Chương 7

Nuôi cấy tế bào thực vật

I. Mở đầu
Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất hóa học khác nhau rất có giá
trị, chẳng hạn các chất dùng làm dược liệu, các chất tạo mùi, các chất dùng
làm gia vị, các sắc tố và các hóa chất dùng trong nông nghiệp (Bảng 7.1).
Những sản phẩm này, được biết như là các chất trao đổi thứ cấp (secondary
metabolites), thường được sản xuất với một lượng rất nhỏ (dạng vết) trong
thực vật và không có chức nă
ng trao đổi chất rõ ràng
1
. Chúng dường như là
sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường chung
quanh, là sự thích nghi với stress của môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học
chống lại vi sinh vật và động vật.
Mặc dù, hóa học tổng hợp hữu cơ đạt nhiều thành tựu quan trọng
nhưng nhiều hợp chất trao đổi thứ cấp (thường gọi là các chất thứ
cấp) vẫn
còn khó tổng hợp hoặc có thể tổng hợp được nhưng chi phí rất đắt. Chẳng
hạn, một số hỗn hợp phức tạp như tinh dầu hoa hồng là không thể tổng hợp
hóa học được. Để sản xuất các sản phẩm thứ cấp từ thực vật, các mô thực
vật ngoại sinh (chẳng hạn từ cây hoàn chỉnh) có thể được sử d
ụng để nuôi
cấy tế bào dịch huyền phù (cell suspension culture) trong điều kiện vô trùng.
Cơ sở khoa học của kỹ thuật này là dựa trên tính toàn thể hóa sinh
(biochemical totipotency) duy nhất của tế bào thực vật.
Nuôi cấy tế bào thực vật trong điều kiện in vitro để sản xuất các chất
thứ cấp có một số ưu điểm sau:
- Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong các đ

Các chất khác Ginsengoside, shikonin, ubiquinone-10,
rosmarinic acid, diosgenin, L-Dopa,
saponin
Các protein tái
tổ hợp
Kháng thể đơn dòng, các interleukin,
GM-CSF, các enzyme khác
Nông nghiệp Hóa chất Pyrethrin, rotenone, neriifolin, salannin,
azadirachtin, các hóa chất alleopathic

- Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm bằng cách
loại bỏ các trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của
nguyên liệu thô, sự đồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá
trình vận chuyển và bảo quản.
- Một số sản phẩm trao đổi chất được sản xuất từ nuôi cấy dị
ch huyền
phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh.
Thách thức lớn nhất đối với công nghệ tế bào thực vật là sự ổn định
cho phép nuôi cấy tế bào thực vật trên quy mô lớn và đạt hiệu suất tối đa
Công nghệ tế bào
101
cho sự tích lũy và sản xuất các chất thứ cấp. Điều này có thể thực hiện bằng
cách chọn lọc các kiểu gen thích hợp và các dòng tế bào có sản lượng cao,
xây dựng các công thức môi trường dinh dưỡng hợp lý để nuôi cấy tế bào,
thiết kế và vận hành các hệ thống nuôi cấy tế bào (bioreactor) hiệu quả.
Chúng ta cũng có thể sử dụng kinh nghiệm và kiến thức có được từ nuôi cấy
vi sinh vật để áp dụng cho nuôi cấy tế bào thực vật. Tuy nhiên, tế bào thực
vật và vi sinh vật có một số đặc điểm khác nhau, vì thế cần phải cải tiến và
điều chỉnh các điều kiện nuôi cấy cũng như cấu hình của nồi phản ứng
(reactor) để tìm được các yêu cầu đặc thù của nuôi cấy tế bào thực vật.

A
Công nghệ tế bào
102 Chloroplast
Thành tế bào
Tế bào chất
Màn
g tế bào
Khôn
g bào
Lưới nội sinh chất
Ribosome
Ty thể
Nhân
Bộ máy Gol
gi

Hình 7.1. Minh họa một tế bào thực vật.

