cây cà rôt và thu đƣợc phôi soma từ mô của chúng.
Năm 1956 Nickell đã nuôi cấy thành công tế bào đơn Phaseolus vulgais
trong dung dịch lỏng.
Năm 1960, bằng kỹ thuật gieo tế bào, Bergman đã tái sinh thành công
tế bào đơn của cây thuốc lá. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
1.1.1.4. Giai đoạn nghiên cứu di truyền (1960 đến nay)
Các thành tựu của giai đoạn này đã chính thức ứng dụng kỹ thuật nuôi
cấy mô và tế bào thực vật invitro vào công tác giống và nghiên cứu di truyền.
Năm 1960 Cooking (Anh) đã dùng men Cellulose để phân hủy vỏ
cellulose của tế bào thực vật và thu đƣợc các tế bào không có vỏ, còn gọi là
các tế bào trần (protoplast).
Nitsch (1967), Nakata và Tanaka (1968) là những ngƣời thành công
đầu tiên trong việc tạo cây thuốc lá đơn bội bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn.
Takabe (1971) tái sinh đƣợc cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast.
Melchers(1977) dung hợp protoplast thành công giữa khoai tây và cà
chua tạo cây “Pomate”

Oono (1968), Chu (1982), Hu (1985), Zapata (1990) cho thấy sự khác biệt của
các kiểu gen kéo theo sự khác biệt trong khả năng nuôi cấy lúa. Kiểu gen loài
phụ Indica phát triển và tạo mô sẹo kém so với loài phụ Japonica.
Theo Mathias và Fukki (1986) khả năng tái sinh của cây lúa trong nuôi
cấy tế bào bị chi phối bởi sự tƣơng tác tế bào chất, nhân của chính nó.
* Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của cây trong thời điểm lấy mẫu
Các tác giả Oono (1975), Lin (1976), Chen (1977) cho thấy: mẫu bao
phấn đƣợc lấy vào thời điểm các tiểu bào tử trong bao phấn đang ở giai đoạn
đơn bào muộn là tốt nhất. Bao phấn ở giai đoạn tứ thể không có khả năng
phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy invitro, Bao phấn ở giai đoạn đơn bào
sớm phát triển kém.
Hạt phấn chỉ có thể phát triển tốt khi đã tách ra khỏi tứ tử (giai đoạn
đơn bào giữa đến đơn bào muộn).
*Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý đòng
Kêt quả nghiên cứu của Zhou và Cs (1983) đã cho thấy rằng: Xử lý
đòng ở nhiệt độ thấp rất có hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn lúa. Điều kiện
lạnh làm tăng khả năng tạo cây xanh.
+ Chaleff và Cs (1975) xử lý đòng ở 6
0
C trong 5 ngày Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
+ Hu và Cs (1978) đã xử lý đòng lúa ở nhiệt độ 10
0
C trong thời gian 4 -
8 ngày.
+ Matitin và Drimo Millo (1981) đã tiến hành xử lý đòng lúa ở nhiệt độ
2 - 4

