Chương 8

Công nghệ DNA tái tổ hợp

Công cụ chính trong công nghệ sinh học hiện đại là công nghệ DNA
tái tổ hợp
1
hay còn gọi là kỹ thuật di truyền. Công nghệ này cho phép thao
tác trực tiếp trên các nguyên liệu di truyền của các tế bào riêng biệt. Bằng
cách đưa các thông tin di truyền ngoại lai vào trong các cơ thể vi sinh vật,
các tế bào động vật và thực vật sinh trưởng nhanh, chúng ta có thể sản xuất
ra các sản phẩm của gen ngoại lai (các protein) với các tốc độ và hiệu suất
cao hơn mà thường không thể thực hiện ở các hệ thống tế bào khác.
Chương này trình bày những nét chính của các nguyên lý cơ bản trong
kỹ thuật di truyền và các vấn đề liên quan đến nuôi cấy tế bào đã được
chuyển gen ngoại lai.

I. DNA và RNA
Deoxyribonucleotide acid (DNA) là phân tử quan trọng nhất trong các
tế bào sống và chứa tất cả thông tin đặc trưng của tế bào. DNA và
ribonucleotide acid (RNA) là các đại phân tử
2
polymer mạch thẳng được
xây dựng trên các tiểu đơn vị riêng rẽ là các nucleotides. Một đơn vị
monomer (nucleotide) có ba thành phần sau (Hình 8.1):
- Đường năm carbon mạch vòng (pentose): deoxyribose cho DNA và
ribose cho RNA.
- Một nitrogen base của dẫn xuất hoặc purine hoặc pyrimidine liên kết
đồng hóa trị với nguyên tử carbon thứ nhất của đường bằng liên kết kết N-
glycoside (Hình 8.1).
+ Purine: adenine (A), guanine (G).

đặc trưng và một vùng không đặc trưng. Các nhóm đường và phosphate là
phần không đặc trưng của nucleotide, trong khi các base purine và
pyrimidine tạo nên phần đặc trưng của nucleotide.
Một nucleotide này sẽ được kết hợp với các nucleotide khác bằng một
liên kết hóa học giữa các nguyên tử trong các vùng không đặc trưng tạo ra
các polynucleotide (Hình 8.2). Sự liên kết (được gọi là các liên kết
phosphodiester) xảy ra giữa một nhóm phosphate và một nhóm OH trên
thành phần đường.
Điểm đặc trưng nhất của DNA là nó thường bao gồm hai sợi bổ sung
xoắn gần như song song xung quanh một trục chung tạo thành một xoắn kép
(double helix) tương tự như một cầu thang xoắn ốc (Hình 8.3). Mỗi sợi là
một polynucleotide. Đường kính của xoắn (chiều ngang bậc thang) khoảng
Công nghệ tế bào
124
20 , Chiều cao của mỗi vòng xoắn là 34 , gồm 10 bậc thang nghĩa là mỗi
vòng xoắn có 10 nucleotide trên mỗi sợi.
o
A
o
A

đầu 5’

đầu 3’

Hình 8.2. Một phần của DNA.

Hai sợi được kết hợp bằng liên kết hydrogen giữa các cặp base purine
với pyrimidine
3

A3,4
Rãnh nhỏ

34

o
A
5’
3’
Trục đường-phosphate
Rãnh
chính
5’
3
’
Cặpbase ni
tơ

3,4

o
A
Trục giữa

Hình 8.3. Mô hình xoắn kép của phân tử DNA.

