Chương 6

Nuôi cấy tế bào động vật

I. Mở đầu
Tế bào động vật tách từ mô có thể được nuôi cấy trên các loại môi
trường dinh dưỡng tổng hợp bên ngoài cơ thể, chúng sinh trưởng bằng cách
tăng số lượng và kích thước tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đã tạo
cơ hội để nghiên cứu các tế bào ung thư, phân loại các khối u ác tính, mô
hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất, xác định sự tương hợp
của mô trong cấy ghép và nghiên cứu các tế bào đặc biệt cùng sự tương tác
của chúng.
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật có vú có thể được ứng dụng để sản
xuất các hợp chất hóa sinh quan trọng dùng trong chẩn đoán như các
hormone sinh trưởng của người, interferon, hoạt tố plasminogen mô, các
viral vaccine và các kháng thể đơn dòng. Theo phương pháp truyền thống
các hợp chất hóa sinh này được sản xuất bằng cách sử dụng các động v
ật
sống hoặc được tách chiết từ xác người chết. Chẳng hạn, các kháng thể đơn
dòng có thể được sản xuất bằng cách nuôi cấy các tế bào hybridoma trong
các khoang màng bụng (peritoneal cavity) của chuột, hoặc hormone sinh
trưởng dùng để chữa bệnh còi (dwarfism) có thể được tách chiết từ xác
người chết. Tuy nhiên, số lượng thu được từ các phương pháp này rất hạn
chế vì thế việc ứng dụng rộng rãi chúng trong đ
iều trị còn gặp nhiều khó
khăn.
Một vài sản phẩm gen của động vật có vú cũng có thể được sản xuất
bởi hệ thống vi khuẩn bằng cách dùng công nghệ DNA tái tổ hợp. Tốc độ
sinh trưởng nhanh, thành phần môi trường đơn giản và rẻ tiền của nuôi cấy
tế bào vi khuẩn khiến chúng có nhiều ưu điểm hơn so với nuôi cấy tế bào
động vậ

nghiên cứu độc chất học và dược học.
- Phát triển công nghệ mô hoặc phát sinh cơ quan để sản xuất các cơ
quan thay thế nhân tạo-sinh học/các dụng cụ trợ giúp, chẳng hạn:
+ Da nhân tạo để chửa bỏng.
+ Mô gan để chữa bệnh viêm gan.
+ Đảo Langerhans để chữa bệnh tiểu đường.

2. Một số hạn chế của nuôi c
ấy tế bào động vật
Mặc dù tiềm năng ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật là rất lớn,
nhưng việc nuôi cấy một số lượng lớn tế bào động vật thường gặp các khó
khăn sau:
- Các tế bào động vật có kích thước lớn hơn và cấu trúc phức tạp hơn
các tế bào vi sinh vật.
Công nghệ tế bào
78
Bảng 6.1. Các sản phẩm của nuôi cấy tế bào động vật.

Enzyme Urokinase, hoạt tố plasminogen mô
(t-PA)
1
T
Hormone Hormone sinh trưởng (GH)
2Nhóm I
Các nhân tố sinh trưởng Các cytokine khác
Nhóm II Vaccine
3

Vaccine: kháng nguyên đã làm mất khả năng gây bệnh nhưng còn giữ khả năng
sinh kháng thể để tiêm chủng gây miễn dịch phòng bệnh. Vaccine có thể gồm một
độc tố không hoạt động hoặc một chất không độc bằng cách sử dụng các vi khuẩn
hoặc virus đã chết hoặc giảm độc. Có nhiều cách tiêm chủng: dưới da, xuyên da,
tiêm bắp, gây sẹo hoặc uống qua đường miệng.
Công nghệ tế bào
79
- Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một
cách đầy đủ, và môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết thanh
máu rất đắt tiền.
- Tế bào động vật là một phần của mô đã được tổ chức (phân hóa) hơn
là một cơ thể đơn bào riêng biệt như vi sinh vật.
- Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên một bề
mặt.

II. Tế bào động vật
Các tế bào động vật là tế bào eukaryote, chúng được liên kết với nhau
bởi các nguyên liệu gian bào để tạo thành mô. Mô động vật thường được
phân chia theo bốn nhóm: biểu mô (epithelium), mô liên kết (connective
tissue), mô cơ (muscle) và mô thần kinh (nerve). Biểu mô tạo thành lớp phủ
và lớp lót trên các bề mặt tự do của cơ thể, cả bên trong và bên ngoài. Ở mô
liên kết, các tế bào thường được bao bọc trong thể gian bào rộng (kéo dài),
đó có thể là chất lỏng, hơi rắn hoặc rắn. Các tế bào mô cơ thường thon dài
và được gắn với nhau thành một phiến hoặc một bó bởi mô liên kết. Mô cơ
chịu trách nhiệm cho hầu hết chuyển động ở động vật bậc cao. Các tế bào
mô thần kinh gồm có thân bào chứa nhân và một hoặc nhiều phần mở rộng
dài và mảnh được gọi là sợi. Các tế bào thần kinh được kích thích dễ dàng
và truyền xung động rất nhanh.

1. Các tế bào dịch huyề
Hình 6.1. Các tế bào động vật thường được sử dụng trong nuôi cấy.
(a) tế bào bạch huyết, (b) tế bào biểu mô, (c) nguyên bào sợi

Tỷ lệ diện tích/thể tích có thể được tăng lên khi các tế bào sinh trưởng
trên các giá thể là polymer bọt biển (spongy), thể gốm (ceramic), các sợi
rỗng, bao vi thể (microcapsule), hoặc trên các hạt nhỏ có kích thước hiển vi
gọi là microcarrier.