và tái sinh cây. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9
Trong kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa, các chất điều hoà sinh trƣỏng có
thể sử dụng ở dạng đơn hay kết hợp theo những tỷ lệ khác nhau
Năm 1980, Khi nuôi cấy bao phấn lúa Japonica, Yang và cộng sự đã
sử dụng kết hợp NAA 4mg/l + 2,4D 1mg/l + IAA 2mg/l + Kinetin 3mg/l .
Kết quả cho thấy rằng nếu môi trƣờng tạo mô sẹo có chứa 2,4D nồng độ
1mg/l thì mô sẹo dễ dàng tái sinh thành cây.
Theo Wasakd (1982): IAA xúc tiến quá trình hình thành rễ, Sự kết hợp
các auxin: IAA, NAA, Kinetin một cách hợp lý sẽ xúc tiến mạnh mẽ quá
trình phân hoá tế bào và tái sinh cây xanh.
Nhìn chung, các chất tham gia vào môi trƣờng nuôi cấy bao phấn lúa
nhƣ chất điều hoà sinh trƣởng, muối, đƣờng, sắt, Vitamin..... đều có sự ảnh
hƣởng lẫn nhau và ảnh hƣởng chung đến kết quả của quá trình nuôi cấy.
* Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý trong môi trường
Các yếu tố vật lý của môi trƣờng bao gồm:
+ Trạng thái vật lý của môi trƣờng ở dạng rắn hay lỏng
+ Độ pH môi trƣờng
+ Độ ẩm không khí
+ Ánh sáng và nhiệt độ của phòng nuôi cấy
Các yếu tố trên tác dụng trực tiếp đến sự hình thành mô sẹo và khả
năng tái sinh chồi.
Kết quả nghiên cứu lúa mỳ của Bjarmsta (1989) cho thấy rằng xử lý
ánh sáng cƣờng độ cao sẽ kìm hãm quá trình tạo mô sẹo nhƣng lại kích thích
quá trình tạo cây xanh, ánh sáng yếu hoặc ánh sáng khuyếch tán không ảnh
hƣởng gì đến khả năng tạo mô sẹo của mẫu cấy.
* Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau đến quá trình nuôi cấy bao phấn.

bằng phƣơng pháp nuôi cấy invitro.
Sau nhiều năm tiến hành nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn, năm 1993
Nguyễn Hữu Hổ và Nguyễn Văn Uyển đã có những kết luận sau:
- Trong mô túi phấn có chất ức chế ảnh hƣởng tới sự phát triển hạt phấn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11
- Giữa phôi dinh dƣỡng và hạt phấn hoặc là giữa các phôi với nhau
luôn luôn có sự cạnh tranh làm ức chế quá trình tái sinh cây.
- Trong môi trƣờng nuôi cấy, phôi dinh dƣỡng nhị bội phát triển mạnh
hơn hạt phấn tách rời dẫn đến kết quả là mô sẹo nhị bội chiếm ƣu thế so với
mô sẹo đơn bội.
Để loại bỏ các nhân tố cạnh tranh đối với sự phát triển của hạt phấn,
các nhà nghiên cứu đã tiến hành nuôi phấn hạt phấn sau khi đã tách rời khỏi
mô túi phấn. Song kết quả đạt đƣợc vẫn còn rát khiêm tốn. Thực tế cho thấy
tỷ lệ mô sẹo hình thành thấp, sức tái sinh cây từ mô sẹo cũng không cao.
Cũng trong thời gian này, các tác giả đã thử nghiệm nuôi cấy bao phấn
lúa trong môi trƣờng lỏng và rút ra kết luân:
+ Môi trƣờng lỏng thuận lợi cho sự hấp thu dinh dƣỡng hơn môi trƣờng rắn.
+ Các chất độc do hạt phấn chết tạo ra không có tác động xấu tới các
hạt phấn khác bởi vì nó đã bị khuyếch tán vào môi trƣờng lỏng.
Năm 1994, Viện di truyền nông nghiệp công bố quá trình nuôi cấy bao
phấn, nâng cao tỉ lệ tạo mô sẹo và khả năng tái sinh của cây đơn bội (Nguyễn
Văn Đồng, Vũ Đức Quang, Phạm Ngọc Lƣơng, Trần Duy Quý 1994).
Từ năm 1994 – 2001, đã có công trình nghiên cứu nuôi cấy bao phấn
lúa mới để chọn tạo nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ phát triển lúa lai đựơc
công bố (Viện di truyền nồng nghiệp 1997 - 2000).
Các nhà khoa học Việt Nam đã đạt đƣợc một số thành tựu có ý nghĩa to
lớn trong sản suất. Tại viện Di Truyền Nông nghiệp, phƣơng pháp nuôi cấy

