1
NGHIÊN CỨU HIỆU ỨNG KÍCH KHÁNG BỆNH CỦA CHITOSAN CẮT
MẠCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỨC XẠ ĐỐI VỚI CÁ RÔ PHI

NGUYỄN NGỌC DUY
1
, ĐẶNG VĂN PHÚ
1
, NGUYỄN QUỐC HIẾN
1
, LÊ THỊ BÌNH
21
Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ, Viện NLNT Việt Nam
202A, đường 11, Phường Linh xuân, Quận Thủ đức, Tp. HCM
2
Bộ môn Sinh Học Thủy Sản, Trường Đại học Nông Lâm,
Khu phố 6, Phường Linh trung, Quận Thủ đức Tp. HCM
Email:

Tóm tắt: Chitosan KLPT thấp và oligochitosan được chế tạo bằng phương pháp cắt mạch
bức xạ chitosan dạng bột và dung dịch chitosan 3%. Kết quả đo KLPT bằng phương pháp
sắc ký gen cho thấy khối lượng phân tử giảm khi tăng liều xạ. Đối với chitosan chiếu xạ
dạng bột KLPT giảm từ 120.000 Da xuống 40.000 Da khi tăng liều xạ từ 0 kGy đến 50
kGy. Đối với chitosan dạng dung dịch KLPT giảm xuống còn 6100 Da tại liều xạ 20 kGy.
Chitosan KLPT thấp và oligochitosan được bồ sung vào thức ăn cho cá rô phi trong vòng
45 ngày ở nồng độ 100 ppm rồi sau đó gây nhiễm bằng vi khuẩn Strep. Agalactidae để
khảo sát hiệu ứng kích kháng bệnh. Kết quả cho thấy oligochitosan có hiệu ứng kích

chất điều hòa sinh trưởng [2,3] Ngoài ra chitosan còn được ứng dụng trong những lĩnh vực
khác như hấp thụ kim loại, xử lý nước thải [2]
Trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản việc sử dụng chitosan và oligochitosan như một tác
nhân phòng và trị bệnh cho vật nuôi đã được quan tâm nghiên và áp dụng ở nhiều nước trên
thế giới có nghành nuôi trồng thủy sản phát triển như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Nhật
Bản, Na Uy… Kết quả nghiên cứu của A. Gopalakannan và cộng sự [1] cho thấy, khi bổ sung
chitosan, chitin và levamisole vào thức ăn cho cá chép trong 45 ngày thì tỷ lệ sống sót của cá
sau khi được gây nhiễm cao hơn đáng kể so với mẫu cá đối chứng. Tỷ lệ sống sót cao nhất ở
mẫu cá được bổ sung chitosan lên tới 80%, sau đó là levamisole 66,7% và chitin là 40%.
Nhiều kết quả nghiên cứu khác cũng chứng minh chitosan và oligochitosan không chỉ có tác
dụng trị bệnh mà còn có tác dụng làm tăng cường sức đề kháng từ đó tăng cường hệ miễn dịch
của vật nuôi [3, 4, 5, 6, 7].
II. THỰC NGHIỆM
1. Nguyên vật liệu hóa chất:
Chitosan được mua từ Vũng Tàu có khối lượng phân tử Mw = 120.000 Da. Cá rô phi
được mua từ trại cá giống Tân Vạn, Bình Dương. Chủng vi khuẩn Streptococus agalactidae
được phân lập từ cá bệnh tại Đồng Tháp, được định danh và bảo quản tại Phòng Thí Nghiệm
Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Môi trường tăng sinh vi khuẩn: Nutrien Broth (NB), Ấn Độ. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn:
Nutrien Agar (NA). Ấn Độ. Hóa chất nhuộm Gram: Crystal violet, Fuchsin, Lugol, dung dịch
tẩy màu
2. Phương pháp
Chế tạo chitosan KLPT thấp: Chế tạo chitosan KLPT thấp: chitosan dạng bột được
đóng gói trong túi PE  chiếu xạ tại các liều, 10, 20, 30, 50 kGy.
Chế tạo dung dịch oligochitosan: Chitosan được hòa tan trong axit lactic 1,5% để được
nồng độ 3% sau đó được cho vào bình thủy tinh có nút vặn thêm H
2
O
2
ở những nồng độ khác

kính hiển vi.
Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: Vi khuẩn từ ống giữ giống được cấy ria
trên các đĩa môi trường thạch NA, ủ ở 30
o
C trong 24 giờ. Chọn khuẩn lạc đặc trưng, đứng
riêng lẻ, mọc trên đường cấy. Định danh vi khuẩn bằng test kit Api 20 Strep, đồng thời cấy
chuyền sang đĩa NA khác, ủ 30
o
C trong 24 giờ. Nếu kết quả định danh là vi khuẩn Strep.
agalactidae, chọn trên đĩa NA (đã ủ ở 30
o
C trong 24 giờ) các khuẩn lạc đặc trưng, đứng riêng