Trình tự của các base (A, G, T và C) trong một sợi DNA đặc trưng
cho một trình tự của các amino acid sẽ được lắp ráp để tạo thành một phân
tử protein. Mã di truyền là tập hợp các trình tự base tương ứng cho mỗi
amino acid (codon). Vì chỉ có 4 base trong DNA và 20 amino acid trong

U Phe Ser Tyr Cys U
U Phe Ser Tyr Cys C
U Leu Ser STOP STOP A
U Leu Ser STOP Trp G
C Leu Pro His Arg U
C Leu Pro His Arg C
C Leu Pro Gln Arg A
C Leu Pro Gln Arg G
A Ile Thr Asn Ser U
A Ile Thr Asn Ser C
A Ile Thr Lys Arg A
A Met Thr Lys Arg G
G Val Ala Asp Gly U
G Val Ala Asp Gly C
G Val Ala Glu Gly A
G Val Ala Glu Gly G

II. Tạo dòng gen
Tạo dòng một gen là công việc trung tâm của công nghệ DNA tái tổ
hợp. Gen là đơn vị cơ sở của thông tin di truyền nằm trên nhiễm sắc thể của
tế bào. Các nhiễm sắc thể là các cấu trúc sợi dài và mảnh nằm ở trong nhân,
bao gồm chủ yếu là DNA. Thông tin di truyền được bảo quản trong một
chuỗi trình tự của các base nucleotide, gồm có một đoạn DNA. Mỗi gen ghi
rõ cấu trúc của một sản phẩ
m gen đặc biệt, thường là một protein.

1. Các trình tự DNA
Để thao tác gen, cần phải biết về tất cả các tổ chức của các trình tự
DNA và các đơn vị chức năng của DNA tương tác với các các đơn vị khác
trong tất cả các đơn vị di truyền của cơ thể (genome) là như thế nào. Việc
T G G C C A
A
C C G G T
T G G C C A
A C C G G T
T G G C C A
A C C G G T

(a) (b)

Hình 8.4. Hai kiểu cắt của enzyme hạn chế.
(a) tạo ra đầu bằng, và (b) tạo ra đầu so le

Vì một enzyme hạn chế nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số vị
trí cắt trên một phân tử DNA đặc biệt thường là nhỏ. Các đoạn DNA được
cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách theo kích thước bằng điện di
agarose gel để nghiên cứu. Do sự tương tự của tổ chức phân tử trong tất cả
Công nghệ tế bào
128
các cơ thể, cho nên DNA vi khuẩn, DNA thực vật và DNA động vật có vú
tương hợp nhau về cấu trúc. Vì thế, một đoạn DNA từ một dạng sống này có
thể dễ dàng được pha trộn với DNA của một dạng sống khác. Sự tương tự
này cũng phù hợp đối với plasmid, nhân tố di truyền ngoài nhân được tìm
thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Chúng là những phân tử DNA
mạch vòng đóng sợi đôi đượ
c dùng làm vector mang các đoạn DNA ngoại
lai dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp.


6

Chất tẩy làm biến đổi bề mặt tế bào để giải phóng các thành phần tế bào ra môi
trường bên ngoài.

Công nghệ tế bào
129
Plasmid chứa các gen mã hóa cho các enzyme thường có lợi cho vi
khuẩn vật chủ. Các plasmid mang các kiểu hình khác nhau như: kháng
kháng sinh, sản xuất kháng sinh, phân hủy các hợp chất hữu cơ phức tạp,
sản xuất các enzyme hạn chế và enzyme biến đổi (modification enzymes).
Các plasmid có thể được chuyển vào trong vi khuẩn sau khi vi khuẩn
được xử lý sao cho tế bào có thể thấm qua nhất thời các phân tử DNA nhỏ.
Quá trình này được biết như là sự biến nạp (transformation). Vi khuẩn được
biến nạp thành công có th
ể được chọn lọc dựa trên kiểu hình mới mà chúng
nhận được từ plasmid, chẳng hạn khả năng kháng các kháng sinh.
Một số plasmid hiện diện trong tế bào có số bản sao thấp (một hoặc
một vài bản sao trên tế bào) do DNA plasmid chỉ sao chép một hoặc hai lần
trước khi tế bào phân chia. Tuy nhiên, các plasmid khác tồn tại một số bản
sao lớn hơn (10 tới 100 bản sao trên một tế bào) do DNA tái bản lặp lại cho
đến khi
đạt được số bản sao thích hợp. Các plasmid có số bản sao lớn được
gọi là plasmid tái bản dạng lỏng lẽo (relaxed plasmid), và đây là một trong
những tính chất hữu ích của vector tạo dòng.
Hình 8.5 trình bày một trong các vector plasmid dạng lỏng lẽo,
pBR322 (thế hệ thứ hai), dài 4.363 bp, vector này chứa hai gen kháng kháng
sinh là Ampicillin (Amp) và Tetracycline (Tet). Số thứ tự của các nucleotide
trên vector được bắt đầu với vị trí EcoRI duy nhất: T đầu tiên trong chuỗi
GAATTC được quy ước là nucleotide thứ nhất. Các số