1.3.1. Tính toàn năng của tế bào
Haberlandt (1902) là ngƣời đầu tiên đề xuất phƣơng pháp nuôi cấy mô
và tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào.
Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả
năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy rằng,
mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình
phân bào nguyên nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ
chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một
cơ thể hoàn chỉnh. [11]
Miller và Skoog (1956) đã tạo chồi thành công từ mô thuốc lá nuôi cấy,
chứng minh đƣợc tính toàn năng của tế bào. Thành công trên đã tạo ra công
nghệ mới: Công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống
cây trồng và dòng chống chịu.
Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận
của phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay, con ngƣời đã
hoàn toàn chứng minh đƣợc khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh
từ một tế bào riêng rẽ.
1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào
Cơ thể thực vật trƣởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm
nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau.
Mỗi tế bào khác nhau sẽ thực hiện một chức năng cụ thể khác nhau
Song, mọi tế bào đều đƣợc tạo thành từ tế bào phôi sinh.[12]
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào
của mô chuyển hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá
trình phân hoá của tế bào có thể biểu thị nhƣ sau:

1.3.3. Cơ chế di truyền thông qua các hệ tế bào
Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào bao gồm các công đoạn:
Trong quá trình nguyên phân, từ một tế bào mẹ sẽ nhân đôi, tạo ra 2 tế bào
con giống nhau và giống tế bào mẹ ban đầu. Nhƣ vậy qua nguyên phân bộ
NST trong nội bộ từng cơ thể đƣợc diễn ra theo cơ chế nguyên phân, đây là
cơ chế phân bào mà từ một tế bào ban đầu sẽ phân chia thành hai tế bào con
có bộ NST giống bộ NST của tế bào mẹ đã truyền nguyên vẹn sang tế bào
con. Sở dĩ có hiện tƣợng này là do trƣớc mỗi lần giảm phân, mỗi phân tử
ADN đã thực hiện quá trình tái sinh để từ mỗi phân tử ADN hình thành 2
phân tử ADN giống nhau và giống ADN ban đầu. Quá trình này đƣợc thực
hiện ở kỳ trung gian và thông qua cơ chế phân ly đều của NST ở kỳ sau, là cơ
sở cho sự truyền nguyên vẹn thông tin di truyền trong nội bộ cơ thể.
Giữa 2 thế hệ cơ thể đƣợc hình thành thông qua cơ chế giảm phân đã
làm cho ở thế hệ đời sau có hiện tƣợng phân ly tính trạng, do bộ NST của thế
hệ sau không giống nhau và không giống bố mẹ. Vì vậy việc duy trì các tính
trạng mong muốn ở bố mẹ sang thế hệ sau bằng sinh sản hữu tính sẽ không Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
thể đảm bảo hoàn toàn chắc chắn. Đây là một trở ngại lớn trong sinh sản hữu
tính. Ngày nay bằng phƣơng pháp sinh sản vô tính, ngƣời ta đã khắc phục
đƣợc nhƣợc điểm này. Đặc biệt là nhân giống vô tính in vitro.
Dựa trên cơ chế nguyên phân, trong nhân giống invitro khi lấy các bộ
phận sinh dƣỡng trong một cây đem nhân giống thì các bộ phận đó có thông
tin di truyền giống nhau và tạo nên các cơ thể mới có thông tin di truyền
giống nhau và giống cơ thể mẹ. Nhƣ vậy nếu cơ thể mẹ có các tính trạng di
truyền tốt thì các tính trạng đó sẽ đƣợc thể hiện ở mọi cơ thể con cái. [9]
1.3.4. Môi trƣờng nuôi cấy (môi trƣờng dinh dƣỡng)
1.3.4.1. Khái niệm

