Chương 2

Sinh trưởng và bất động của tế bào

I. Xác định sinh trưởng của tế bào
Trong các hệ thống sinh học, mọi sự sinh trưởng đều có thể được định
nghĩa là sự tăng tuần tự của các thành phần hóa học. Tăng đơn thuần khối
lượng không thể phản ánh đầy đủ sự sinh trưởng, do tế bào có thể chỉ tăng
hàm lượng các sản phẩm dự trữ của chúng như là glycogen, poly-β-
hydroxybutyrite. Sự sinh trưởng cân bằng (balanced growth) được định
nghĩa là sự
sinh trưởng mà trong suốt quá trình đó sự nhân đôi sinh khối xảy
ra cùng với sự nhân đôi của tất cả các đặc tính xác định khác của quần thể
như là protein, DNA, RNA và nước nội bào. Mặt khác, quá trình nuôi cấy
trải qua sự sinh trưởng cân bằng duy trì một thành phần hóa học không đổi.
Trong một môi trường dinh dưỡng thích hợp mà sau đó tế bào sẽ trở nên
thích nghi thì nó sẽ ở trong trạng thái sinh trưởng cân bằng.
Tiếp theo quá trình sinh trưởng, cần phải xác định số lượng tế bào. Sự
sinh trưởng của tế bào có thể được xác định bằng số lượng tế bào, sinh khối
tế bào hoặc hoạt tính tế bào.

1. Xác định số lượng tế bào
1.1. Đếm bằng kính hiển vi
Số lượng tế bào trong quần lạc có thể được đếm dưới kính hiển vi
bằng cách đếm các tế bào được đưa vào trong một buồng đếm đặc biệt. Có
hai loại buồng đếm được dùng để đếm số lượng tế bào trong một mẫu dịch
lỏng:
- Haemocytomete. Buồng đếm tế bào máu dùng cho những tế bào có
đường kính ≥ 3 µm (Hình 2.1).
- Petroff-Hausser counting chamber. Buồng đếm Petroff-Hausser

Hình 2.1. Buồng đếm haemocytometer.

Một số nhược điểm của phương pháp đếm trực tiếp:
- Thường rất khó phân biệt các tế bào chết và tế bào sống.
- Không thích hợp cho các dịch huyền phù có mật độ thấp.
- Các tế bào có kích thước nhỏ thường khó quan sát dưới kính hiển vi
và có thể không thấy khi đếm.
- Phương pháp đếm thực tế gây mỏi mệt và nhầm lẫn trong quá trình
đếm.
- Không thích hợp đối với các tế bào xếp thành cụm như là mycelium
(thể sợi nấm).

1.2. Đếm các tế bào phát triển trên đĩa nuôi cấy (petri dish)
Các tế bào phát triển được định nghĩa là tế bào có thể phân chia và tạo
ra khuẩn lạc. Có hai cách để thực hiện phương pháp đếm trên đĩa petri:
phương pháp đĩa trải (spread plate) và phương pháp đĩa rót (pour plate).
Với phương pháp đĩa trải, một thể tích nhỏ hơn 100 µL được trải khắp
bề mặt agar. Với phương pháp đĩa rót, mẫu vật được trộn với agar nóng
Công nghệ tế bào
12

chảy (đã để nguội đến khoảng 60
o
C) và được rót trên đĩa vô trùng. Các đĩa
sau đó được nuôi cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc, và số lượng khuẩn lạc
được đếm trực tiếp. Điều quan trọng là số lượng các khuẩn lạc phát triển
trên đĩa phải không quá lớn hoặc không quá nhỏ. Để thu được một số lượng
tế bào thích hợp trên một đơn vị diện tích thì mẫu vật phải được pha loãng.
Trường hợp cần pha loãng nhiều, người ta thường sử dụng kỹ thuật pha
loãng tuần tự (serial dilution). Ví dụ: để thực hiện pha loãng 1/10

một cách tương xứng, trong các giới hạn nhất định, tới nồng độ của chúng.
Khi tia sáng xuyên qua dịch huyền phù của tế bào, thì lượng ánh sáng truyền
Công nghệ tế bào
13

qua bị giảm đi do kết quả của sự tán xạ, như vậy đó chính là phương pháp
xác định mật độ tế bào.
Việc đo độ đục của dịch huyền phù tế bào thường được thực hiện trên
máy quang phổ để đọc các đơn vị hấp thụ (A). Khả năng hấp thụ
(absorbency) được định nghĩa là số logarithm của tỷ lệ giữa cường độ ánh
sáng va chạm vào dịch huyền phù tế bào (I
o
) và cường độ ánh sáng được
truyền qua bởi dịch huyền phù (I):
I
I
A
o
log=

Đường cong chuẩn (standard curve) có thể thu được bằng cách đo độ
hấp thụ (A) của mẫu với nồng độ tế bào đã biết trước. Việc đo thường được
thực hiện ở bước sóng từ 600-700 nm.

3. Các phương pháp gián tiếp
Phương pháp gián tiếp để xác định sinh khối tế bào dựa trên phép tính
hệ số tỷ lượng toàn phần (overall stoichiometry) cho sự sinh trưởng và tạo
thành sản phẩm, có thể
được trình bày trong một dạng chung như sau:


thế, không được kết hợp với sự sinh trưởng. Sự giải phóng CO
2
có thể được
xác định và nó có quan hệ tỷ lượng đối với sự sinh trưởng của tế bào. Một
sản phẩm hoàn toàn chung cho mọi phản ứng lên men là ion H
+
. Lượng
kiềm bổ sung vào dịch lên men sẽ duy trì độ pH thích hợp cho sinh trưởng.

3.3. Các thành phần tế bào
Đối với các nuôi cấy trải qua sự sinh trưởng cân bằng, thì các thành
phần tế bào thuộc nhóm đại phân tử như là protein, RNA và DNA có thể
được xác định thay cho sinh khối tế bào. Tuy nhiên, cần phải thận trọng do
tỷ lệ của những nguyên liệu này trong tế bào có thể thay đổi theo thời gian
nếu nuôi cấy không trải qua sự sinh trưởng cân bằng.

3.4. Giải phóng nhiệt
Sự sinh trưởng của tế bào phát ra nhiệt. Lượng nhiệt phát ra tùy thuộc
vào hiệu suất sử dụng năng lượng carbon. Vì thế, việc xác định nhiệt độ của
hệ lên men có thể kết hợp gián tiếp với sự sinh trưởng của tế bào. Tuy
nhiên, lượng nhiệt toàn phần tích lũy trong hệ lên men phụ thuộc vào hiệu
quả phối hợp của các nguồn sinh nhiệt và mất nhi
ệt khác nhau như: nhiệt từ
quá trình khuấy và bay hơi, nhiệt tiêu hao xung quanh thành của hệ lên men
và nhiệt nhạy (sensible heat) trong luồng không khí. Vì thế, để xác định sinh
trưởng bằng sự giải phóng nhiệt, cần phải thiết lập cân bằng năng lượng của
hệ lên men mặc dù đây một công việc không dễ dàng.

3.5. Độ nhớt
Sinh trưởng của cơ thể hệ sợi (nấm) hoặc sự tạo thành polysaccharide