Hình 8.6. trình bày toàn bộ phương thức sản xuất DNA tái tổ hợp (tạo
dòng gen). Plasmid được cắt ở các vị trí xác định bằng enzyme hạn chế.
DNA của một genome ngoại lai được cắt cùng một loại enzyme, một số
đoạn trong đó có thể có gen quan tâm. Plasmid và các đoạn của genome
được phối trộn và kết hợp nhờ enzyme ligase. Các plasmid tái tổ hợp được
biến nạp vào vi khuẩn bằng đồng nuôi cấy plasmid và vi khuẩn.

III. Khả năng ổn định của các vi sinh vật tái tổ hợp
Khi các vi sinh vật tái tổ hợp được nuôi cấy để sản xuất protein tái tổ
hợp, thì hiệu suất của sản phẩm protein có thể bị giảm do sự tổn thất của
plasmid trong cơ thể khi chúng trải qua nhiều lần sinh sản trong quá trình
sinh trưởng của vi sinh vật. Khả năng mất ổn định có thể do: (1) Sự phân
chia khiếm khuyết của plasmid trong quá trình phân chia của tế bào, hoặc
(2) Mất khả năng ổ
n định cấu trúc tạo ra các đột biến của DNA plasmid.
Công nghệ tế bào
131
Để ổn định sự phân chia của plasmid, các tế bào cần được sao chép
sao cho số lượng trung bình của các bản sao plasmid trên một tế bào được
nhân gấp đôi chỉ trong một thế hệ, và các bản sao plasmid cần được phân
phối bằng nhau tới các tế bào con khi phân chia tế bào. Một số kết quả
nghiên cứu cho thấy sự không ổn định của plasmid đã được phát hiện trong
các hệ thống cơ thể vật chủ nh
ư: E. coli, Bacillus subtilis cũng như nấm
men.

Gắn DNA
DNA được
tạodòng
Hình 8.6. Phương thức cơ bản để tạo dòng gen.

Một bộ phận các tế bào mang plasmid trong quần thể tổng số được
xem như là một hàm số lượng các thế hệ sinh trưởng. Vì thế, khi thể tích của
hệ lên men tăng lên thì số lượng các thế hệ sinh trưởng (generation of
Công nghệ tế bào
132
growth) cũng tăng, nhưng một bộ phận các tế bào mang plasmid và hiệu
suất sản phẩm lại giảm. Sự không ổn định của plasmid sẽ tiếp tục nếu hệ lên
men quy mô lớn được hoạt động liên tục.

1. Động học lên men của các nuôi cấy tái tổ hợp
Nếu gọi xác suất để các tế bào mang plasmid
sản sinh ra các tế
bào không mang plasmid sau một lần phân chia là p. Khi ấy với N tế
bào mang plasmid, sau một lần phân chia sẽ sản sinh ra N(1-p) tế bào mang
plasmid và Np tế bào không mang plasmid.
)(
+

+
µ
+
X
C
+
X
C
Mặt khác, tốc độ sinh trưởng của các tế bào không mang plasmid sẽ là:
−+
−
−+
+=
XX
X
CCp
dt
dC
µµ

(8.2)
Trong đó: là tốc độ sinh trưởng đặc trưng của các tế bào không có
plasmid, và
số lượng các tế bào không mang plasmid trên một đơn vị
thể tích.
−
µ
−
X
C