3
lẻ và mọc trên đường cấy để pha huyền dịch vi khuẩn. Hòa các khuẩn lạc đã chọn ở mỗi
chủng vào ống nghiệm có nước muối sinh lý vô trùng, đo OD của huyền dịch và sử dụng
huyền dịch này để ngâm cho cá.
Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm: Gây nhiễm bằng phương pháp ngâm, thời gian
ngâm cá trong 60 phút. Thể tích nước ngâm cá là 5 lít. Trong quá trình gây nhiễm có sử dụng
hệ thống sục khí.
Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn: Sau khi đo huyền dịch vi khuẩn, tiến hành pha
loãng huyền dịch với độ pha loãng từ 10
-1
đến 10
-8
. Từ mỗi độ pha loãng hút 0,1 ml dung dịch
nhỏ lên đĩa thạch NA (mỗi độ pha loãng lặp lại 2 lần), dùng que cấy trang, trang đều dung
dịch trên thạch, để khô tự nhiên và đem ủ ở 30
o
C trong 24 giờ. Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa

Từ kết quả hình 1 thấy rằng chitosan KLPT thấp có thể dễ dàng chế tạo thông qua chiếu
xạ chitosan KLPT cao dạng bột hoặc là dạng vảy. KLPT của chitosan giảm từ 120.699 Da
xuống còn 40.747 Da khi tăng liều xạ từ 0-50 kGy.
Bảng 1: Mw, Mn và chỉ số đa phân tán (PI = M
w
/M
n
) của chitosan KLPT thấp
Liều xạ (kGy)

0 10 20 30 50
Mw 120.669 112.050 85.853 63.548 40.747
Mn 56.377 54.598 44.027 36.732 25.153
PI 2,14 2,05 1,95 1,73 1,62
Kết quả PI ở bảng 1 nhận thấy rằng khi tăng liều xạ PI giảm từ 2,14 xuống giá trị 1,62
tại liều 50 kGy. Kết quả này chỉ ra rằng KLPT M
w
của chitosan càng nhỏ thì độ phân tán của
chitosan càng hẹp. Kết quả này cũng khá phù hợp với công trình của Czechowska-Biskup [8]
từ đó có thể kết luận khoảng liều xạ thích hợp để chế tạo chitosan KLPT thấp là 30 kGy đến
50 kGy với chitosan có KLPT ban đầu khoảng 120.000 Da.

Hình 2. Phổ IR của chitosan ban đầu có Mw = 120.669 (a);
chitosan-20kGy có M
w
= 63.548 (b); và chitosan-50kGy có M
w
= 40.747(c)
Li
ều xạ (kGy)

/tia  (suất liều: 1,14 kGy/h)
Bảng 3 trình bày kết quả về hiệu ứng đồng vận cắt mạch chitosan trong dung dịch bằng tia γ
và H
2
O
2
[9]. Kết quả cho thấy hiệu ứng đồng vận đạt hiệu quả cao trong khoảng liều xạ thấp. Cụ
thể suy giảm KLPT là 58,4; 34,5; 13,0 và 0,2% tương ứng với liều xạ 4; 8; 12 và 16 kGy.
Bảng 3. Suy giảm KLPT khi cắt mạch chitosan bằng hydroperoxit, tia γ và hiệu ứng
đồng vận hydroperoxit và tia γ
Ký hiệu Suy giảm KLPT, % = 100 × (M
w0
– M
w
)/M
w0

4 kGy (3 giờ)

8 kGy (6 giờ)

12 kGy (9 giờ)