* Môi trƣờng MS:
Các thành phần cơ bản của môi trƣờng MS (Murashige- skoog) [1]:
bao gồm:
- Các nguyên tố đa lượng:
Bao gồm: N, P, K, S, Mg, Ca,… thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ
30ppm. Thành phần, tỷ lệ của từng chất ở mỗi nuôi trƣờng nuôi cấy cụ thể là
khác nhau, môi trƣờng giàu nitro thích hợp cho việc hình thành chồi, môi
trƣờng giàu kali có tác dụng xúc tiến mạnh quá trình trao đổi chất
- Các nguyên tố vi lượng:
Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Bo, Co, I …là các nguyên tố vi lƣợng thƣờng
đƣợc dùng trong môi trƣờng nuôi cấy invitro. Các nguyên tố này đóng vai trò
rất quan trọng trong các hoạt động của Enzim.
Các nguyên tố vi lƣợng thƣờng đƣợc dùng ở nồng độ thấp hơn so với
các nguyên tốa đa lƣợng
- Nguồn cacbon
Mặc dù dƣới ánh sáng nhân tạo, cây Invitro có khả năng hình thành
diệp lục và quang hợp. Song, khả năng tổng hợp cacbon của chúng rất kém do
đó các mô thực vật sống theo phƣơng thức dị dƣỡng là chính. Các mô tế bào
sống nhờ nguồn cacbon lấy từ đƣờng trong môi trƣờng dinh dƣỡng. Có hai loại Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
17
đƣờng đƣợc sử dụng chủ yếu là sacarose và glucose với nồng độ thay đổi từ 20
– 40g/l tuỳ theo từng loài thực vật và mục đích nuôi cấy.
- Các vitamin
Trong quá trình nuôi cấy, cây invitro có thể tự tổng hợp đƣợc một số
vitamin cần thiết nhƣng chƣa đáp ứng đƣợc nhu cầu sinh trƣởng. Do đó ngƣời
ta thƣờng bổ sung một số vitamin nhóm B nhƣ: B1, B2, B3, B5, B6...ở nồng
độ 1mg/l; Dung dịch vitamin dễ bị hỏng do nấm, khuẩn nhiễm tạp và bị phân

Các Auxin thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô là:
+ 2,4 Dicloro phenoxy axetic axit (2,4 D);
+ α – Naphtylaxetic axit(α –NAA);
+ Indolaxit axetic ( IAA).
+ Indol butyric acid (IBA).
Riêng IAA là auxin tự nhiên còn NAA, IBA và 2.4D là các auxin nhân
tạo, auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên, do cấu trúc phân tử
khá bền vững nên auxin nhân tạo khó bị oxy hóa bởi các enzyme. Kinh
nghiệm sử dụng auxin trong nuôi cấy cho kết quả cao là sử dụng auxin với
nồng độ cao tại thời điểm ban đầu sau đó giảm dần để tránh tình trạng mô bị
“say” và nhiễm độc. Nồng độ auxin thƣờng dùng từ 0,001 – 10mg/l môi
trƣờng nuôi cấy.
- Cytokinin (hoormon phân bào):
Các hợp chất cytokinin kích thích sự phân bào và sự phân hoá chồi bất
định. Việc điều chỉnh tỷ lệ auxin/cytokinin trong môi trƣờng nuôi cấy quyết
định sự phân hóa tế bào theo hƣớng tạo mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ hay tạo phôi
soma. Có 3 loại cytokinin chính đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô là:
+ Kinetin: Kinetin đƣợc hình thành từ chế phẩm AND ở điều kiện nhiệt
độ cao. Trong cơ thể sống có thể không có kinetin tồn tại, sản phẩm này kích
thích sự tạo thành chồi mô nuôi cấy.
+ Zeatin: Tác dụng tƣơng tự kinetin nhƣng giá thành của zeatin khá
cao nên chỉ dùng trong những trƣờng hợp thật đặc biệt.
+ 6-Benzylaminopurine (BAP): Tác dụng của BAP giống kinetin
nhƣng hoạt tính của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bền vững hơn zeatin
ở nhiệt độ cao. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19
+ Nhóm xytokinin : Các chất thuộc nhóm xytokinin đang đƣợc sử dụng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
20
nuôi cấy sẽ bị chết. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết đến sự thành bại của
của nuôi cấy mô invitro [12].
Phƣơng pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các
chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn.
Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa
quyết định. Tuy vậy, nếu tìm đƣợc nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ
cho tỷ lệ sống cao, thông thƣờng hay sử dụng một số hóa chất nhƣ HgCl
2