Không bào (vacuole) có vai trò tiếp nhận các chất thải của sự trao đổi
chất hoặc các chất thứ cấp của thực vật. Ở các tế bào non không bào thường
nhỏ và nhiều. Khi tế bào lớn dần và già hơn thì không bào cũng mở rộng lên
và kết thành một khối. Ở các tế bào thực vật trưởng thành, không bào có thể
chiếm tới 90% thể tích tế bào. Không bào được bọc chung quanh bởi màng
huyết tương (plasma). Thành phần chính của các không bào lớ
n là nước
chứa các chất hòa tan như các ion vô cơ, các amino acid, các acid hữu cơ,
các sắc tố hòa tan trong nước (anthocyanin) và các chất không hòa tan ở

định tăng lên từ sinh trưởng không phân hóa của mẫu vật trên môi trường
dinh dưỡng rắn vô trùng (Hình 7.2). Mẫu vật thường là các cơ quan tử nhỏ
hoặc các mẫu mô. Các khối tế bào này không tương ứng với mọi cấu trúc
mô đặc trưng của cây hoàn chỉnh. Thuật ngữ nuôi cấ
y callus được sử dụng
do sự phân chia vô tổ chức của tế bào mà lúc đầu được nghĩ là nó cảm ứng
với sự tổn thương thực thể của thực vật trong quá trình tách ra khỏi cây
hoàn chỉnh. Tuy nhiên, sau đó người ta nhận thấy nó được được cảm ứng
bởi các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (plant growth regulators) trong
môi trường dinh dưỡng rắn.

Hình 7.2. Nuôi cấy callus. Công nghệ tế bào
104
1.2. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào
Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào chứa các tế bào và các khối tế bào,
sinh trưởng phân tán trong môi trường lỏng (Hình 7.3 và 7.4). Thường được
khởi đầu bằng cách đặt các khối mô callus dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng
chuyển động (lắc hoặc khuấy). Nuôi cấy dịch huyền phù vì thế là sự tiến
triển từ thực vật đến mẫu vật, tới callus, và cuối cùng tớ
i dịch huyền phù.
Nuôi cấy dịch huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối của tế
bào thực vật so với nuôi cấy callus, do nuôi cấy dịch huyền phù có thể duy
trì và được thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật được ngập
chìm trong môi trường lỏng.

1.3. Nuôi cấy tế bào trần
Nuôi cấy tế bào trần (protoplast) đòi hỏi sự sinh trưởng của protoplast

B Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thực vật
Bơm khí vô trùng,
khôn
g khí ẩm
B
ình thu
Bơm nhu
động nhiều kênh
Bioreactor
đư
ợc lắc liên tục
B
ình cơ chất
Máy lắc

Hình 7.3. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thực vật trên máy lắc. A: Nuôi trong
bình tam giác có lắc để chuẩn bị tế bào. B: Nuôi trong hệ lên men lắc để sản xuất
sinh khối.

Hình 7.4. Hệ lên men có cánh
khuấy (bình nuôi 5 L) dùng để

cho phép bỏ qua nhưng trong một số trường hợp đặc biệt thì có thể dùng),
và các phụ gia hữu cơ không xác định khác (malt, dịch chiết nấm men, dịch
thủy phân casein, nước dừa…).
- Các chất kích thích sinh trưởng thực vật. Thành phần phụ gia
quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều hòa sinh
Công nghệ tế bào
107
trưởng. Các auxin (IAA
2
và các dạng tương tự được tổng hợp nhân tạo như
2,4-D
3
, NAA
4
, IBA
5
, NOA
6
…), và các cytokinin (zeatin, 2i-P
7
và các dạng
tương tự được tổng hợp nhân tạo như kinetin, BA
8
…) là những nhóm chất
kích thích sinh trưởng và phát sinh hình thái chủ yếu trong nuôi cấy mô và
cơ quan của thực vật.
- Nguồn carbon. Thường sử dụng sucrose làm nguồn carbon thay cho
nguồn carbon được thực vật cố định từ khí quyển bằng quang hợp. Trong đa
số các thí nghiệm nuôi cấy, tế bào thực vật đã mất khả năng quang hợp.
Glucose cũng thường được đưa vào môi trường và cho hiệu quả tương

IBA: indole-3-butyric acid
6
NOA: 2-naphthoxyacetic acid
7
2-iP: 6-(γ,γ-dimethylallylamino)purine
8
BA: N
6
-benzyladenine hay 6-benzylaminopurine (BAP)
9
Tên alkaloid có nghĩa là giống như kiềm (alkali)

Công nghệ tế bào
108