16 kGy (12 gi
ờ)
A (1% H
2
O
2
) *

** Thời gian (giờ) và/hoặc là liều xạ (kGy) xử lý với bức xạ tia γ

6
Cơ chế cắt mạch chitosan đã được Ulanski & von Sonntag (2000) nghiên cứu khá chi
tiết [10]. Các tác giả đã chỉ ra rằng gốc hydroxyl tạo ra trong quá trình chiếu xạ dung dịch
chitosan là tác nhân chính gây ra sự cắt mạch chitosan (Hình 1.4).
O
C H
2
O H
O
O H
N H
3
5
O
C H
2
O H
O
O H
N H
3
6
O
C H
2
O H
O
O H

O
C H
2
O H
O
O H
N H
3
O H
H
2
O

Hình 4. Sơ đồ cơ chế bắt hydro của gốc tự do hydroxyl [12]
Từ kết quả hình 3 thấy rằng xử lý kết hợp H
2
O
2
và tia  đã làm gia tăng hiệu ứng cắt
mạch đối với chitosan và nồng độ H
2
O
2
càng cao thì mức độ suy giảm M
w
càng lớn tại cùng
thời gian chiếu xạ (liều xạ). Nguyên nhân là do sự tạo thành gốc hydroxyl (
.
OH) khi phân ly
bức xạ nước và H

OH (8)
Trong quá trình chiếu xạ e

aq
and H
.
Có thể phản ứng với H
2
O
2
như sau:
e

aq
+ H
2
O
2

.
OH + OH

(9)
H
.
+ H
2
O
2
 H

2
O
2
là rất hiệu quả để cắt mạch chitosan.
Phổ hồng ngoại (IR) của chitosan và oligochitosan từ dung dịch 3% chitosan chứa 0,25-
1% H
2
O
2
chiếu xạ 8 kGy được biểu thị trên hình 5.
Hình 5. Phổ IR của chitosan ban đầu (a) và oligochitosans
với M
w
: 9.700 (b); 8.300 (c) và 5.400 (d)
tia
γtia
γAbs7
Kết quả về DD được đưa ra trong hình 5 Phổ IR của các mẫu oligochitosan có hầu hết

2
O
2
khác nhau chiếu xạ liều 8 kGy
Mẫu Chitosan Oligochitosan
0,25% H
2
O
2

0,5% H
2
O
2

1,0% H
2
O
2

DD,%

84,4  1,2

77,5  2,8 76,4  1,9 74,4  2,2
2. Kết quả khảo sát hiệu ứng kháng bệnh của cá rô phi.
2.1. Kết quả kiểm tra cá trước khi gây nhiễm
Kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên cá trước khi thí nghiệm cho thấy cá không bị nhiễm
ký sinh trùng. Kết quả kiểm tra vi khuẩn trên môi trường BHIA thì không có khuẩn lạc nào
xuất hiện trên đĩa cấy phân lập vi khuẩn ở gan, thận, lách của cá trước khi thí nghiệm. Như


Hình 7: Mẫu nhuộm Gram vi khuẩn phân lập từ cá chết
2.5. Kết quả hiệu ứng kháng bệnh của chitosan KLPT thấp và oligochitoan
Sau 21 ngày gây bệnh thực nghiệm, tỉ lệ cá chết ở các nghiệm thức được ghi nhận lại:
Nghiệm thức ĐC 1 (đối chứng-không bổ sung Chitosan-không ngâm vi khuẩn) cá chết với tỷ
lệ chết trung bình là 10%. Mẫu cấy phân lập cá chết không thấy có sự hiện diện của vi khuẩn
gây nhiễm thực nghiệm. Như vậy, cá chết ở nghiệm thức này có thể do sức khỏe cá yếu.
Bảng 5. Tỷ lệ chết của cá rô phi sau 21 ngày gây nhiễm với vi khuẩn S. Agalactidae
của các nghiệm thức
Nghiệm thức ĐC1 ĐC2 NT1 NT2
Tỷ lệ chết (%)

10,00 ± 5,00
a

53,33 ± 10,41
cd

36,67 ± 10,41
bc

26,67 ± 2,89
ab

Ghi chú: Giá trị trung bình ± SD
Giá trị cùng hàng giống nhau ký tự thì khác nhau không ý nghĩa thống kê (P<0,05)
ĐC 1: (không bổ sung chitosan) ngâm bằng nước muối sinh lý vô trùng
ĐC2: (không bổ sung chitosan) ngâm vi khuẩn S. agalactidae
NT1: (bổ sung 100 ppm chitosan KLPT thấp) ngâm vi khuẩn S. agalactidae
NT2: (bổ sung 100 ppm oligochitosan) ngâm vi khuẩn S. agalactidae