III. Môi trường nuôi cấy
Nhu cầu dinh dưỡng của các tế bào động vật có vú lớn hơn vi sinh vật
do, không giống các vi sinh vật, động vật không trao đổi chất nitrogen vô
cơ. Vì thế, nhiều amino acid và vitamin cần phải được bổ sung vào môi
trường. Môi trường đặc trưng dùng trong nuôi cấy tế bào động vật bao gồm
các amino acid, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trưởng, muối
khoáng và glucose. Ngoài ra, môi trường cần được cung cấp từ 2-20% (theo
thể tích) huyết tương của động vật có vú. Mặc dù huyết thanh có thành ph
ần
chưa được xác định đầy đủ, nhưng nhiều nghiên cứu đã cho thấy nó rất cần
thiết cho sự phát triển và tồn tại của tế bào trong nuôi cấy. Bảng 6.2 trình
Công nghệ tế bào
81
bày thành phần và hàm lượng của các chất trong môi trường Eagle (Eagle
1959), đây là một trong những môi trường được sử dụng phổ biến trong
nuôi cấy tế bào động vật.

Bảng 6.2. Thành phần môi trường Eagle (1959).

Thành phần Nồng độ

32
48
10
36
46 1000
5-10%
3. Vitamin
Choline
Folic acid
Inositiol
Nicotinamide
Pantothenate
Pyridoxal
Riboflavin
Thiamine

4. Muối
NaCl
KCl
CaCl
2
MgCl
2
.6H
2
O
NaH

huyết thanh chưa được xác định đầy đủ nên trong một số trường hợp có thể
ảnh hưởng xấu đến kết quả nuôi cấy. Sự hiện diện của nhiều protein khác
nhau trong huyết thanh cũng có thể làm phức tạp các quá trình phân tách và
Công nghệ tế bào
82
tinh sạch đầu ra. Vì lý do đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xây
dựng công thức môi trường không có huyết thanh. Những công thức này
chứa các hormone và các nhân tố sinh trưởng được tinh sạch để thay thế cho
huyết thanh.
Trước đây, huyết thanh của thai bò (fetal bovine serum-FBS), được bổ
sung ở nồng độ 1-20%, là rất cần thiết cho sự sinh sản của các tế bào động
vật có vú. Nhưng ngày nay, nhiều quá trình nuôi cấy tế bào ở quy mô l
ớn đã
bắt đầu thực hiện trong môi trường không có huyết thanh.

IV. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
Phương pháp chính trong nuôi cấy tế bào động vật có vú để sản xuất
các sản phẩm sinh-dược là dựa trên cơ sở nuôi cấy dịch huyền phù trong hệ
lên men. Từ lâu, hệ lên men đã được sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và
nấm men. Đầu tiên, sự lên men là thuật ngữ dùng cho sản xuất cồn. Sau đó,
các nhà vi sinh vật học ứng dụng các nguyên tắc trên để tách chiết các
vitamin, các acid hữu cơ và các kháng sinh… Kết quả dẫn đế
n sự phát triển
nhanh chóng các phương pháp và các hệ thống lên men khác nhau.
Các nguyên lý tương tự sau đó được ứng dụng cho nuôi cấy sinh khối
tế bào động vật và thực vật. Tuy nhiên, nuôi cấy các tế bào động vật và thực
vật khó khăn hơn nhiều so với vi sinh vật, cái chính là do quá trình trao đổi
chất trong các loại tế bào này diễn ra chậm, điều này cũng phản ánh tốc độ
sinh trưởng chậm của tế bào. Các tế bào động v
ật có nhu cầu dinh dưỡng

, HEK-293
7
và tế bào võng mạc của người.

1. Hệ thống sản xuất
Phát triển một quá trình sản xuất công nghiệp cho protein tái tổ hợp
của tế bào động vật có vú thường dựa theo hệ thống được trình bày ở hình
6.2. Đầu tiên, gen quan tâm được tái tổ hợp với các nhân tố điều hòa phiên
mã (promoter) cần thiết trong plasmid vector để chuyển vào tế bào. Đồng
thời, gen thứ hai (gen chọn lọc-selector, hay còn gọi là gen chỉ thị chọ
n lọc-
selectable marker) cũng được chuyển cho tế bào nhận để phân biệt tế bào
được biến nạp và không biến nạp. Sự hiện diện của tác nhân chọn lọc trên
môi trường nuôi cấy sau khi chuyển gen một vài ngày đã cho phép phân lập
các tế bào tái tổ hợp sống sót. Các gen chỉ thị chọn lọc được dùng phổ biến
nhất là dihydrofolate reductase (DHFR), một enzyme tham gia trong quá
trình chuyển hóa nucleotide, và glutamine synthetase (GS). Trong cả hai
trường hợp, sự chọn lọc xảy ra khi thiếu chất chuyển hóa thích hợp trong
môi trường (hypoxantine và thymidine, trong trường hợp của DHFR hoặc
glutamine trong trường hợp GS), do đó đã ngăn cản sự sinh trưởng của các
tế bào không biến nạp.
Sau khi chọn lọc, các tế bào sống sót (xem như là các tế bào đơn)
được chuyển vào bình nuôi cấy thứ hai, và quá trình nuôi cấy được phát
triển để sản xuất các quần thể vô tính (clonal populations). Cuối cùng, các
dòng riêng biệt được đánh giá khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp để chọn
ra dòng có khả năng sản xuất cao nhất. Từ những dòng này, một dòng tế bào
có tốc độ sinh trưởng thích hợp và các sản lượng cao được sử dụng để sản
xuất protein tái tổ hợp. Quá trình nuôi cấy sau đó sẽ được thiết lập và tối ưu
hóa cho sản xuất.


Tạo thành
mạch thẳng
Công nghệ tế bào
85