0.1%, NaHCl 10%, nƣớc javen, cồn 760, clorox,…để khử trùng.
Phƣơng tiện khử trùng: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vô
trùng, phòng nuôi cây.
1.3.6. Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ
Ánh sáng và nhịêt độ là hai yếu tố chính có ảnh hƣởng cơ bản đến quá
trình sinh trƣởng của mô nuôi cấy [5]
1.3.6.1. Ánh sáng:
Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hƣởng từ các yếu tố
nhƣ: thời gian chiếu sáng, cƣờng độ ánh sáng và chất lƣợng ánh sáng.Thời
gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian
chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12 – 18 h/ngày.
Cƣờng độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi
cấy. Theo Ammirato (1986): cƣờng độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trƣởng
của mô sẹo. ngƣợc lại, cƣờng độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn
chung cƣờng độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000 lux
(Morein, 1974), ngoài ra chất lƣợng ánh sáng cũng ảnh hƣởng tới sự phát sinh
hình thái của mô thực vật invitro: ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân

quả nuôi cấy. Nuôi cấy bao phấn của các giống lúa thuộc loài phụ Japonica
(kể cả trƣờng hợp không xử lý lạnh trƣớc) đều đạt tỷ lệ thành cây thƣờng cao
hơn nuôi cấy bao phấn của các giống lúa thuộc loài phụ Indica. Chen và Lin
(1981) còn thấy rằng tỷ lệ bao phấn tạo callus, khả năng callus tái sinh thành
cây, tỷ lệ cây xanh/cây bạch tạng và số lƣợng nhiễm sắc thể của cây tái sinh
đều liên quan đến kiểu gen của cây cho bao phấn. Điều này chứng tỏ khả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22
năng nuôi cấy bao phấn lúa cũng do gen điều khiển, đối với những giống
phản ứng tốt có thể chứa nhiều gen tác động lên quá trình này.
Để tăng hiệu quả nuôi cấy có thể bằng cách lai tạo nhằm cải tiến giống.
Ví dụ : ở khoai tây kiểu gen phản ứng tốt có thể thu đƣợc bằng cách lai giữa
kiểu gen phản ứng kém với kiểu gen phản ứng tốt.
Phải thay đổi điều kiện và môi trƣờng nuôi cấy cho từng loại cây trồng
thậm chí cho từng giống cây trong cùng một loài.
1.3.8.2. Giai đoạn phát triển của bao phấn
Giai đoạn phát triển của bao phấn tại thời điểm tách rời ra và nuôi cấy
cũng có ảnh hƣởng rất quan trọng đến kết quả nuôi cấy. Đối với lúa giai đoạn
phản ứng tốt nhất là trƣớc và giữa giai đoạn hạt phấn một nhân trong điều kiện
nồng độ đƣờng trong môi trƣờng nuôi cấy tăng từ 6% đến 9% (Chen, 1978).
Các tác giả Oono (1975), Lin (1976) và Chen (1977) cho thấy: Mẫu
bao phấn đƣợc lấy vào thời điểm các tiểu bào tử trong bao phấn đang ở giai
đoạn đơn bào muộn là tốt nhất. Bao phấn ở giai đoạn tứ thể không có khả
năng phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy invitro. Bao phấn ở giai đoạn đơn
bào sớm phát triển kém. Hạt phấn chỉ có thể phát triển tốt khi đã tách ra khỏi
tứ tử (giai đoạn đơn bào giữa đến đơn bào muộn).
1.3.8.3. Điều kiện sinh lý của cây cho bao phấn
Chen và Lin (1976), Chen và Tsay (1984) cho rằng bao phấn nào đƣợc