56,67 ± 10,41
d

56,67 ± 10,41
d

23,33 ± 2,89
ab

25,00 ± 10,00
ab

Ghi chú:
Giá trị trung bình ± SD
Giá trị cùng hàng giống nhau ký tự thì khác nhau không ý nghĩa thống kê (P<0,05)
Trong đó:
ĐC 1 (không bổ sung chitosan) ngâm bằng nước muối sinh lý vô trùng
ĐC 2 (không bổ sung chitosan) ngâm vi khuẩn Strep. agalactidae
NT 1 ( bổ sung 50 ppm oligochitosan) ngâm vi khuẩn Strep. agalactidae
NT2 (bổ sung 100 ppm oligochitosan) ngâm vi khuẩn Strep. agalactidae
NT3 (bổ sung 150 ppm oligochitosan) ngâm vi khuẩn Strep. agalactidae
Bảng kết quả về tỷ lệ chết của cá khi được ăn thức ăn có bổ sung oligochitosan ở các
nồng độ khác nhau cho thấy tỉ lệ cá chết giảm từ 38,33% ± 2,89 xuống 23,33 ± 2,89 khi tăng
nồng độ oligochitsan từ 50 lên 100 ppm, tuy nhiên khi tăng nồng độ oligochitosan lên 150
ppm thì tỉ lệ cá chết thay đổi không đáng kể. Từ đó có thể kết luận nồng độ tối ưu để sử dụng
oligochitosan như là chất kích kháng bệnh là 100 ppm ở các nồng độ thấp hơn (50 ppm) hoặc
cao hơn (150 ppm) thì hiệu quả kích kháng bệnh đều thấp hơn.
IV. KẾT LUẬN
Chitosan KLPT thấp và oligochitosan đã được chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ

in white shrimp litopenaeus vannamei, Fish & Shellfish Immunology, 19, pp.191–204 (2005).
[6] S.H. Cha et al., Effect of chitosan – coated diet on improving water quality and innate immunity
in olive flounder, Paralichthys olivaceus, Aquaculture, 278, pp.110–118 (2008).
[7] Y. Okamoto et al., Effect of chitin/chitosan and their oligomers/monomers on migration of
fibroblasts and vascular endothelium, Biomaterials, 23, pp.1975–1979 (2002).
[8] Czechowska-Biskup, R et al., Radiation-induce and sonochemical degradation of chitosan as a
way to increase its fat-binding capacity. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B 236, pp.383-390, 2005.
[9] Hien, N.Q et al., Degradation of chitosan in solution by gamma irradiation in the presence of
hydrogen peroxide. Carbohydr. Polym. 87, pp.935-938, 2012.
[10] Ulanski, P et al., OH-radical-induced chain scission of chitosan in the absence and presence of
dioxygen. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, pp.2022-2028, 2000.
[11] Makuuchi, K et al., Critical review of radiation processing of hydrogel and polysaccharide.
Radiat. Phys. Chem. 79, pp.267-271, 2010.

STUDY ON EFFECT OF IMMUNE RESPONSE OF GAMMA-RAY
IRRADIATED CHITOSAN ON TILAPIA

Abstract: Low molecular weight chitosan (LMWC) powder and oligochitosan solution
were prepared by -irradiation method. The efficiency of the degradation process was
demonstrated by gel permeation chromatography (GPC) analysis of the average
molecular weight of degraded chitosan. Results showed that the molecular weights
decreased with increasing doses. For LMWC molecular weight reduces from 120,000 Da
to 40,000 Da when dose raises from 0 kGy to 50 kGy and oligochitosan reduces to 6100
Da at 20k Gy. Tilapia fish, which was fed with LMWC and oligochitosan 100ppm for 45
days, was challenged with Strep. Agalactidae bacteria to investigate immune response.
The results also exhibited that oligochitosan has effect of immune response higher than
LMWC. The effect of various concentrations (50 ppm, 100 ppm, 150 ppm) was
investigated. Results showed that oligochitosan 100 ppm shows survival rate the highgest.
Keywords: Low molecular weight chitosan, oligochitosan, immune response, gamma
irradiation.